Denne protokol beskriver en in vivo-analyse af fagocytose, der anvendes til at vurdere og kvantificere unges og alderen drosophila melanogastereøges evne til fagocytosebakterier..
Fagocytose er en væsentlig funktion af det medfødte immunrespons. Denne proces udføres af fagocytiske hæmocytter, hvis primære funktion er at genkende en bred vifte af partikler og ødelægge mikrobielle patogener. Som organismer alder, denne proces begynder at falde, men lidt er kendt om de underliggende mekanismer eller det genetiske grundlag for immunosenescence. Her, en injektion baseret in vivo fagocytose assay bruges til at vurdere aldersrelaterede ændringer i forskellige aspekter af fagocytose, såsom bindende, opslugelse, og nedbrydning af internaliserede partikler, ved at kvantificere fagocytiske hændelser i hæmocytter hos voksne Drosophila. Drosophila melanogaster er blevet en ideel model til at undersøge aldersrelaterede ændringer i medfødte immunfunktion af mange årsager. For én, mange genetiske komponenter og funktioner i den medfødte immunrespons, herunder fagocytose, er evolutionært bevaret mellem Drosophila og pattedyr. Derfor vil resultater opnået ved anvendelse af denne protokol sandsynligvis være bredt relevante for forståelsen af de aldersrelaterede ændringer i immunforsvaret i en række organismer. Derudover bemærker vi, at denne metode giver kvantitative skøn over hemocyt fagocytiske evne, som kunne være nyttige for en række forskningsemner, og behøver ikke at være begrænset til undersøgelser af aldring.
Det medfødte immunsystem, som består af fysiske og kemiske barrierer for infektion samt cellulære komponenter, er evolutionær bevaret på tværs af flercellede organismer1,2. Som den første forsvarslinje spiller det medfødte immunsystem en afgørende rolle i bekæmpelsen af at invadere patogener hos alle dyr1,2,3. Komponenterne i det medfødte immunrespons omfatter en lang række celletyper , som klassificeres ud fra , at de mangler specificitet og immunologisk hukommelse2,3,4. Hos mennesker omfatter disse celletyper fagocytiske monocytter og makrofager, neutrofiler og cytotoksiske naturlige dræberceller4,5. Mens der har et funktionelt immunsystem er bydende nødvendigt for vært overlevelse, er det klart, at funktionen af immunceller falder med alderen, et fænomen kendt som immunosenescence5,6. At være i stand til at vurdere aldersrelaterede ændringer i immunresponset, herunder forskellige aspekter af processen med fagocytose, kunne støtte i vores forståelse af immunosenescence. Den procedure, vi beskriver her giver en effektiv og repeterbar tilgang til at evaluere og kvantificere fagocytiske hændelser af hæmocytter i Drosophila melanogaster.
Drosophila er en ideel model til at studere immunrespons af mange grunde. For det første er der et omfattende sæt af genetiske værktøjer til rådighed, der gør det muligt nemt at manipulere genekspression i en vævsafhængig måde7. Disse værktøjer omfatter en samling af mutanter, RNA interferens bestande, GAL4/UAS bestande, og Drosophila Genetic Reference Panel, der indeholder 205 forskellige indavlede linjer, som hele genom sekvenser er katalogiseret8. Den korte livscyklus Drosophila og det store antal producerede personer giver forskerne mulighed for at teste flere personer i et kontrolleret miljø, i en kort periode. Dette forbedrer i høj grad evnen til at identificere subtile forskelle i immunrespons på infektion blandt genotyper, mellem kønnene eller på tværs af aldre. Vigtigere er det, mange genetiske komponenter og funktioner i den medfødte immunrespons, herunder fagocytose, er evolutionært bevaret mellem Drosophila og pattedyr1,2.
I Drosophila udføres den proces med fagocytose, der følger efter infektionen, af fagocæntiske hæmocytter kaldet plasmatocytter, som svarer til pattedyrsmakrofager9. Hæmocytter er afgørende for at genkende en lang række partikler og rense mikrobielle patogener9,10,11,12,13. Disse celler udtrykker en række receptorer, der skal differentiere sig fra ikke-selv, og indlede signalering begivenheder er nødvendige for at udføre den fagocytiske proces10,11,,12,13,14,15. Når en partikel er bundet, det begynder at blive internaliseret ved reorganisering af actin cytoskeleton og remodeling af plasmamembranen til at udvide omkring partiklen, danner en fagocytisk kop11,,12,,13,14. Under denne proces, et andet sæt af signaler fortæller cellen at internalisere partiklen yderligere ved at lukke den fagocytiske kop, danner en membran-bundet phagosome11,,12,,13,14,15. Den fagolige derefter gennemgår en modning proces, der forbinder med forskellige proteiner og sammensmeltning med lysosomer, danner en sur phagolysosome11,,12,,13,,14,15. På dette tidspunkt kan partikler effektivt nedbrydes og elimineres11,12,13,14,15. Drosophila undersøgelser har vist, at ældre fluer (4 uger) har en nedsat evne til at klare en infektion i forhold til yngre fluer (1 uge gamle), sandsynligvis på grund af, i det mindste delvis, til et fald i nogle aspekter af fagocytose16,17.
Den metode, der er beskrevet her, anvender to separate fluorescerende mærkede varme-dræbte E. coli partikler, en forsynet med en standard fluorophore og en, der er pH-følsomme, at vurdere to forskellige aspekter af fagocytose: den oprindelige opslugelse af partikler, og nedbrydningen af partikler i phagolysosome. I denne analyse kan fluoro-partikelfluorescens observeres, når partiklerne er bundet og opslugt af hæmocytter, mens pH-følsomme partikler fluorescerer kun under de lave pH-forhold i det phagosome. Fluorescerende begivenheder kan derefter observeres i hæmocytter, der lokaliserer langs dorsale fartøj. Vi fokuserer på hæmocytter lokaliseret til dorsale fartøj, som giver en anatomisk vartegn for at finde hæmocytter, der er kendt for at bidrage til bakteriel clearance, og til konsekvent at isolere dem. Men, hemocytter i andre dele af kroppen og hæmolymfe er også vigtige for clearance. Selv om vi ikke har studeret denne cellepopulation, vores generelle procedure kunne være gældende for fagocytiske analyser af disse celler samt. En fordel ved vores tilgang er, at vi kan kvantificere fagocytiske hændelser inden for individuelle hæmocytter, så vi kan opdage subtile variation i fagocytiske processer. Andre undersøgelser, der visualiserer fluorescerende begivenheder gennem neglebånd18,19 ikke tegner sig for forskelle i antallet af hæmocytter til stede, hvilket er særligt vigtigt at overveje i vores tilfælde som samlede hemocyt tæller forventes at ændre sig med17år .
Den protokol, der er beskrevet her, er en pålidelig måde at kvantificere forskellige aspekter af fagocytose under kontrollerede eksperimentelle forhold. Vi bemærker, at vi kun har testet denne procedure med gram negative bakterielle partikler og resultaterne kan variere, hvis gram positive bakterielle partikler anvendes. Faktisk ville det være interessant at sammenligne de fagocytiske reaktioner på både gram negative og gram positive bakterier i forskellige eksperimentelle forhold. Brugen af en nanoinjektor giver mulighed for præcis kontrol over injektionsmængderne, hvilket sikrer, at hver flue injiceres med den samme mængde partikler. En begrænsning af protokollen kommer fra uoverensstemmelser i partikelpræparater. Partikler vil samle når frosset, så små variationer i fortynding mængder, eller mangel på vortexing, kan påvirke partikelkoncentrationen mellem eksperimenter. For at minimere mulige variationer i partikelkoncentrationer mellem aldre er det gavnligt at injicere 1- og 5 uger gamle fluer samme dag ved hjælp af den samme nål- og partikelopløsning. En anden potentiel ulempe er, at under dissektioner, dorsale fartøj og / eller neglebånd kan nemt blive beskadiget, hvis stifter ikke håndteres korrekt. For at undgå at forstyrre dorsale beholderen, minimere antallet af stifter, der anvendes pr dissektion. Fordelen ved denne dissektion metode er, at alle fiksering, vask og farvning trin kan udføres i dissektion plade. Fordi neglebånd er fastgjort ned, dette forhindrer neglebånd fra at blive tabt mellem trin.
Sammenlignet med eksisterende metoder18,19,25,26,27,28,29, den beskrevne protokol har sine fordele og begrænsninger. Ved at dissekere dorsale fartøj, er vi i stand til at visualisere og kvantificere individuelle hemocytter på dette sted. Dette gør det muligt at opdage subtile variationer i fagocytisk aktivitet mellem eksperimentelle grupper. Andre metoder visualisere fluorescerende mærkede partikler ved at indsamle hæmocytter ved hjælp af en Bleed /Scrape-analyse19,25,26,27eller gennem en intakt ventral neglebånd18,19,28,29; De enkelte hæmocytter kan dog ikke vurderes, når de visualiseres gennem dorsale neglebånd. Fordelen ved denne protokol, sammenlignet med Bleed / Scrape metode er, at vores metode giver os mulighed for at vurdere kun de hemocytter forbundet med dorsale fartøj, og gør tegner sig for cirkulerende celler eller dem langs kroppen væggen, som kan være funktionelt anderledes. Dissekere dorsale fartøjet fjerner også behovet for at medtage en anden runde af injektioner med en fluorescens quencher, ligesom Trypan blå19,26. Dette skyldes, at partikler, der ikke er bundet til eller opslugt af en celle, vil blive vasket væk under vasketrin. Omvendt kan alternative metoder være lettere at udføre, fordi de ikke kræver dissektioner. Mens dissekere dorsale fartøjet er let at lære, dette trin tilføjer et niveau af kompleksitet, som måske ikke er muligt i nogle eksperimentelle design.
Selv om den beskrevne brug af denne in vivo fagocytose assay er at vurdere og kvantificere fagocytiske hændelser i forskellige aldre, denne protokol er meget fleksibel og kan bruges til at analysere forskellige aspekter af fagocytose mellem genotype, køn, eller vævstype. Med fagocytose er af central betydning for de fleste flercellede dyr, forståelse af, hvordan denne proces falder med alderen kan føre til bedre terapeutiske behandlinger for den aldrende befolkning. Denne tilgang giver langsigtede potentiale for at belyse aspekter af aldersrelaterede ændringer i immunrespons, med særlig fokus på fagocytose.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health R03 AG061484-02 og UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
35×10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
Glass slides | Premiere | D17026102 | |
Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55℃ Solenoid: 45 |
Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |