Summary
Questo protocollo descrive un saggio in vivo di fagocitosi usato per valutare e quantificare la capacità degli emociti di Drosophila melanogaster giovani e invecchiati di batteri fagocitosi.
Abstract
La fagocitosi è una funzione essenziale della risposta immunitaria innata. Questo processo viene eseguito da emociti fagociti la cui funzione primaria è quella di riconoscere una vasta gamma di particelle e distruggere gli agenti patogeni microbici. Con l'invecchiamento degli organismi, questo processo inizia a declinare, ma si sa poco sui meccanismi sottostanti o sulla base genetica dell'immunosenescenza. Qui, un'iniezione a base di analisi della fagocitosi in vivo viene utilizzata per valutare i cambiamenti legati all'età in diversi aspetti della fagocitosi, come il legame, l'inghiottimento e la degradazione delle particelle interiorizzate, quantificando gli eventi fagocitici negli emociti nella dott.ssa Drosophila. Drosophila Per prima cosa, molti componenti genetici e funzioni della risposta immunitaria innata, tra cui la fagocitosi, sono conservate evolutivamente tra la Drosophila e i mammiferi. Per questo motivo, i risultati ottenuti dall'utilizzo di questo protocollo sono probabilmente ampiamente rilevanti per comprendere i cambiamenti legati all'età nella funzione immunitaria in una varietà di organismi. Inoltre, notiamo che questo metodo fornisce stime quantitative della capacità fagocitica emocite, che potrebbe essere utile per una varietà di argomenti di ricerca e non deve essere limitato agli studi di invecchiamento.
Introduction
Il sistema immunitario innato, che consiste in barriere fisiche e chimiche alle infezioni e componenti cellulari, è evoluzionario conservato tra gli organismi multicellulari1,2. Come prima linea di difesa, il sistema immunitario innato svolge un ruolo fondamentale nella lotta contro gli agenti patogeni invasori in tutti gli animali1,2,3. I componenti della risposta immunitaria innata includono una vasta gamma di tipi di cellule che sono classificati sulla base del fatto che mancano di specificità e memoria immunologica2,3,4. Nell'uomo, questi tipi di cellule includono monociti fagociti ciofetici e macrofagi, neutrofili e cellule killer naturali citotossiche4,5. Pur avendo un sistema immunitario funzionale è imperativo per la sopravvivenza dell'ospite, è chiaro che la funzione delle cellule immunitarie diminuisce con l'età, un fenomeno noto come immunosenescenza5,6. Essere in grado di valutare i cambiamenti legati all'età nella risposta immunitaria, compresi i diversi aspetti del processo di fagocitosi, potrebbe aiutare nella nostra comprensione dell'immunosenescenza. La procedura che descriviamo qui fornisce un approccio efficace e ripetibile per valutare e quantificare gli eventi fagocitici da emociti in Drosophila melanogaster.
La drosophila è un modello ideale per studiare la risposta immunitaria per molte ragioni. Per uno, c'è una vasta serie di strumenti genetici disponibili che consentono di manipolare facilmente l'espressione genica in modo dipendente dai tessuti7. Questi strumenti includono una raccolta di mutanti, stock di interferenze di RNA, stock di GAL4/UAS e il pannello di riferimento genetico di Drosophila che contiene 205 diverse linee inbred per le quali le sequenze di genoma sono catalogate8. Il breve ciclo di vita della Drosophila e il gran numero di individui prodotti consentono ai ricercatori di testare più individui in un ambiente controllato, in un breve periodo di tempo. Questo migliora notevolmente la capacità di identificare sottili differenze nelle risposte immunitarie all'infezione tra genotipi, tra i sessi o tra le età. È importante sottolineare che molti componenti genetici e funzioni della risposta immunitaria innata, tra cui la fagocitosi, sono evolutivamente conservati tra la Drosophila e i mammiferi1,2.
Nella Drosophila, il processo di fagocitosi che segue l'infezione è effettuato da emociti fagociti chiamati plasmatociti, che sono equivalenti ai macrofagi dei mammiferi9. Gli emociti sono essenziali per riconoscere una vasta gamma di particelle e cancellare i patogeni microbici9,10,11,12,13. Queste cellule esprimono una varietà di recettori che devono differenziarsi da se stessi e avviare eventi di segnalazione necessari per eseguire il processo fagocitico10,11,12,13,14,15. Una volta che una particella è legata, inizia ad essere interiorizzata dalla riorganizzazione del citoscheletro actina e dal rimodellamento della membrana plasmatica per espandersi intorno alla particella, formando una coppa fagocitica11,12,13,14. Durante questo processo, un altro insieme di segnali dice alla cellula di internalizzare ulteriormente la particella chiudendo la coppa fagocitica, formando un fagosoma legato alla membrana11,12,13,14,15. Il fagosoma segue quindi un processo di maturazione, associandosi a diverse proteine e fondendosi con lisosomi, formando un fagolisosoma acido11,12,13,14,15. A questo punto, le particelle possono essere efficacemente degradate ed eliminate11,12,13,14,15. Studi sulla Drosophila hanno rivelato che le mosche più anziane (4 settimane di età) hanno una ridotta capacità di eliminare un'infezione rispetto alle mosche più giovani (1 settimana di età), probabilmente a causa, almeno in parte, di un declino in alcuni aspetti della fagocitosi16,17.
Il metodo qui descritto utilizza due particelle separate di E. coli, etichettate a calore, una con un fluoroforo standard e una sensibile al pH, per valutare due diversi aspetti della fagocitosi: l'inghiottimento iniziale delle particelle e la degradazione delle particelle nel fagolofosoma. In questo saggio, la fluorescenza fluoro-particella è osservabile quando le particelle sono legate e inghiottite da emociti, mentre le particelle sensibili al pH fluorescenza solo nelle condizioni di basso pH del fagosoma. Gli eventi fluorescenti possono quindi essere osservati negli emociti che si localizzano lungo la nave dorsale. Ci concentriamo sugli emociti localizzati nel vaso dorsale, che forniscono un punto di riferimento anatomico per individuare gli emociti che sono noti per contribuire alla distanza batterica e per isolarli costantemente. Tuttavia, gli emociti in altre parti del corpo e l'emolinfa sono anche importanti per la clearance. Anche se non abbiamo studiato questa popolazione cellulare, la nostra procedura generale potrebbe essere applicabile anche per i saggi fagocitici di queste cellule. Un vantaggio del nostro approccio è che possiamo quantificare gli eventi fagocitici all'interno di singoli emociti, permettendoci di rilevare sottili variazioni nei processi fagocitici. Altri studi che visualizzano eventi fluorescenti attraverso la cuticola18,19 non tengono conto delle differenze nel numero di emociti presenti, il che è particolarmente importante da considerare nel nostro caso in quanto si prevede che i conteggi totali degli emociti cambino all'etàdi 17anni.
Protocol
1. Raccogliere e l'età di Drosophila
- Per generare gli stessi moscerini F1 invecchiati per testare la fagocitosi, aggiungere 5-10 femmine vergini e 5 maschi dei genotipi appropriati a una fiala contenente cibo fresco a mosca. Usiamo un alimento a base di melassa di farina di mais20, ma il metodo dovrebbe funzionare indipendentemente dal tipo di dieta su cui vengono allevate le mosche. Per questo esperimento abbiamo usato Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP vola per etichettare gli emociti geneticamente.
NOTA: È possibile utilizzare più mosche, ma alcune linee di D. melanogaster potrebbero non accoppiarsi o riprodursi bene quando sovraffollato, e il sovraffollamento può avere effetti negativi sullo sviluppo larvale21 e sulla fagocitosi. - Mantenere le mosche nelle condizioni sperimentali desiderate. Per questo esperimento, mantenere He-GAL4; UAS-GFP vola a 24 gradi centigradi. Consentire alle mosche adulte di accoppiarsi per una settimana, e quindi rimuovere gli adulti. Le mosche F1 saranno quindi raccolte da queste fiale dopo l'eclosione per uso sperimentale.
- Raccogli le mosche vergini per tutta la settimana, o fino a quando non vengono raccolti il numero desiderato di mosche. Le vergini non sono necessarie; tuttavia, l'accoppiamento può avere un impatto sulla risposta immunitaria. Se le mosche F1 devono essere testate come vergini, separare maschi e femmine entro 8 ore dall'eclosione e mantenersi in fiale separate per prevenire l'accoppiamento. Raccogliere un numero sufficiente di mosche per consentire la valutazione della fagocitosi in almeno 10 mosche per genotipo/trattamento/sesso per età.
- Se l'invecchiamento delle mosche vola a una settimana, raccogliere almeno 50 mosche in totale, o 20 mosche per condizione di trattamento per ogni particella, sia fluoro-particelle o particelle sensibili al pH, da iniemettere. Ciò garantirà un minimo di 10 mosche per il saggio al momento dell'esperimento.
- Se l'invecchiamento vola a più di 3 settimane, raccogliere almeno 100-150 mosche totali, o 50-75 mosche per condizione di trattamento per garantire che ci siano abbastanza mosche disponibili per misurare la fagocitosi. Quando l'invecchiamento vola in laboratorio, in genere utilizziamo gabbie di insetti mantenute a 24 gradi centigradi in 12:12 L:D condizioni, e cambiare il cibo a giorni alteranti. Se vengono utilizzate fiale al posto delle gabbie, le mosche in nuove fiale ogni 3-5 giorni, a seconda delle condizioni del cibo nella fiala. Il numero di mosche necessarie dipenderà da quanto in ritardo in età sarà la fagocitosi, e i tassi di sopravvivenza specifici per età di quel genotipo in una particolare condizione ambientale.
- Se si valutano le mosche giovani e invecchiate, pianificare di conseguenza in modo che le mosche di 1 settimana di età e di età vengano iniettate nello stesso giorno. Ciò ridurrà al minimo le variazioni nella concentrazione di particelle tra gli esperimenti e garantirà che l'effetto dell'età sulla misurazione fagocitica non sia confuso con l'effetto del giorno in cui è stato eseguito il saggio.
- Casa le mosche raccolte a 24 gradi centigradi fino a quando non hanno 5-7 giorni, o mantenere le mosche all'età desiderata.
2. Preparare particelle etichettate fluorescenti
- Ricostituire le particelle di E. coli fluoro-particelle o particelle e. coli sensibili al calore a una concentrazione di stock rispettivamente di 20 mg/mL o 1 mg/mL. Altri batteri sono disponibili per l'uso che possono essere più adatti per alcuni esperimenti, ma fare riferimento alle istruzioni del produttore per le concentrazioni di scorte appropriate.
- Per le particelle fluoro-particelle, aggiungere 990 luna di 1x PBS (pH 7,4) o buffer preferito e 10 L di 2 mM (20%) azide di sodio. Vortice da mescolare.
NOTA: l'azide di sodio è un conservante che può essere omesso; tuttavia, le particelle preparate senza azide di sodio non durano a lungo. Le particelle di fluoro devono essere utilizzate entro 24 ore e le particelle sensibili al pH devono essere utilizzate entro 7 giorni. - Per le particelle sensibili al pH, aggiungere 1.980 lun di 1x PBS (pH 7,4) o buffer preferito e 20 l uni-l di 2 mM (20%) azide di sodio. Vortice da mescolare.
- In tubi di microcentrifuga monouso sono stati in tubi a microcentrifuga da 1,5 mL. Conservare le particelle di fluoro a -20 gradi centigradi per un massimo di un anno, e le particelle sensibili al pH a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi, protette dalla luce.
- Per le particelle fluoro-particelle, aggiungere 990 luna di 1x PBS (pH 7,4) o buffer preferito e 10 L di 2 mM (20%) azide di sodio. Vortice da mescolare.
- Il giorno delle iniezioni, rimuovere l'azie di sodio dalle particelle prima dell'uso. Per fare questo, centrifugare le particelle per 5 min a 15.000 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere le particelle supernatali e lavate due volte rispendendo in 50 : L di 1x PBS o tampone preferito, e centrifugare per 5 min a 15.000 x g.
- Dopo il secondo lavaggio, rimuovere le particelle supernatali e resospendono in 100 gradi l di 1x PBS o buffer preferito. Mantenere la soluzione nel tubo e ridurre al minimo l'esposizione alla luce durante l'esperimento. Una volta rimossa l'acidipite di sodio, utilizzare particelle di fluoro entro 24 h e particelle sensibili al pH utilizzate entro 5-7 giorni.
NOTA: Nei nostri esperimenti precedenti, abbiamo scoperto che questa concentrazione di particelle forniva un numero numerabile di eventi fagocitici e che il numero di particelle disponibili per la fagocitosi da emociti non limitava17. Tuttavia, gli utenti di questo protocollo potrebbero voler confrontare i risultati utilizzando altre concentrazioni per garantire che vi sia un numero adeguato di particelle disponibili per la fagocitosi da parte degli emociti nelle condizioni dei loro esperimenti.- Se l'azide di sodio è stato omesso, diluire le particelle 1:5 nello stesso buffer con cui sono state preparate le particelle, per le iniezioni.
- Aggiungete una goccia di colorante verde per il cibo alle particelle. Questo rende più facile garantire che le mosche siano state iniettate.
3. Iniettare le mosche
- Preparare gli aghi di vetro per le iniezioni.
- Tirare gli aghi di vetro utilizzando un tiratore pipette. Impostare il riscaldatore estraente pipetta a 55 gradi centigradi e il solenoide a 45. Utilizzare solo gli aghi forniti con l'iniettore, in quanto non è garantito che altri aghi funzionino con la stessa precisione.
- Riempire una siringa sterile da 1 mL con olio minerale e attaccare l'ago ipodermico (G) da 30 calibro, fornito con il nanoiniere.
- Riempire l'ago capillare tirato inserendo l'ago da 30 G nell'estremità smussata dell'ago di vetro tirato e riempire con olio minerale. Rimuovere lentamente l'ago da 30 G, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria in tutto l'ago, in quanto ciò può causare volumi di iniezione imprecisi. L'iniettore non funziona correttamente senza riempire l'ago.
- Utilizzando pinze, rompere la punta dell'ago per creare un'apertura per consentire l'espulsione della soluzione.
- Assemblare il nano-iniettore.
NOTA: È possibile utilizzare altri iniettori. Il metodo descritto di seguito si applica al nano-iniettore. Per altri iniettori, consultare il manuale dell'utente per le istruzioni.- Impostare l'iniettore sul volume desiderato (tra 46 nL e 69 nL).
- Rimuovere il collet e posizionare l'anello O di sguarsione, lo spaziopinatore bianco con l'indentazione rivolta verso l'alto per ricevere la parte posteriore dell'ago e l'anello O più grande sullo stantuffo metallico, in questo ordine. Riattaccare il collet senza stringerlo.
- Inserire lo stantuffo metallico nell'estremità smussata dell'ago di vetro pieno di olio. Spingere delicatamente l'ago verso il basso, inserendolo nell'anello O più grande. Stringere la collet fino a quando non è sicura.
NOTA: Se lo stantuffo metallico non si estende oltre il collet, tenere premuto 'EMPTY' fino a quando lo stantuffo non è visibile. Questo rende più facile assicurarsi che lo stantuffo sia inserito nell'ago. - Tenere premuto "EMPTY" finché l'iniettore non emette un bip. Questo espelle la maggior parte dell'olio minerale dall'ago, lasciando un piccolo volume di olio per agire come una barriera tra i due liquidi, così come rimuove le bolle d'aria.
- Riempire l'ago con particelle di fluoro o particelle sensibili al pH inserendo la punta dell'ago di vetro nel tubo di microcentrifuga contenente le particelle preparate.
- Tenere premuto FILL finché l'iniettore non emette un bip.
- Iniezioni
- Trasferire le mosche che devono essere iniettate in una fiala vuota. Immobilizzare le mosche mettendo la fiala nel ghiaccio. CO2 può essere utilizzato anche per immobilizzare le mosche. Tuttavia, si noti che, quando si utilizzano particelle sensibili al pH, livelli elevati di CO2 possono acidificare artificialmente qualsiasi buffer utilizzato e possono elevare la fluorescenza di fondo.
- Iniettare le mosche nella piastra sternopeurale del torace (Figura 1A). L'iniezione ha esito positivo se si vede colorare verde andando in volo (Figura 1B). Se la mosca non diventa verde, assicurati che l'ago non sia ostruito.
NOTA: In alternativa, le mosche possono essere iniettate nell'addome, ma mantengono il sito di iniezione coerente in tutti gli esperimenti. - Mettere le mosche iniettate in una nuova fiala alimentare, notando il tempo in cui è stata iniettata la prima e l'ultima mosca. Per ridurre al minimo l'errore sperimentale a causa della quantità di tempo necessario per completare le iniezioni, completare le iniezioni in modo tempestivo. Con la pratica, non dovrebbe richiedere più di 10 min per iniettare un set di mosche. Posare la fiala su un fianco fino a quando tutte le mosche si sono riprese, per evitare che le mosche rimangano bloccate nel cibo.
- Lasciare che le mosche si riprendano per 60-90 min, a seconda delle condizioni sperimentali. Qui, è stato utilizzato un tempo di recupero di 60 min. Si noti che questo intervallo di tempo di recupero era ottimale per il conteggio degli eventi fagocitici nelle condizioni sperimentali nellostudioHorn et al. Tuttavia, in alcune condizioni, questo può essere troppo lungo per rilevare sottili differenze nella fagocitosi tra i gruppi di trattamento. Può essere utile effettuare esperimenti di percorso temporale come è stato fatto in precedenza17 per determinare il tempo di recupero che rivelerà le differenze massime tra controllo e risultati sperimentali. Qualunque sia il tempo di recupero scelto, mantieni questo coerente in tutti i trattamenti sperimentali.
- Se si iniettano particelle di fluoro e particelle sensibili al pH nello stesso giorno, utilizzare un nuovo ago per ogni soluzione. Non iniettare singole mosche con entrambe le particelle se entrambe fluorescenza rossa, poiché il risultato non distinguerebbe tra i due aspetti della fagocitosi, legamento/inghiottimento delle particelle e inclusione di particelle nel fagosoma.
4. Dissecting della nave dorsale
- Dopo che le mosche si sono riprese per 60-90 min, trasferite tutte le mosche viventi su una fiala vuota e immobilizzate sul ghiaccio.
- Trasferire una mosca alla volta su una piastra di dissezione di elastomeri in silicone.
NOTA: Preparare le piastre di dissezione almeno 1 settimana prima dell'uso, se si cura a temperatura ambiente. Per fare questo, preparare l'elastomer e versarlo in un piatto Petri da 33 mm x 10 mm, riempiendo il piatto circa a metà strada. Toccare delicatamente il piatto su una superficie piana per ridurre al minimo le bolle d'aria. Lasciate che le piastre si siedano a temperatura ambiente, indisturbate, per almeno una settimana.- Sotto un microscopio stereo dissezioso, orientare il lato ventrale di mosca verso l'alto.
- Utilizzando perni di insetti, pin la mosca sulla piastra inserendo un perno attraverso il torace e un altro perno attraverso l'estremità più posteriore dell'addome, vicino ai genitali (Figura 2A). Può essere utile tagliare i perni a metà prima di appuntare il campione in modo da non ostacolare la dissezione. Ripetere con un massimo di 10 mosche per piastra di dissezione.
NOTA: Facoltativo: rimuovere le ali e le gambe prima di bloccare volare alla piastra. Questo aiuterà a prevenire la formazione di una bolla intorno al volo quando vengono aggiunti i media. - Una volta che tutte le mosche sono state appuntate al piatto, aggiungete un numero sufficiente di supporti di dissezione per coprire le mosche (1 mL) utilizzando un tubo di trasferimento.
- Utilizzando pinze o forbici cuticola, rimuovere la testa.
- Utilizzando le forbici cuticola, fare due incisioni orizzontali: uno direttamente sopra il perno posteriore nell'addome, e un altro all'estremità più anteriore dell'addome, dove il torace e l'addome si incontrano (Figura 2B, C). Nella Figura 2, la testa è stata lasciata intatta per chiarire l'orientamento.
- Fare un'incisione verticale, collegando le due incisioni orizzontali (i tre tagli assomigliano alla lettera I). Questo aprirà la cavità addominale (Figura 2D).
- Utilizzando pinze, rimuovere gli organi interni e il tessuto, evitando il vaso dorsale. Se indisturbato, il recipiente dorsale trasparente può spesso essere visto pulsare vicino all'estremità anteriore dell'addome. Perni aggiuntivi possono essere utilizzati per fissare le estremità aperte della cuticola (Figura 2E, F).
- Utilizzando le forbici cuticola, rimuovere il torace. In alternativa, il torace può essere rimosso prima di montare le cuticle sezionate e la nave dorsale su un vetrino al microscopio.
- Ripetere con le mosche rimanenti. sezionare vola in modo tempestivo, per ridurre al minimo le possibili variazioni del tasso fagocitico. Una volta che tutte le mosche sono state sezionate, lasciare le cutiche con il vaso dorsale attaccato appuntato al piatto. Tutti i passaggi 5 saranno effettuati nella piastra di dissezione. Ciò impedirà di danneggiare o accidentalmente scartare le cutiche tra i passi.
5. Fissaggio e colorazione
- Fissare cuticoli sezionati con vaso dorsale attaccato in 4% paraformaldeide (PFA).
- Utilizzando un nuovo tubo di trasferimento usa e getta per ogni passo, scartare il supporto di dissezione e sostituirlo con 1 mL del 4% PFA. Durante la fissazione e la colorazione, mantenere le dissezioni protette dalla luce il più possibile.
- Incubare a temperatura ambiente per 15 min con dondolo a 20 rpm. Non permettere che le dissezioni si siedano fissativo per più di 20 min, in quanto ciò potrebbe iniziare a danneggiare il tessuto.
- Lavaggio cuticoles 2x in 1x PBS - 0.1% Tween (PBST).
- Rimuovere il fissativo e sostituirlo con 1 mL di 1x PBST.
- Lavare a temperatura ambiente per 15 min con dondolo.
- Ripetere 1x.
NOTA: Il tessuto fisso può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi, per un massimo di 3 giorni, protetto dalla luce, dopo il primo lavaggio sostituendo il lavaggio con PBST fresco. Non conservare il tessuto fisso se verranno utilizzati anticorpi. Gli anticorpi devono essere utilizzati con tessuti freschi per ottenere i migliori risultati.
- Facoltativo: colorazione anticorpale. Gli anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare chiaramente la nave dorsale in modo chiaro (Figura 3)o per rilevare marcatori specifici per emociti. Questo può garantire che solo le cellule lungo il recipiente dorsale siano conteggiate o per marcare la membrana degli emociti.
- Rimuovere il secondo lavaggio, aggiungere l'anticorpo primario alla diluizione appropriata. Incubare pertutta la notte a 4 gradi centigradi, con dondolo.
- Rimuovere l'anticorpo primario e lavare due volte con PBST per 15 min con dondolo.
- Aggiungere l'anticorpo secondario fluorescente. Si consiglia un anticorpo verde-fluorescente in modo che non oscuri le particelle fluorescenti. Incubare a temperatura ambiente per 2 h, con dondolo.
- Rimuovere l'anticorpo secondario, lavare due volte per 15 min ciascuno con PBST.
- Macchia con DAPI.
- Rimuovere il lavaggio finale e sostituire con 1 mL di DAPI diluito in PBST (1:1000).
- Macchie per 20 min con dondolo a temperatura ambiente.
- Rimuovere DAPI e lavare 2x (ripetere il passaggio 5.2).
- Sostituire il lavaggio finale con 1x PBST fresco.
NOTA: Le mosche possono essere conservate a 4 gradi centigradi, per un massimo di 3 giorni, protette dalla luce, dopo il primo lavaggio sostituendo il lavaggio con PBST fresco.
6. Montaggio di cutici su vetrini al microscopio e immagini
- Preparare cutici sezionati.
- Sotto lo stereoscopio dissezioso, tagliare la cuticola in eccesso che potrebbe interferire con l'imaging.
- Utilizzando pinze, trasferire le cutici con recipiente dorsale attaccato in un tubo di microcentrifuga di 1,5 mL contenente il 70% di glicerolo. L'inserimento delle cuticoli nel glicerolo aiuterà a rimuovere il PBST e consentirà un'immagine più chiara durante l'imaging.
- Montare le cutiche sul vetrino del microscopio.
- Aggiungere qualche goccia di glicerolo 70% a un vetrino al microscopio.
- Utilizzando pinze, rimuovere le cutici dal tubo glicerolo e mettere in glicerolo sul vetrino.
- Sotto il microscopio stereo dissezioso, utilizzare pinze per orientare le cuticoli lato ventrale verso l'alto, assicurando che il vaso dorsale sia visibile. Il pigmento più scuro della cuticola sarà rivolto verso il basso.
- Aggiungere un'ulteriore goccia di glicerolo, se necessario. Questo aiuta a prevenire le bolle d'aria e consente un'immagine più chiara.
- Posizionare delicatamente una coverslip sopra le cutici e i bordi di sigillazione con lo smalto delle unghie. Lasciare asciugare per 10-15 min prima di procedere. Immagina le mosche immediatamente o conservatevi in una scatola a prova di luce a 4 gradi centigradi.
- Immagine del vaso dorsale.
- Utilizzando un microscopio fluorescente, utilizzare il sistema di interferenza strutturale per generare sezioni ottiche del vaso dorsale. In alternativa, è possibile utilizzare un microscopio confocale che può fornire ulteriore precisione. Ottenere immagini di impilamento z della nave dorsale utilizzando un software di imaging obiettivo e preferito 20x. Aggiungere una barra di scala di 10 mm e etichettare e salvare correttamente le immagini come file tiff (Figura 4) o nel formato desiderato.
NOTA: Il numero di immagini di stack z ottenute può variare tra le dissezioni e dipende da quanto bene il vaso dorsale è stato sezionato, e dalla dimensione del gradino desiderato tra le immagini. Qui, la dimensione del passo è stata impostata su 0,49 mm. Questo numero può variare da 3 a 40 immagini per pila nella nostra esperienza.
- Utilizzando un microscopio fluorescente, utilizzare il sistema di interferenza strutturale per generare sezioni ottiche del vaso dorsale. In alternativa, è possibile utilizzare un microscopio confocale che può fornire ulteriore precisione. Ottenere immagini di impilamento z della nave dorsale utilizzando un software di imaging obiettivo e preferito 20x. Aggiungere una barra di scala di 10 mm e etichettare e salvare correttamente le immagini come file tiff (Figura 4) o nel formato desiderato.
7. Analizzare le immagini
- Quantifica gli eventi fluorescenti utilizzando ImageJ.
- Aprire le immagini e impilarle: Immagine à Stack s à immagini in pila.
- Contare solo i segnali fluorescenti di dimensioni 1 mm all'interno di un diametro di 10 mm centrato su un nucleo POSITIVO DAPI facendo clic su ogni evento da almeno 10 celle per mosca, da almeno 10 mosche per età per tipo di particella iniettato: Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figura5A). Lo strumento di notifica del contatore delle celle assegna un colore diverso a ogni cella tracciata, con un punto colorato che corrisponde a ogni evento fluorescente su cui si è fatto clic all'interno di tale cella.
- Per elencare il contatore e la posizione dello stack associati a ciascun punto, premere 'm' o selezionare Misura nella scheda Analizza oppure per visualizzare il numero di eventi conteggiati in ogni cella in una tabella dei risultati, premere 'alt 'y'(Figura 5B).
- Trasferire i conteggi delle celle in un foglio di calcolo da utilizzare per l'analisi statistica.
- Eseguire analisi statistiche.
- Analizzare le differenze negli eventi fagocitici utilizzando ANOVA a effetti fissi o ANOVA annidati a modello misto. I modelli misti possono essere utilizzati per testare i principali effetti fissi dell'età e del genotipo e l'effetto casuale di individui nidificati all'interno di ogni genotipo17.
NOTA: Gli investigatori devono essere rigorosi nel testare i presupposti di qualsiasi procedura statistica utilizzata per analizzare i dati.
- Analizzare le differenze negli eventi fagocitici utilizzando ANOVA a effetti fissi o ANOVA annidati a modello misto. I modelli misti possono essere utilizzati per testare i principali effetti fissi dell'età e del genotipo e l'effetto casuale di individui nidificati all'interno di ogni genotipo17.
Representative Results
Per illustrare i metodi di iniezione descritti, la figura 1A mostra il sito di iniezione sulla Drosophila melanogaster, nonché il modo in cui il colorore alimentare consente una conferma visiva dell'inserimento della mosca (Figura 1B). L'aggiunta di coloralimentare aiuta anche nel riconoscimento di un ago ostruito. Le iniezioni possono essere eseguite nell'addome, ma mantenere il sito di iniezione coerente attraverso gli esperimenti. Ciò consentirà di ridurre al minimo le possibili variazioni tra ogni esperimento.
Per visualizzare le particelle fluorescenti etichettate all'interno di emociti residenti lungo la nave dorsale, abbiamo sezionato il vaso dorsale e attaccato la cuticola addominale. Figura 2A-F delinea i metodi di dissezione.
Per valutare la capacità specifica dell'età delle mosche giovani e anziane di effettuare la fagocitosi, gli emociti lungo il vaso dorsale vengono visualizzati utilizzando un microscopio fluorescente. Per garantire che vengano conteggiate solo le cellule lungo la nave dorsale, gli anticorpi o i geni marcati TGF per alcuni marcatori di cellule del sangue o collagene specifico del cuore, come Hemese e Hemolectin, o Pericardin (Figura 3), possono essere utilizzati rispettivamente22,23,,24. Le particelle di E. coli etichettate fluorescenti hanno una lunghezza di 1 mm, mentre gli emociti hanno undiametrodi 10 mm . Vengono conteggiati solo gli eventi fluorescenti situati all'interno di un diametro di 10 mm centrato su un nucleo POSITIVO a DAPI (Figura 4). Per quantificare gli eventi fluorescenti, viene utilizzato il software ImageJ (Figura 5).
Figura 1: Sito di iniezione e verifica visiva. (A) Il lato laterale del torace è trafitto con un ago tirato-capillare. (B) Le iniezioni vengono verificate visivamente aggiungendo colorante alimentare verde alla soluzione delle particelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dissezione della nave dorsale. (A) I Pin sono collocati nel torace e nell'addome posteriore (frecce nere). (B-C) Due incisioni orizzontali (frecce verdi) vengono effettuate all'estremità posteriore dell'addome (B) e all'estremità anteriore (C). (D) Un'incisione verticale (freccia verde) è fatta al centro dell'addome, collegando i due tagli orizzontali. (E) Perni opzionali (-) vengono utilizzati per presentare la cavità addominale, esponendo il tessuto interno. (F) Il tessuto interno (coltivazione, intestino, utero, ovaie, corpi grassi) viene rimosso, esponendo il vaso dorsale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: vista ventrale di un vaso dorsale sezionato da una femmina di 5 settimane iniettata con particelle sensibili al pH, macchiata di anticorpo diretto contro Pericardin (A). La linea bianca punteggiata delinea il lato laterale del recipiente dorsale, con una freccia rivolta verso la regione anteriore. (B) Immagine ingrandita di (A): grappoli di emociti (freccia blu) che stavano attivamente degradando i batteri, all'interno della prima camera aortica della nave dorsale. (C) Immagine ingrandita di (A) che delinea la proteina simile al collagene a matrice extracellulare (ECM), Pericardin (freccia verde), che tiene la nave dorsale in posizione24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Vaso dorsale dissected e emociti associati da una mosca femminile iniettata con particelle sensibili al pH, o particelle di fluoro. (A) Il recipiente dorsale e gli emociti associati con particelle E. coli sensibili al pH inghiottite (rosso), o (E)con etichettatura fluoro e particelle di E. coli (rosso), isolate da una mosca vecchia di 1 settimana, dopo essersi recuperate per 60 min. ( (B,F) Insetficato di (A) e (E) (scatola bianca), rispettivamente, mostrando due emociti individuali con eventi numerabili. (C) Il recipiente dorsale e gli emociti associati con particelle E. coli sensibili al pH inghiottite (rosso) o ( G) particelle di E. coli con etichettatura fluoro (rosso), isolate da una mosca vecchia di 5 settimane, dopo essersi recuperate per 60 m. ( ( (D,H) Insetficato di (C) e (G) (scatola bianca), rispettivamente, mostrando due emociti individuali con eventi numerabili. La linea bianca punteggiata delinea il lato laterale del recipiente dorsale, con una freccia rivolta verso la regione anteriore. Nuclei macchiati con DAPI (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificare gli eventi fagocitici all'interno di un emocito da 10 mm utilizzando il contatore cellulare in ImageJ. (A) Dopo l'apertura di immagini in ImageJ, lo strumento Cell Counter Notice può essere utilizzato per tenere traccia degli eventi fagocitici per cella. (B) Questo strumento assegnerà un colore diverso a ogni cella selezionata per essere conteggiata, con ogni punto corrispondente a un evento fluorescente all'interno di quellacella. Premendo 'alt-y' verrà visualizzata una tabella che mostra il numero di eventi conteggiati per cella. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo qui descritto è un modo affidabile per quantificare diversi aspetti della fagocitosi, in condizioni sperimentali controllate. Notiamo che abbiamo testato questa procedura solo con particelle batteriche negative grammo e i risultati possono differire se vengono utilizzate particelle batteriche grampositive positive. In effetti, sarebbe interessante confrontare le risposte fagocitiche con batteri negativi al grammo e grammo positivi in diverse condizioni sperimentali. L'uso di un nano-iniettore consente un controllo preciso sui volumi di iniezione, assicurando che ogni mosca venga iniettata con lo stesso volume di particelle. Una limitazione al protocollo deriva dalle incoerenze nei preparati delle particelle. Le particelle si aggregano una volta congelate, quindi piccole variazioni nei volumi di diluizione, o mancanza di vortice, possono influenzare la concentrazione di particelle tra gli esperimenti. Per ridurre al minimo le possibili variazioni delle concentrazioni di particelle tra le età, è utile iniettare mosche di 1 e 5 settimane nello stesso giorno, utilizzando la stessa soluzione di ago e particelle. Un altro potenziale inconveniente è che durante le dissezioni, il recipiente dorsale e/o la cuticola possono essere facilmente danneggiati se i perni non vengono maneggiati correttamente. Per evitare di interrompere il recipiente dorsale, ridurre al minimo il numero di pin utilizzati per dissezione. Il vantaggio di questo metodo di dissezione è che tutti i passaggi di fissazione, lavaggio e colorazione possono essere eseguiti nella piastra di dissezione. Poiché le cutiche sono bloccate, ciò impedisce che le cutichevenga vengano perse tra un passo e l'altro.
Rispetto ai metodi esistenti18,19,25,26,27,28,29, il protocollo descritto ha i suoi vantaggi e limitazioni.29 Sezionando il vaso dorsale, siamo in grado di visualizzare e quantificare i singoli emociti in questa posizione. Ciò consente di rilevare sottili variazioni nell'attività fagocitica tra gruppi sperimentali. Altri metodi visualizzano particelle etichettate fluorescenti raccogliendo emociti utilizzando un saggio di Bleed/Scrape19,25,26,27, o attraverso una cuticola ventrale intatta18,19,28,29;29 tuttavia, gli emociti individuali non possono essere valutati quando vengono visualizzati attraverso la cuticola dorsale. Il vantaggio di questo protocollo, rispetto al metodo Bleed/Scrape è che il nostro metodo ci permette di valutare solo gli emociti associati al vaso dorsale, e tiene conto delle cellule circolanti o di quelle lungo la parete del corpo, che possono essere funzionalmente diverse. Dissezione del vaso dorsale rimuove anche la necessità di includere un secondo ciclo di iniezioni con un quencher a fluorescenza, come Trypan blu19,26. Questo perché le particelle non legate o inghiottite da una cellula saranno lavate via durante i passaggi di lavaggio. Al contrario, i metodi alternativi possono essere più facili da eseguire perché non richiedono dissezioni. Mentre sezionare la nave dorsale è facile da imparare, questo passo aggiunge un livello di complessità che potrebbe non essere fattibile in alcuni progetti sperimentali.
Anche se l'uso descritto di questo saggio di fagocitosi in vivo è quello di valutare e quantificare gli eventi fagocitici tra diverse età, questo protocollo è altamente adattabile e può essere utilizzato per analizzare diversi aspetti della fagocitosi tra genotipo, sesso o tipo di tessuto. Con la fagocitosi di importanza centrale per la maggior parte degli animali multicellulari, capire come questo processo diminuisce con l'età potrebbe portare a migliori trattamenti terapeutici per la popolazione che invecchia. Questo approccio offre un potenziale a lungo termine per chiarire aspetti dei cambiamenti legati all'età nella risposta immunitaria, con particolare attenzione alla fagocitosi.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health R03 AG061484-02 e dall'UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
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