यह प्रोटोकॉल फागोसिटोसिटोसोसिस के वीवो परख का वर्णन करता है जो युवा और वृद्ध ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर हीमोसाइट्स की फैगोसाइटोस बैक्टीरिया की क्षमता का आकलन और मात्रा निर्धारित करताहै।
फागोसिटोसिस जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक आवश्यक कार्य है। यह प्रक्रिया फैगोसाइटिक हीमोसाइट्स द्वारा की जाती है जिसका प्राथमिक कार्य कणों की एक विस्तृत श्रृंखला को पहचानना और माइक्रोबियल रोगजनकों को नष्ट करना है। जीवों की उम्र के रूप में, इस प्रक्रिया में गिरावट शुरू हो जाती है, फिर भी अंतर्निहित तंत्र या इम्यूनोसेंसेंस के आनुवंशिक आधार के बारे में बहुत कम जानकारी है। यहां, वयस्क ड्रोसोफिला में हीमोसाइट्स में फैगोसाइटिक घटनाओं की मात्रा को निर्धारित करके, फागोसिटोसिस के विभिन्न पहलुओं में उम्र से संबंधित परिवर्तनों का आकलन करने के लिए वीवो फैगोसाइटोसिस परख में आधारित एक इंजेक्शन का उपयोग किया जाता है। ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर कई कारणों से जन्मजात प्रतिरक्षा समारोह में उम्र से संबंधित परिवर्तनों की जांच करने के लिए एक आदर्श मॉडल बन गया है। एक के लिए, कई आनुवंशिक घटकों और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्यों, phagocytosis सहित, विकासवादी ड्रोसोफिला और स्तनधारियों के बीच संरक्षित कर रहे हैं । इस वजह से, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से प्राप्त परिणाम विभिन्न जीवों में प्रतिरक्षा कार्य में आयु संबंधी परिवर्तनों को समझने के लिए व्यापक रूप से प्रासंगिक होने की संभावना है। इसके अतिरिक्त, हम ध्यान दें कि यह विधि हीमोसाइट फैगोसाइटिक क्षमता का मात्रात्मक अनुमान प्रदान करती है, जो विभिन्न प्रकार के शोध विषयों के लिए उपयोगी हो सकती है, और उम्र बढ़ने के अध्ययन तक सीमित होने की आवश्यकता नहीं है।
जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली, जिसमें संक्रमण के साथ-साथ सेलुलर घटकों के लिए भौतिक और रासायनिक बाधाएं होती हैं, बहुकोशिकीय जीवों में संरक्षित विकासवादी है1,,2। रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली सभी जानवरों,1, 2, 3,2में रोगजनकों पर हमला करने का मुकाबला करने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातीहै। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के घटकों में कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल होती है जिन्हें इस आधार पर वर्गीकृत किया जाता है कि उनमें विशिष्टता और इम्यूनोलॉजिकल मेमोरी की कमी होती है2, 3,4.4 मनुष्यों में, इन कोशिका प्रकारों में फैगोसाइटिक मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, और साइटोटॉक्सिक प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं4,,5शामिल हैं। जबकि एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली होने मेजबान अस्तित्व के लिए जरूरी है, यह स्पष्ट है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्य उम्र के साथ गिरावट आती है, एक घटना इम्यूनोसेंसेंस5, 6,के रूप में जानाजाताहै । रोग प्रतिक्रिया में उम्र से संबंधित परिवर्तनों का आकलन करने में सक्षम होने के नाते, फागोसिटोसिस की प्रक्रिया के विभिन्न पहलुओं सहित, इम्यूनोसेंसेसेंसेंस की हमारी समझ में सहायता कर सकता है। हम यहां जिस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, वह ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर में हीमोसाइट्स द्वारा फैगोसाइटिक घटनाओं का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी और दोहराने योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता है।
ड्रोसोफिला कई कारणों से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। एक के लिए, आनुवंशिक उपकरणों का एक व्यापक सेट उपलब्ध है जो ऊतक-निर्भर तरीके से जीन अभिव्यक्ति में आसानी से हेरफेर करना संभव बनाता है7। इन उपकरणों में म्यूटेंट, आरएनए हस्तक्षेप स्टॉक्स, GAL4/UAS स्टॉक्स और ड्रोसोफिला जेनेटिक रेफरेंस पैनल का संग्रह शामिल है जिसमें 205 अलग-अलग इनब्रीड लाइनें हैं जिनके लिए पूरे जीनोम दृश्यों को8सूचीबद्ध किया गया है। ड्रोसोफिला का छोटा जीवन चक्र और उत्पादित व्यक्तियों की बड़ी संख्या शोधकर्ताओं को थोड़े समय में नियंत्रित वातावरण में कई व्यक्तियों का परीक्षण करने की अनुमति देती है। यह जीनोटाइप के बीच, लिंगों के बीच या उम्र भर में संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में सूक्ष्म अंतर की पहचान करने की क्षमता में बहुत सुधार करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि कई आनुवंशिक घटक और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्य, जिनमें फागोसिटोसिस शामिल है, ड्रोसोफिला और स्तनधारियों1, 2,के बीच विकासवादी रूप सेसंरक्षितहैं।
ड्रोसोफिला में, संक्रमण के बाद होने वाले फैगोसाइटोसिस की प्रक्रिया प्लाज्मोसाइट्स नामक फैगोसाइटिक हीमोसाइट्स द्वारा की जाती है, जो स्तनधारी मैक्रोफेज9के बराबर हैं। विभिन्न कणों को पहचानने और माइक्रोबियल रोगजनकों को साफ करने के लिए हेमोसाइट्स आवश्यक हैं9,10,11,12,,13. ये कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर्स व्यक्त करती हैं जिन्हें स्वयं को गैर- स्वयं से अलग करना चाहिए, और फागोसाइटिक प्रक्रिया,10 ,11, 12 ,13,,14,,15को पूरा करने के लिए आवश्यक संकेत घटनाओं की शुरुआत करनी चाहिए।1215 एक बार जब एक कण बाध्य हो जाता है, तो यह एक प्रकार का होता है, जो कण के चारों ओर विस्तार करने के लिए प्लाज्मा झिल्ली के एक्टिन साइटोस्केलेटन के पुनर्गठन और पुनः तैयार करके, एक फैगोसाइटिक कप11, 12,,13,,14,बनाने के लिए आंतरिक होजाताहै। इस प्रक्रिया के दौरान, संकेतों का एक अन्य सेट कोशिका को फागोसाइटिक कप को बंद करके कण को और आंतरिक बनाने के लिए कहता है, जिससे झिल्ली से बंधे फागोसोम11,12,,,13,14, 15,15होते हैं।, इसके बाद फागोसोम एक परिपक्वता प्रक्रिया से गुजरता है, जो विभिन्न प्रोटीनों से जोड़ता है और लाइसोसोम के साथ फ्यूजिंग करता है, जिससे अम्लीय फैगोलिसोम11,12,,,13,14, 15,15बनता है ।, इस बिंदु पर कणों को कुशलतापूर्वक नीचा दिखाया जा सकता है और 11 ,12,,13,14,15को समाप्त किया जासकताहै । ड्रोसोफिला अध्ययनों से पता चला है कि पुरानी मक्खियों (4 सप्ताह की उम्र) में छोटी मक्खियों (1-सप्ताह पुरानी) की तुलना में संक्रमण को साफ करने की क्षमता कम होती है, कम से कम भाग में, फागोसाइटोसिस16, 17,17के कुछ पहलुओं में गिरावट के कारण।
यहां वर्णित विधि दो अलग फ्लोरोसेंटी-लेबल वाली गर्मी-मारे गए ई. कोलाई कणों, एक मानक फ्लोरोफोर और एक जो पीएच संवेदनशील है, का उपयोग करता है, जो फागोसिटोसिस के दो अलग-अलग पहलुओं का आकलन करने के लिए है: कणों की प्रारंभिक चपेट, और फागोलिसोसोम में कणों का क्षरण। इस परख में, फ्लोरो-कण फ्लोरेसेंस तब नमूदार होता है जब कणों को हेमोसाइट्स से बांधा और घिरा होता है, जबकि पीएच संवेदनशील कण केवल फागोसोम की कम पीएच स्थितियों में फ्लोरोस करते हैं। फ्लोरोसेंट घटनाओं को तब हीमोसाइट्स में देखा जा सकता है जो पृष्ठीय पोत के साथ स्थानीयकरण करते हैं। हम पृष्ठीय पोत के लिए स्थानीय हीमोसाइट्स पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो हीमोसाइट्स का पता लगाने के लिए एक शारीरिक मील का पत्थर प्रदान करते हैं जो बैक्टीरियल क्लीयरेंस में योगदान करने के लिए जाना जाता है, और उन्हें लगातार अलग करने के लिए। हालांकि, शरीर के अन्य हिस्सों में हीमोसाइट्स और हीमोलिम्फ भी क्लीयरेंस के लिए महत्वपूर्ण हैं। यद्यपि हमने इस कोशिका आबादी का अध्ययन नहीं किया है, लेकिन हमारी सामान्य प्रक्रिया इन कोशिकाओं के फैगोसाइटिक परख के लिए भी लागू हो सकती है। हमारे दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि हम व्यक्तिगत हीमोसाइट्स के भीतर फैगोसाइटिक घटनाओं की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं, जिससे हमें फागोसाइटिक प्रक्रियाओं में सूक्ष्म भिन्नता का पता लगाने की अनुमति मिल सकती है। क्यूटिकल18, 19,19 के माध्यम से फ्लोरोसेंट घटनाओं की कल्पना करने वाले अन्य अध्ययनों में मौजूद हीमोसाइट्स की संख्या में अंतर नहीं है, जो हमारे मामले में विशेष रूप से विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि कुल हीमोसाइट गिनती17वर्ष की आयु के साथ बदलने की उम्मीद है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल नियंत्रित प्रायोगिक परिस्थितियों में फागोसिटोसिस के विभिन्न पहलुओं की मात्रा निर्धारित करने का एक विश्वसनीय तरीका है। हम ध्यान दें कि हम केवल ग्राम नकारात्मक जीवाणु कणों के साथ इस प्रक्रिया का परीक्षण किया है और परिणाम अलग हो सकता है अगर ग्राम सकारात्मक जीवाणु कणों का उपयोग किया जाता है । दरअसल, विभिन्न प्रायोगिक परिस्थितियों में ग्राम नकारात्मक और ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया दोनों के लिए फैगोसाइटिक प्रतिक्रियाओं की तुलना करना दिलचस्प होगा। नैनो-इंजेक्टर का उपयोग इंजेक्शन की मात्रा पर सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक फ्लाई कणों की एक ही मात्रा के साथ इंजेक्ट की जाती है। प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा कण की तैयारी में विसंगतियों से आता है । कण एक बार जमे हुए एकत्र हो जाएंगे, इसलिए कमजोर पड़ने की मात्रा में छोटे बदलाव, या भंवर की कमी, प्रयोगों के बीच कण एकाग्रता को प्रभावित कर सकते हैं। उम्र के बीच कण सांद्रता में संभावित विविधताओं को कम करने के लिए, एक ही सुई और कण समाधान का उपयोग करके, एक ही दिन में 1-और 5 सप्ताह पुरानी मक्खियों को इंजेक्ट करना फायदेमंद है। एक और संभावित खामी यह है कि विच्छेदन के दौरान, पृष्ठीय पोत और/या क्यूटिकल आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है अगर पिन ठीक से संभाला नहीं कर रहे हैं । पृष्ठीय पोत को बाधित करने से बचने के लिए, प्रति विच्छेदन उपयोग किए जाने वाले पिनों की संख्या को कम करें। इस विच्छेदन विधि का लाभ यह है कि विच्छेदन प्लेट में सभी निर्धारण, धोने और धुंधला कदम किए जा सकते हैं। क्योंकि क्यूटिकल्स नीचे टिकी होती हैं, यह क्यूटिकल्स को चरणों के बीच खोने से रोकती है।
मौजूदा तरीकों की तुलना में18,,19,,25,,26,,27, 28,,,29,वर्णित प्रोटोकॉल के फायदे और सीमाएं हैं।28 पृष्ठीय पोत को विच्छेदन करके, हम इस स्थान पर व्यक्तिगत हीमोसाइट्स की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने में सक्षम हैं। इससे प्रायोगिक समूहों के बीच फैगोसाइटिक गतिविधि में सूक्ष्म विविधताओं का पता लगाना संभव हो जाता है। ,28,अन्य विधियां ब्लीड/स्क्रैप परख19 , 25 , 26 , 27 , या अक्षुण्ण वेंट्रल क्यूटिकल 18 ,,,19,2826,29के माध्यम से हेमोसाइट्स एकत्र करके फ्लोरोसेंटी लेबल वाले कणों की कल्पना करतीहैं।1919 हालांकि, पृष्ठीय क्यूटिकल के माध्यम से कल्पना किए जाने पर व्यक्तिगत हीमोसाइट्स का आकलन नहीं किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का लाभ, जब Bleed/परिमार्जन विधि की तुलना में यह है कि हमारी विधि हमें केवल उन पृष्ठीय पोत से जुड़े hemocytes का आकलन करने की अनुमति देता है, और कोशिकाओं या शरीर की दीवार है, जो कार्यात्मक रूप से अलग हो सकता है के साथ उन परिसंचारी के लिए खाते करता है । पृष्ठीय पोत को विच्छेदन करने से फ्लोरेसेंस क्वेंचर के साथ इंजेक्शन के दूसरे दौर को शामिल करने की आवश्यकता भी दूर हो जाता है, जैसे ट्राइपैन ब्लू19,,26। इसका कारण यह है कि किसी कोशिका से बंधे या घिरा हुआ कोई भी कण धोने के चरणों के दौरान बह जाएगा। इसके विपरीत, वैकल्पिक तरीकों को प्रदर्शन करना आसान हो सकता है क्योंकि उन्हें विच्छेदन की आवश्यकता नहीं होती है। पृष्ठीय पोत को विच्छेदन करते समय सीखना आसान है, यह कदम जटिलता का एक स्तर जोड़ता है जो कुछ प्रयोगात्मक डिजाइनों में व्यवहार्य नहीं हो सकता है।
यद्यपि वीवो फागोसिटोसिस परख में इसका वर्णित उपयोग विभिन्न उम्र के बीच फागोसाइटिक घटनाओं का आकलन और मात्रा बताना है, यह प्रोटोकॉल अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसका उपयोग जीनोटाइप, सेक्स या ऊतक प्रकार के बीच फागोसिटोसिस के विभिन्न पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। अधिकांश बहुकोशिकीय जानवरों के लिए फैगोसाइटोसिस केंद्रीय महत्व के होने के साथ, यह समझना कि उम्र के साथ इस प्रक्रिया में गिरावट कैसे आती है, उम्र बढ़ने की आबादी के लिए बेहतर चिकित्सीय उपचार का कारण बन सकती है। यह दृष्टिकोण रोग प्रतिक्रिया में उम्र से संबंधित परिवर्तनों के पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए दीर्घकालिक क्षमता प्रदान करता है, जिसमें फैगोसाइटोसिस पर विशेष ध्यान दिया जाता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को स्वास्थ्य R03 AG03 AG061484-02 और प्राकृतिक और गणितीय विज्ञान के UMBC कॉलेज बेक्टन डिकिंसन संकाय अनुसंधान कोष के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
35×10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
Glass slides | Premiere | D17026102 | |
Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55℃ Solenoid: 45 |
Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |