Bedömning av den åldersspecifika fagocytiska förmågan hos vuxna Drosophila melanogaster Hemocyter med hjälp av en In Vivo Fagocytosis Analys

Summary

Detta protokoll beskriver en in vivo-analys av fagocytos som används för att bedöma och kvantifiera förmågan hos unga och äldre Drosophila melanogaster hemocyter till fagocytosbakterier.

Abstract

Fagocytos är en viktig funktion av det medfödda immunsvaret. Denna process utförs av fagocytiska hemocyter vars primära funktion är att känna igen ett brett spektrum av partiklar och förstöra mikrobiella patogener. Som organismer ålder, denna process börjar minska, men lite är känt om de underliggande mekanismerna eller den genetiska grunden för immunsenetescens. Här, en injektion baserad in vivo fagocytosis analys används för att bedöma åldersrelaterade förändringar i olika aspekter av fagocytos, såsom bindande, uppslukande, och nedbrytning av internaliserade partiklar, genom att kvantifiera fagocytiska händelser i hemocyter hos vuxna Drosophila. Drosophila melanogaster har blivit en idealisk modell för att undersöka åldersrelaterade förändringar i medfödda immunfunktion av många skäl. För en, många genetiska komponenter och funktioner av medfödda immunsvar, inklusive fagocytos, är evolutionärt bevaras mellan Drosophila och däggdjur. På grund av detta, resultat som erhållits från att använda detta protokoll är sannolikt mycket relevanta för att förstå åldersrelaterade förändringar i immunförsvaret i en mängd olika organismer. Dessutom noterar vi att denna metod ger kvantitativa uppskattningar av hemocyte fagocytic förmåga, vilket kan vara användbart för en mängd olika forskningsämnen, och behöver inte begränsas till studier av åldrande.

Introduction

Det medfödda immunsystemet, som består av fysikaliska och kemiska hinder för infektion samt cellulära komponenter, är evolutionärt bevaras över flercelliga organismer^1,2. Som den första försvarslinjen spelar det medfödda immunsystemet en avgörande roll i kampen mot invaderande patogener hos alla djur^1,2,3. Komponenterna i det medfödda immunsvaret omfattar ett brett spektrum av celltyper som klassificeras på grundval av att de saknar specificitet och immunologiskt minne^2,3,4. Hos människor, dessa celltyper inkluderar fagocytiska monocyter och makrofager, neutrofiler, och cytotoxiska naturliga mördarceller^4,5. Samtidigt som ett funktionellt immunförsvar är absolut nödvändigt för värd överlevnad, Det är uppenbart att funktionen av immunceller minskar med åldern, ett fenomen som kallas immunsenescence^5,6. Att kunna bedöma åldersrelaterade förändringar i immunsvaret, inklusive olika aspekter av processen för fagocytos, kan bidra till vår förståelse av immunsenscens. Förfarandet vi beskriver här ger en effektiv och repeterbar metod för att utvärdera och kvantifiera fagocytic händelser av hemocyter i Drosophila melanogaster.

Drosophila är en idealisk modell för att studera immunsvaret av många skäl. För det första finns det en omfattande uppsättning genetiska verktyg tillgängliga som gör det möjligt att enkelt manipulera genuttryck på ett vävnadsberoende sätt⁷. Dessa verktyg inkluderar en samling mutanter, RNA störningar lager, GAL4/UAS lager, och Drosophila genetiskreferenspanel som innehåller 205 olika inavlade linjer för vilka hela genomsekvenserna är katalogiserade⁸. Den korta livscykeln för Drosophila och det stora antalet individer som produceras tillåter forskare att testa flera individer i en kontrollerad miljö, på kort tid. Detta förbättrar avsevärt förmågan att identifiera subtila skillnader i immunsvar på infektion mellan genotyper, mellan könen eller över åldrar. Viktigt, många genetiska komponenter och funktioner av medfödda immunsvar, inklusive fagocytos, är evolutionärt bevaras mellan Drosophila och däggdjur^1,2.

I Drosophila utförs processen för fagocytos som följer infektion av fagocytiska hemocyter som kallas plasmatocyter, som motsvarar makrofager från däggdjur⁹. Hemocyter är nödvändiga för att känna igen ett brett spektrum av partiklar och rensa mikrobiella patogener^{9,,10,,11,,12,13}. Dessa celler uttrycker en mängd olika receptorer som måste skilja sig från icke-själv, och initiera signalering händelser som behövs för att utföra fagocytic processen^{10,11,12,13,14,15}. När en partikel är bunden, det börjar internaliseras genom omorganisation av aktin cytoskelettet och ombyggnad av plasmamembranet för att expandera runt partikeln, bildar en fagocytisk kopp^11,12,13,14. Under denna process, en annan uppsättning signaler talar om för cellen att internalisera partikeln ytterligare genom att stänga fagocytiska koppen, bildar en membranbunden fagosom^{11,12,13,14,15}. Den phagosome genomgår sedan en mognadsprocess, associera med olika proteiner och smälter samman med lysosomer, bildar en sur faagolysosom^{11,12,13,14,15}. Vid denna punkt kan partiklar effektivt brytas ned och elimineras^{11,,12,,13,,14,15}. Drosophila studier har visat att äldre flugor (4 veckors ålder) har en nedsatt förmåga att rensa en infektion jämfört med yngre flugor (1-veckors ålder), sannolikt beror, åtminstone delvis, på en nedgång i vissa aspekter av fagocytos^16,17.

Den metod som beskrivs här använder två separata fluorescerande märkta värme-dödade E. coli partiklar, en med en standard fluorofor och en som är pH-känslig, att bedöma två olika aspekter av fagocytos: den första uppslukande av partiklar, och nedbrytning av partiklar i phagolysosome. I denna analys är fluorpartikelfluorescens observerbar när partiklarna binds och uppslukas av hemocyter, medan pH känsliga partiklar fluorescerar endast i phagosomes låga pH-tillstånd. Fluorescerande händelser kan sedan observeras i hemocyter som lokaliserar längs dorsala kärlet. Vi fokuserar på hemocyter lokaliserade till dorsala fartyget, som ger en anatomisk landmärke för att lokalisera hemocyter som är kända för att bidra till bakteriell clearance, och att konsekvent isolera dem. Men hemocyter i andra delar av kroppen och hemolymph är också viktiga för clearance. Även om vi inte har studerat denna cellpopulation, kan vårt allmänna förfarande vara tillämpligt på fagocytiska analyser av dessa celler också. En fördel med vårt tillvägagångssätt är att vi kan kvantifiera fagocytiska händelser inom enskilda hemocyter, så att vi kan upptäcka subtil variation i fagocytiska processer. Andra studier som visualisera fluorescerande händelser genom nagelbanden^18,19 tar inte hänsyn till skillnader i antalet hemocyter närvarande, vilket är särskilt viktigt att överväga i vårt fall som totala hemocyte räknas förväntas förändras med^{ålder 17}.

Protocol

1. Samla in och ålder Drosophila För att generera samma åldern F1 flugor för att testa fagocytos, tillsätt 5-10 jungfruhonor och 5 hanar av lämpliga genotyper till en flaska som innehåller färsk flugamat. Vi använder en majsmjöl melass agar baserad mat20, men metoden bör fungera oavsett vilken typ av kost flugorna föds upp på. För detta experiment använde vi Hemese (Han)-GAL4; UAS-GFP flyger för att märka hemocyter genetiskt.OBS: Fler flugor kan användas, men vissa rader av D. melanogaster kan inte para sig eller reproducera väl när överfulla, och överbeläggning kan ha negativa effekter på larvutveckling21 och fagocytos. Underhåll flugor under de önskade experimentella förhållandena. För detta experiment, upprätthålla He-GAL4; UAS-GFP flyger vid 24 °C. Låt vuxna flugor para sig i en vecka och ta sedan bort vuxna. F1-flugor kommer sedan att samlas in från dessa flaskor efter eclosion för experimentell användning. Samla jungfruflugor under hela veckan, eller tills önskat antal flugor samlas in. Oskulder krävs inte; parning kan dock påverka immunsvaret. Om F1-flugor ska testas som oskulder, separera hanar och honor inom 8 timmar efter eclosion och underhålla i separata injektionsflaska för att förhindra parning. Samla tillräckligt med flugor för att möjliggöra bedömning av fagocytos i minst 10 flugor per genotyp/behandling/kön per ålder. Om de åldras flugorna till en vecka, samla minst 50 flugor totalt, eller 20 flugor per behandling villkor för varje partikel, antingen fluorpartiklar eller pH känsliga partiklar, som ska injiceras. Detta kommer att säkerställa minst 10 flugor till analys vid tidpunkten för experimentet. Om åldrande flyger till mer än 3 veckor, samla minst 100-150 flugor totalt, eller 50-75 flugor per behandlingstillstånd för att säkerställa att det finns tillräckligt med flugor tillgängliga för att mäta fagocytos. När åldrandeflugor i laboratoriet använder vi vanligtvis insektsburar som hålls vid 24 °C i 12:12 L:D förhållanden och ändra maten varannan dag. Om injektionsflaskar används i stället för burar flyger spetsen in i nya injektionsflaska var 3-5:e dag, beroende på matens tillstånd i injektionsflaskan. Antalet flugor som behövs beror på hur sent i ålder fagocytos kommer att analyseras, och den åldersspecifika överlevnaden för den genotypen i ett visst miljötillstånd. Om unga och äldre flugor kommer att bedömas, planera därefter så att 1 vecka gamla och äldre flugor kommer att injiceras på samma dag. Detta kommer att minimera variationer i partikelkoncentrationen mellan experimenten och kommer att säkerställa att effekten av ålder på den fagocytiska mätningen inte blandas ihop med effekten av den dag analysen utfördes. Hus de insamlade flugorna vid 24 °C tills de är 5-7 dagar gamla, eller upprätthålla flugorna till önskad ålder. 2. Bered fluorescerande märkta partiklar Rekonstruera värmedödade E. coli fluorpartiklar eller pH känsliga E. coli partiklar till en beståndskoncentration på 20 mg/ml eller 1 mg/ml, respektive. Andra bakterier finns tillgängliga för användning som kan vara lämpligare för vissa experiment, men hänvisar till tillverkarens anvisningar för lämpliga lagerkoncentrationer. För fluorpartiklar, tillsätt 990 μL 1x PBS (pH 7.4) eller önskad buffert och 10 μL 2 mM (20%) natriumazid. Vortex att blanda.OBS: Natriumazid är ett konserveringsmedel som kan utelämnas. Partiklar som framställs utan natriumazid varar dock inte lika länge. Fluorpartiklar måste användas inom 24 timmar och pH-känsliga partiklar måste användas inom 7 dagar. För pH-känsliga partiklar, tillsätt 1 980 μL 1x PBS (pH 7.4) eller önskad buffert och 20 μL 2 mM (20%) natriumazid. Vortex att blanda. Gör flera engångs-20 μL alikvoter i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förvara fluorpartiklar vid -20 °C i upp till ett år och pH-känsliga partiklar vid 4 °C i upp till 6 månader, skyddade från ljus. På injektionsdagen, avlägsna natriumazid från partiklarna före användning. För att göra detta, centrifugera partiklarna i 5 min vid 15.000 x g vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och tvätta partiklarna två gånger genom att återanvända i 50 μL 1x PBS eller önskad buffert, och centrifug i 5 min vid 15 000 x g. Efter den andra tvätten, ta bort supernatant och återsuspend partiklar i 100 μL av 1x PBS eller önskad buffert. Håll lösningen i röret och minimera exponeringen för ljus under hela experimentet. När natriumazid avlägsnas, använd fluorpartiklar inom 24 timmar och använd pH-känsliga partiklar som används inom 5-7 dagar.OBS: I våra tidigare experiment fann vi att denna koncentration av partiklar som räknasbara antal fagocytiska händelser och att antalet partiklar som finns tillgängliga för fagocytos av hemocyter inte varbegränsande 17. Användare av detta protokoll kan dock vilja jämföra resultat med hjälp av andra koncentrationer för att säkerställa att det finns ett tillräckligt antal partiklar tillgängliga för fagocytos av hemocyter under villkoren för deras experiment. Om natriumazid utelämnades, späd partiklarna 1:5 i samma buffert partiklarna var beredda med, för injektioner. Tillsätt en droppe (~10 μL) grön karamellfärg till partiklarna. Detta gör det lättare att se till att flugorna har injicerats. 3. Injicera flugorna Förbered glasnålar för injektioner. Dra glasnålar med hjälp av en pipett avdragare. Ställ in pipettavdragarens värmare på 55 °C och solenoiden till 45. Använd endast de nålar som medföljer injektorn, eftersom det inte är garanterat att andra nålar kommer att fungera med samma precision. Fyll en 1 ml steril spruta med mineralolja och fäst 30 gauge hypodermisk (G) nålen, försedd med nanoinjektorn. Fyll på den dragna kapillärnålen genom att föra in 30 G-nålen i den trubbiga änden av den dragna glasnålen och fyll med mineralolja. Ta långsamt bort 30 G-nålen, se till att det inte finns några luftbubblor i hela nålen, eftersom detta kan orsaka felaktiga injektionsvolymer. Injektorn fungerar inte som den ska utan att nålen fylls på igen. Med hjälp av pincett, bryta av spetsen på nålen för att skapa en öppning för att möjliggöra utkast av lösning. Montera nanoinjektorn.Andra injektorer kan användas. Den metod som beskrivs nedan gäller nanoinjektorn. För andra injektorer, se bruksanvisningen för instruktioner. Ställ injektorn på önskad volym (mellan 46 nL och 69 nL). Ta bort hylsan och placera tätningen O-ringen, den vita distansen med indraget uppåt för att ta emot nålens baksida och den större O-ringen på metallkolven, i den ordningen. Sätt tillbaka hylsan utan att dra åt den. För in metallkolven i den trubbiga änden av den oljefyllda glasnålen. Tryck försiktigt ner nålen och sätt in den i den större O-ringen. Dra åt hylsa tills den är säkrad.OBS: Om metallkolven inte sträcker sig förbi hylsan, tryck och håll “TOM” tills kolven är synlig. Detta gör det lättare att se till att kolven sätts in i nålen. Tryck och håll intryckt tills injektorn piper. Detta matar ut det mesta av mineraloljan från nålen, lämnar en liten volym olja att fungera som en barriär mellan de två vätskorna, samt tar bort luftbubblor. Fyll nålen med antingen fluorpartiklar eller pH-känsliga partiklar genom att föra in glasnålets spets i mikrocentrifugröret som innehåller de beredda partiklarna. Tryck och håll ned “FILL” tills injektorn piper. Injektioner Överför de flugor som ska injiceras i en tom flaska. Immobilisera flugorna genom att placera flaskan i is. CO2 kan också användas för att immobilisera flugorna. Observera dock att vid användning av pH-känsliga partiklar kan förhöjda CO2-nivåer på konstgjord väg försura alla buffertar som används och kan höja bakgrundsfluorescensen. Injicera flugorna i bröstkorgens bröstkorgs akteropleuraplatta (figur 1A). Injektionen lyckas om grön färg ses gå in i flugan (bild 1B). Om flugan inte blir grön, se till att nålen inte är igensatt.OBS: Alternativt kan flugor injiceras i buken, men håll injektionsstället konsekvent över alla experiment. Placera injicerade flugor i en ny matflaska, notera den tid som den första och sista flugan injicerades. För att minimera experimentella fel på grund av den tid det tar att slutföra injektioner, slutföra injektioner i tid. Med övning bör det inte ta längre tid än 10 minuter att injicera en uppsättning flugor. Lägg flaskan på sidan tills alla flugor har återhämtat sig, för att förhindra att flugorna fastnar i maten. Låt flugor återhämta sig i 60-90 min, beroende på experimentella förhållanden. Här användes en återhämtningstid på 60 minuter. Observera att denna återhämtningstid intervall var optimalt för att räkna fagocytiska händelser i de experimentella förhållandena i Horn et al. studie17. Emellertid, under vissa förhållanden, Detta kan vara för lång för att upptäcka subtila skillnader i fagocytos mellan behandlingsgrupper. Det kan vara användbart att utföra tidskursexperiment som gjordes tidigare17 för att bestämma återhämtningstiden som kommer att avslöja maximala skillnader mellan kontroll och experimentella resultat. Oavsett återhämtningstid väljs, hålla detta konsekvent över alla experimentella behandlingar. Om du injicerar med fluorpartiklar och pH-känsliga partiklar samma dag, använd en ny nål för varje lösning. Injicera inte enskilda flugor med båda partiklarna om de båda fluorescerar rött, eftersom resultatet inte skulle skilja mellan de två aspekterna av fagocytos, partikelbindning/uppslukande kontra partikelinkluder i fagomen. 4. Dissekera det dorsala fartyget Efter flugor har återhämtat sig i 60-90 min, överföra alla levande flugor till en tom flaska och immobilisera på is. Överför en fluga i taget till en silikon elastomerdissektionsplatta.OBS: Förbered dissektionsplattor minst 1 vecka före användning, om härdning i rumstemperatur. För att göra detta, förbereda elastomeren och häll den i en 33 mm x 10 mm petriskål, fylla skålen ungefär halvvägs. Knacka försiktigt på skålen på en plan yta för att minimera luftbubblor. Låt plattorna sitta i rumstemperatur, ostört, i minst en vecka. Under ett dissekerande stereomikroskop, orientera flugan ventrala sidan upp. Med hjälp av insektsnålar, fäst flugan på plattan genom att sätta in en stift genom bröstkorgen och en annan stift genom den mest bakre änden av buken, nära könsorganen (Figur 2A). Det kan vara användbart att halvera stiften innan du sätter fast provet för att inte hindra dissekeringen. Upprepa med upp till 10 flugor per dissekeringsplatta.OBS: Tillval: Ta bort vingarna och benen innan du sätter flugan på plattan. Detta kommer att bidra till att förhindra en bubbla bildas runt flugan när media läggs till. När alla flugor har fästs på plattan, tillsätt tillräckligt med dissekeringsmedia för att täcka flugorna (~ 1 ml) med hjälp av en överföring pipett. Ta bort huvudet med pincett eller nagelbandsax. Använd nagelbandsax, gör två horisontella snitt: en direkt ovanför den bakre stiftet i buken och en annan vid den mest främre änden av buken, där bröstkorgen och buken möts (figur 2B, C). I figur 2lämnades huvudet intakt för att klargöra orienteringen. Gör ett vertikalt snitt, som förbinder de två horisontella snitten (de tre nedskärningarna liknar bokstaven I). Detta kommer att öppna bukhålan (figur 2D). Med hjälp av pincett, ta bort de inre organen och vävnaden, undvika dorsala kärlet. Om ostörd, den transparenta dorsala fartyget kan ofta ses pulserande nära den främre änden av buken. Ytterligare stift kan användas för att fästa öppna nyklippta ändar av nagelbanden (figur 2E, F). Ta bort bröstkorgen med nagelbandsaxen med hjälp av nagelbandsax. Alternativt kan bröstkorgen tas bort innan de dissekerade nagelbanden och dorsala kärlet monteras på en mikroskoprutschbana. Upprepa med återstående flugor.  dissekera flugor i tid, för att minimera eventuella variationer i fagocytisk hastighet. När alla flugor har dissekerats, lämna nagelbanden med det bifogade dorsala kärlet fäst på plattan. Alla steg 5 kommer att utföras i dissekeringsplattan. Detta förhindrar att nagelbanden skadas eller oavsiktligt kasseras mellan stegen. 5. Fixering och färgning Fixa dissekerade nagelband med fäst dorsala kärl i 4% paraformaldehyd (PFA). Använd en ny engångsöverförings pipet för varje steg, kassera dissekeringsmediet och ersätt med 1 ml 4 % PFA. Under hela fixering och färgning, hålla dissektioner skyddas från ljus så mycket som möjligt. Inkubera i rumstemperatur i 15 min med gungning vid 20 varv/min. Låt inte dissektioner sitta i fixativ i mer än 20 min, eftersom detta kan börja skada vävnaden. Tvätta nagelbanden 2x i 1x PBS + 0,1% Tween (PBST). Ta bort fixativ och byt ut med 1 ml 1x PBST. Tvätta i rumstemperatur i 15 min med gungning. Upprepa 1x.OBS: Dissekerad, fast vävnad kan förvaras vid 4 °C, i upp till 3 dagar, skyddad från ljus, efter den första tvätten genom att byta ut tvätten mot färsk PBST. Förvara inte fast vävnad om antikroppar kommer att användas. Antikroppar bör användas med färsk vävnad för bästa resultat. Tillval: Antikroppsfärgning. Antikroppar kan användas för att tydligt visualisera dorsalakärlet tydligt (figur 3), eller för att upptäcka hemocyter specifika markörer. Detta kan säkerställa att endast celler längs dorsala kärlet räknas eller för att markera hemocyternas membran. Ta bort den andra tvätten, tillsätt primär antikropp vid lämplig utspädning. Inkubera över natten vid 4 °C, med gungande. Avlägsna primär antikropp och tvätta två gånger med PBST i 15 min med gungning. Tillsätt fluorescerande sekundär antikropp. Vi rekommenderar en grönlysrörsantikropp så att den inte skymmer fluorescerande partiklar. Inkubera i rumstemperatur i 2 h, med gunga. Avlägsna sekundär antikropp, tvätta två gånger i 15 min vardera med PBST. Fläck med DAPI. Ta bort den slutliga tvätten och byt ut 1 ml DAPI utspädd i PBST (1:1000). Fläck i 20 min med gungning i rumstemperatur. Ta bort DAPI och tvätta 2x (upprepa steg 5.2). Byt ut den slutliga tvätten mot färsk 1x PBST.FLUGOR kan förvaras vid 4 °C i upp till 3 dagar, skyddade mot ljus, efter den första tvätten genom att tvätta med färsk PBST. 6. Montering av nagelband på mikroskopglas och bildbehandling Förbered dissekerade nagelband. Under dissekera stereomikroskop, avskurna överflödig nagelband som kan störa bildbehandling. Med hjälp av pincett, överföra nagelbanden med fäst dorsala kärlet i en 1,5 ml mikrocentrifug rör som innehåller 70% glycerol. Placera nagelbanden i glycerol hjälper till att ta bort PBST och möjliggör en tydligare bild under bildbehandling. Montera nagelbanden på mikroskopbilden. Tillsätt några droppar 70% glycerol till ett mikroskop bild. Använda pincett, ta bort nagelbanden från glycerol röret och placera i glycerol på bilden. Under dissekering stereo mikroskop, använda pincett för att orientera nagelband ventrala sidan upp, se till att dorsala fartyget är synlig. Nagelbandens mörkare pigment kommer att vara nedåtvänt. Lägg till en extra droppe glycerol, om det behövs. Detta hjälper till att förhindra luftbubblor och möjliggör en tydligare bild. Placera försiktigt ett täckglas över nagelbanden och täta kanterna med nagellack. Låt torka i 10-15 min innan du fortsätter. Avbilda flugorna omedelbart eller förvara i en ljussäker låda vid 4 °C. Bild av dorsala kärlet. Använd ett fluorescerande mikroskop och använd det strukturella interferenssystemet för att generera optiska delar av dorsala kärlet. Ett konfokalmikroskop kan alternativt användas som kan ge ytterligare noggrannhet. Skaffa Z-stack bilder av dorsala fartyget med hjälp av en 20x objektiv och önskad bildbehandling programvara. Lägg till en skala 10 mm och etikett och spara bilder som tiff-filer (bild 4) eller önskat format.OBS: Antalet Z-stack bilder som erhållits kan variera mellan dissektioner och beror på hur väl dorsala fartyget dissekerades, och på önskad stegstorlek mellan bilderna. Här var stegstorleken inställd på 0,49 mm. Det antalet kan variera allt från 3 till 40 bilder per stack i vår erfarenhet. 7. Analysera bilder Kvantifiera fluorescerande händelser med ImageJ. Öppna bilder och stapla dem: Bild à Stacks à Bilder till Stack. Räkna endast de ~1 mm stora lysrören inom en diameter på 10 mm centrerad på en DAPI-positiv kärna genom att klicka på varje händelse från minst 10 celler per fluga, från minst 10 flugor per ålder per partikeltyp injicerat: Plugins à Analysera à celldiskmeddelande ( Figur5A). Cellräknaren meddelande verktyget tilldelar en annan färg till varje cell spåras, med en färgad punkt som motsvarar varje fluorescerande händelse klickade på i cellen. Om du vill visa räknar- och stackpositionen som är associerad med varje punkt trycker du på “m” eller väljer Mät under fliken Analysera, eller om du vill visa antalet händelser som räknas i varje cell i en resultattabell trycker du på “alt +y” (bild 5B). Överför cellantalet till ett kalkylblad som ska användas för statistisk analys. Utför statistisk analys. Analysera skillnader i fagocytiska händelser med antingen fasta effekter ANOVA eller blandad modell kapslade ANOVA. Blandade modeller kan användas för att testa de viktigaste fasta effekterna av ålder och genotyp och den slumpmässiga effekten av individer kapslade inom varje genotyp17.OBS: Utredare bör vara rigorösa i att testa antaganden om alla statistiska förfaranden som används för att analysera data.

Representative Results

För att illustrera de beskrivna injektionsmetoderna visar figur 1A injektionsstället på Drosophila melanogaster, samt hur färgämnet för livsmedel möjliggör en visuell bekräftelse på att flugan injicerades (figur 1B). Tillsats av mat färgämne hjälper också i erkännandet av en igensatt nål. Injektioner kan utföras i buken, men hålla injektionsstället konsekvent över experiment. Detta kommer att bidra till att minimera eventuella variationer mellan varje experiment. För att visualisera fluorescerande märkta partiklar inom bosatta hemocyter längs ryggkärlet, dissekerade vi ryggkärlet och fäst buken nagelband. Figur 2A-F beskriver dissekeringsmetoderna. För att bedöma de åldersspecifika möjligheten hos unga och äldre flugor att utföra fagocytos visualiseras hemocyter längs dorsala kärlet med hjälp av ett fluorescerande mikroskop. För att säkerställa att endast celler längs dorsalakärlet räknas kan antikroppar eller GFP-märkta gener för vissa blodcellsmarkörer eller hjärtespecifikt kollagen, såsom Hemese och Hemolectin, eller Pericardin (figur 3),användas 22,23,24. Fluorescerande märkta E. coli-partiklar är 1 mm långa, medan hemocyter är 10 mm i diameter17. Endast de fluorescerande händelser som ligger inom en diameter på 10 mm centrerad på en DAPI-positiv kärna räknas (figur 4). För att kvantifiera fluorescerande händelser används ImageJ-programvara (figur 5). Figur 1: Injektionsställe och visuell verifiering. (A) Lateral sida av bröstkorgen genomborras med en dragbar kapillär nål. (B)Injektioner kontrolleras visuellt genom att tillsätta grönt livsmedelsfärgämne till partikellösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Dissekering av dorsalfartyg. (A) Stift placeras i bröstkorgen och bakre buken (svarta pilar). (B-C) Två horisontella snitt (gröna pilar) görs i den bakre änden av buken (B), och främre änden (C). (D) Ett vertikalt snitt (grön pil) görs ner i mitten av buken, som förbinder de två horisontella snitt. (E)Valfria stift (*) används för att filet öppna bukhålan, utsätta inre vävnad. (F)Inre vävnad (gröda, tarm, livmoder, äggstockar, fettkroppar) avlägsnas, utsätta dorsala kärlet. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Ventral syn på ett dissekerat dorsala kärl från en 5 veckor gammal hona som injiceras med känsliga pH-partiklar, färgas med antikroppar riktade mot Pericardin (A). Prickade vita linjen beskriver den laterala sidan av dorsala fartyget, med pil pekar mot den främre regionen. B)Förstorad bild av(A):grupper av hemocyter (blå pil) som aktivt förnedrande bakterier, inom den första aortakammaren i dorsala kärlet. (C)Förstorad bild av(A)som beskriver det extracellulära matrisen (ECM) kollagenliknande protein, Pericardin (grön pil), som håller det dorsala kärlet på plats24. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: Dissekerat dorsala kärl och tillhörande hemocyter från en honfluga som injiceras med pH-känsliga partiklar eller fluorpartiklar. (A)Dorsalakärlet och tillhörande hemocyter med uppslukade pH-känsliga märkta E. coli-partiklar (röd) eller(E)fluoraskinn märkta E. coli-partiklar (röda), isolerade från en 1 veckor gammal fluga, efter att ha återhämtat sig i 60 min.(B,F)Förstorad infälld av(A)respektiveE(vit låda), som visar två individualocy hemtes med räknebara händelser. C)Dorsalakärlet och tillhörande hemocyter med uppslukade pH-känsliga märkta E. coli-partiklar(röd) eller (G)fluorhaltiga E. coli-partiklar (röda), isolerade från en 5 veckor gammal fluga, efter att ha återhämtat sig i 60 minuter.(D,H)Förstorad infälld av(C)respektiveG(vit låda), som visar två individualocy hemtes med räknebara händelser. Prickade vita linjen beskriver den laterala sidan av dorsala fartyget, med pil pekar mot den främre regionen. Kärnor färgas med DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Kvantifiera fagocytiska händelser inom en 10 mm hemocyter med hjälp av cellräknaren i ImageJ. (A)Efter att ha öppnat bilder i ImageJ kan verktyget Cell Counter Notice användas för att hålla reda på fagocytiska händelser per cell. (B) Detta verktyg kommer att tilldela en annan färg till varje cell som valts för att räknas, med varje punkt som motsvarar en fluorescerande händelse i cellen. Om du trycker på “alt+y” visas en tabell som visar antalet händelser som räknas per cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det protokoll som beskrivs här är ett tillförlitligt sätt att kvantifiera olika aspekter av fagocytos, under kontrollerade experimentella förhållanden. Vi noterar att vi endast har testat detta förfarande med gramnegativa bakteriepartiklar och resultaten kan skilja sig åt om grampositiva bakteriepartiklar används. I själva verket skulle det vara intressant att jämföra fagocytiska svar på både gram negativa och gram positiva bakterier i olika experimentella förhållanden. Användningen av en nanoinjektor möjliggör exakt kontroll över injektionsvolymer, vilket säkerställer att varje fluga injiceras med samma mängd partiklar. En begränsning till protokollet kommer från inkonsekvenser i partikelpreparat. Partiklar kommer att aggregera en gång fryst, så små variationer i utspädningsvolymer, eller brist på virvel, kan påverka partikelkoncentrationen mellan experimenten. För att minimera eventuella variationer i partikelkoncentrationer mellan åldrar är det fördelaktigt att injicera 1- och 5-veckors gamla flugor samma dag, med samma nål- och partikellösning. En annan potentiell nackdel är att under dissektioner, dorsala fartyget och / eller nagelbanden kan lätt skadas om stiften inte hanteras på rätt sätt. För att undvika att störa dorsala kärlet, minimera antalet stift som används per dissekering. Fördelen med denna dissekeringsmetod är att alla fixerings-, tvätt- och färgningssteg kan utföras i dissekeringsplattan. Eftersom nagelbanden är fastklämda, förhindrar detta nagelbanden från att gå förlorade mellan stegen.

Jämfört med befintliga metoder^{18,19,25,26,27,28,29}, har det beskrivna protokollet sina fördelar och begränsningar. Genom att dissekera dorsala kärlet kan vi visualisera och kvantifiera enskilda hemocyter på denna plats. Detta gör det möjligt att upptäcka subtila variationer i fagocytisk aktivitet mellan experimentella grupper. Andra metoder visualisera fluorescerande märkta partiklar genom att samla hemocyter med hjälp av en Bleed/Scrape analys^19,25,26,27, eller genom en intakt ventrikel nagelband^18,19,28,29; enskilda hemocyter kan dock inte bedömas när visualiseras genom dorsala nagelbanden. Fördelen med detta protokoll, jämfört med Bleed / Skrapa metod är att vår metod tillåter oss att bedöma endast de hemocyter som är associerade med dorsala fartyget, och tar hänsyn till cirkulerande celler eller de längs kroppen väggen, som kan vara funktionellt annorlunda. Dissekera dorsala fartyget tar också bort behovet av att inkludera en andra omgång injektioner med en fluorescens quencher, som Trypan blå^19,26. Detta beror på att alla partiklar som inte är bundna till eller uppslukade av en cell kommer att tvättas bort under tvättsteg. Omvänt kan alternativa metoder vara lättare att utföra eftersom de inte kräver dissektioner. Medan dissekera dorsala fartyget är lätt att lära sig, lägger detta steg en nivå av komplexitet som kanske inte är möjligt i vissa experimentella mönster.

Även om den beskrivna användningen av denna in vivo fagocytos analys är att bedöma och kvantifiera fagocytiska händelser mellan olika åldrar, är detta protokoll mycket anpassningsbar och kan användas för att analysera olika aspekter av fagocytos mellan genotyp, kön eller vävnadstyp. Med fagocytos är av central betydelse för de flesta flercelliga djur, förstå hur denna process minskar med åldern kan leda till bättre terapeutiska behandlingar för den åldrande befolkningen. Detta tillvägagångssätt erbjuder långsiktig potential för att belysa aspekter av åldersrelaterade förändringar i immunsvaret, med särskilt fokus på fagocytos.

Materials

0.10 mm Insect pins	Fine Science Tools	26002-10	Here: pins are cut in half, and the sharp end is used
1 mL sterile syringes	Becton Dickinson	309602	Filled with mineral oil to load needle
15% Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	for dissection media
16 % Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS
1x Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
3 mL Trasnfer Pipet	Falcon	357524
3.5" Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X	1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D
35×10 mm Petri dishes	Becton Dickinson	351008	Used as dissection plate, filled half way with Sylgard
6x penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122	for dissection media
70% Glycerol	Sigma	G9012
Analog Vortex mixer	VWR	58816-121
Biological point forceps, Dumont No. 5	Fine Science Tools	11295-10
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies	D1306	Diluted 1:1000 in 1x PBST
Drosophila strain			w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8
E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate	Life Technologies	E23370
Glass slides	Premiere	D17026102
Live cell imaging solution	Life Technologies	A14291DJ	preferred buffer for particle preparation and dilutions
Mineral oil	Mpbio	194836
Nanoject II automatic nanoliter injector	Drummond	3-000-204
Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials	Genesee	32-116SB	Size: 25 X 95 mm
Nutating Mixer	Fisher Scientific	88-861-043	Speed used: 20 rpm
pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis	Life Technologies	P35361
Schneider's Drosophila cell culture media (1x)	Gibco	21720-024	Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	2mM (or 20%) working
Spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Sylgard 184 Silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Prepare according to provided protocol
Tween 20	Sigma	P1379	For PBS + 0.1% tween
Vertical Pipette Puller Model 700C	David Kopf Instruments	812368	Heater: 55℃ Solenoid: 45
Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope	Zeiss		Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software