Summary
نحن نقدم طريقة للتحقيق في التغيرات المبكرة هشاشة العظام على المستوى الخلوي في الغضروف المفصلي باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM).
Abstract
الخصائص الميكانيكية الحيوية للخلايا والأنسجة ليس فقط تنظيم شكلها ووظيفتها ولكن أيضا حاسمة للحفاظ على حيويتها. يمكن أن تنتشر التغيرات في المرونة أو تؤدي إلى ظهور أمراض رئيسية مثل السرطان أو هشاشة العظام (OA). وقد برز المجهر القوة الذرية (AFM) كأداة قوية لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية للهياكل المستهدفة البيولوجية المحددة على نطاق مجهري، وقياس القوى في نطاق صغير مثل بيكونيوتن إلى ميكرونيوتن. خصائص البيوميكانيكية ذات أهمية خاصة في الأنسجة العضلية الهيكلية، والتي تتعرض لمستويات عالية من الإجهاد. OA كمرض تنكسي من الغضروف يؤدي إلى تعطيل المصفوفة المحيطة بالخلية (PCM) وإعادة ترتيب المكانية من chondrocytes جزءا لا يتجزأ من مصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد ارتبط اضطراب في PCM وECM مع تغييرات في الخصائص الميكانيكية الحيوية للغضاريف. في هذه الدراسة استخدمنا AFM لقياس هذه التغيرات فيما يتعلق بتغيرات النمط المكاني المحددة للشوندروكويت. ومع كل تغير في النمط، لوحظت تغيرات كبيرة في المرونة بالنسبة لكل من PCM وECM. وبالتالي فإن قياس المرونة المحلية يسمح باستخلاص استنتاجات مباشرة حول درجة انحطاط الأنسجة المحلية في OA.
Introduction
الغضروف المفصلي هو نسيج وعائي وعصبي. تنتج chondrocytes المتناثرة بشكل متفرق ، وتنظم ، وتحافظ على مصفوفة خارج الخلية توسعية (ECM) التي يتم تضمينها فيها. كجزء متميز ومتخصص من ECM ، تحيط chondrocytes بطبقة رقيقة من المصفوفة المتخصصة المعروفة باسم المصفوفة المحيطة بالخلية (PCM). PCM بمثابة واجهة الخلية مصفوفة الميشانوحساس1 الذي يحمي chondrocytes2 وتعدل استجابتها biosynthetic3. كما وصف سابقا4، في غضروف صحي ، يتم ترتيب chondrocytes في أنماط مكانية محددة ومتميزة محددة لكل طبقة نسيج ومشترك4،5 وتعتمد على آليات التحميل الميكانيكية الخاصة بالمفاصل6. تتغير هذه الأنماط من الأزواج والسلاسل في الغضروف الصحي إلى سلاسل مزدوجة مع بداية هشاشة العظام (OA). مع مزيد من التقدم للمرض تشكل chondrocytes مجموعات صغيرة ، وزيادة تدريجية في الحجم إلى مجموعات كبيرة في OA المتقدمة. ويلاحظ فقدان كامل لأي هيكل تنظيمي وتحريض المبرمج في نهاية المرحلة OA. وهكذا، يمكن استخدام ترتيب الخلوية chondrocyte كعلامة بيولوجية على أساس الصورة للتقدم OA4.
الخصائص الميكانيكية الحيوية للخلايا والأنسجة ليس فقط تنظيم شكلها ووظيفتها ولكن أيضا حاسمة للحفاظ على حيويتها. يمكن أن تنتشر التغيرات في المرونة أو تؤدي إلى ظهور أمراض رئيسية مثل السرطان أو OA. وقد برز المجهر القوة الذرية كأداة قوية لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية للهياكل المستهدفة البيولوجية المحددة على نطاق مجهري، وقياس مجموعة واسعة من القوة، من بيكونيوتن إلى الميكرونيوتن. التطبيق الرئيسي للAFM هو قياس التضاريس السطحية والخصائص الميكانيكية للعينات في قرار مقياس تحت النانو7. يتكون جهاز القياس من ثلاثة مكونات رئيسية: 1) مسبار AFM ، وهو عبارة عن طرف حاد مثبت على الكانتيليفر ويستخدم للتفاعل المباشر مع سطح العينة. عندما يتم تطبيق القوة على cantilever ، يحدث تشوه هذا الأخير وفقًا لخصائص الأنسجة المقاسة. 2) نظام بصري أن المشاريع شعاع الليزر على cantilever، والتي تنعكس بعد ذلك إلى وحدة كاشف. 3) كاشف الديويدي الضوئية التي تلتقط الضوء منحرفة من cantilever. فإنه يحول المعلومات الواردة بشأن انحراف الليزر من قبل cantilever إلى منحنى القوة التي يمكن تحليلها.
وبالتالي، فإن المبدأ الرئيسي للإدارة الاستراتيجية هو الكشف عن القوة التي تعمل بين مسبار AFM والهيكل المستهدف للعينة. المنحنيات قوة حصلت وصف الخصائص الميكانيكية للهياكل المستهدفة على سطح العينة مثل مرونة، وتوزيع الشحن، المغناطيسية، والإجهاد العائد، ومرونة ديناميات تشوه البلاستيك8. ميزة هامة من AFM على تقنيات التصوير الأخرى هو أن AFM يمكن استخدامها لقياس الخصائص الميكانيكية للخلايا الحية في متوسطة أو أنسجة في حالة أصلية دون إتلاف الأنسجة. يمكن أن تعمل AFM في ظروف سائلة أو جافة. لا يوجد أي شرط لإعداد العينة. يوفر AFM إمكانية صورة عينة وقياس خصائصها الميكانيكية في وقت واحد في العينات القريبة من الظروف الفسيولوجية. في هذه الدراسة وصفنا نهجا جديدا لتقييم تطور OA من خلال قياس مرونة PCM وECM في الغضروف المفصلي الأصلي. إن ارتباط التنظيم المكاني للتشوندروكوتس بدرجة انحطاط الأنسجة المحلية يوفر منظورًا جديدًا تمامًا للكشف المبكر عن OA. بيد أن الأهمية الوظيفية لهذه الأنماط لم تقيَّم حتى الآن. لأن الوظيفة الرئيسية للغضروف المفصلي هو الحمل تحمل في احتكاك منخفض، يجب أن تمتلك الأنسجة خصائص مرنة. AFM يسمح قياس ليس فقط مرونة ECM ولكن أيضا من الأنماط الخلوية المكانية جزءا لا يتجزأ من PCM بهم. الارتباط الملحوظ للمرونة مع تغيير النمط المكاني للchondrocytes قوي لدرجة أن قياس المرونة وحدها قد يسمح بالتقسيم الطبقي لانحطاط الأنسجة المحلية.
تم تقييم مودولي مرن ة من PCM و ECM في 35 ميكرومتر رقيقة المقاطع باستخدام نظام AFM متكاملة في مجهر تباين المرحلة المقلوبة التي سمحت التصور في وقت واحد من عينة الغضاريف. ويستند هذا البروتوكول على دراسة نشرت بالفعل من مختبرنا9 ويصف على وجه التحديد كيفية توصيف الترتيب المكاني للchondrocytes وكيفية قياس مرونة PCM المرتبطة بها وECM. مع كل تغيير نمط من chondrocytes، يمكن أيضا ملاحظة تغييرات كبيرة في مرونة لكل من PCM وECM، مما يسمح لهذه التقنية لاستخدامها لقياس مباشرة مرحلة انحطاط الغضاريف.
يفتح هذا النهج المعتمد طريقة جديدة لتقييم تطور OA والآثار العلاجية في المراحل المبكرة قبل أن يبدأ تدهور الأنسجة العيانية في الظهور فعليًا. إن إجراء قياسات AFM باستمرار عملية شاقة. في البروتوكول التالي، نصف كيفية إعداد العينة التي سيتم قياسها بواسطة AFM، وكيفية إجراء قياسات AFM الفعلية بدءًا من إعداد الكانتيليفر، وكيفية معايرة AFM، ثم كيفية إجراء القياسات. وتعطي التعليمات خطوة بخطوة نهجا واضحا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة وتوفير استراتيجيات أساسية لمعالجتها وتفسيرها. يصف قسم المناقشة أيضًا المزالق الأكثر شيوعًا لهذه الطريقة الصارمة ويوفر نصائح مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على عينات الغضاريف البشرية من المرضى الذين يخضعون لرأب مفصل الركبة الكلي في قسم جراحة العظام في المستشفى الجامعي في توبنغن، ألمانيا، ومستشفى وينجهوفر، روتنبورغ a.N.، ألمانيا، لنهاية المرحلة OA من الركبة. تم الحصول على موافقة كاملة من الإدارات والمؤسسات واللجنة الأخلاقية المحلية قبل بدء الدراسة (المشروع رقم 674/2016BO2). ووردت موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى قبل المشاركة. وقد نُفذت هذه الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.
1. إعداد عينة
- إعداد الغضروف لأقسام cryotome
- لتقييم التغيرات التنكسية في مفصل الركبة، أخذ عينات الغضروف المفصلية التي تم الحصول عليها من منطقة الحمل من التوابل الفخذية بعد استئصال الأنسجة من المرضى.
ملاحظة: يجب أن تحتوي العينات التي يتم التحقيق فيها على طبقة رقيقة على الأقل من العظام تحت التشوندرية للسماح بتحديد واضح لتوجه الأنسجة فيما يتعلق بالسطح الداخلي والخارجي ، مما يسمح أيضًا بحصاد الأنسجة الموحدة لطبقة الغضاريف العليا. يمكن استخدام الغضاريف لقياسات AFM حتى 24 ساعة بعد الجراحة. يمكن تخزين الأنسجة في وسيط جلبكو المعدل (DMEM) الخالي من المصل مع 2٪ (v/v) البنسلين-ستريبتوميسين و 1.2٪ (v/v) amphotericin B قبل الاستخدام. تخزين العينات لأكثر من 24 ساعة يمكن أن يسبب القطع الأثرية في قياسات AFM بسبب تورم الأنسجة، ومع ذلك. - قطع الغضروف المفصلي ككل من العظام تحت الشوندري بمساعدة مشرط وبعد ذلك تضمين عينة الغضاريف في وسط تضمين قابل للذوبان في الماء على مقبض cryotome الذي يتجمد تحت درجة حرارة منخفضة في جهاز cryotome.
ملاحظة: الوسط المجمد ة استقرار النسيج الذي يغلف. كما يؤدي إلى تجميد عينة الغضاريف جنبا إلى جنب مع وسط التضمين. عند قطع الغضروف من العظام، تتبع اتجاه الأنسجة. يجب وضع النسيج المضمن للأقسام الجليدية بطريقة تواجه الطبقة العليا (أي السطح المفصلي) للغضروف النصل. لاحظ أن الأنسجة يجب أن تكون مغطاة بالكامل من قبل وسيط التضمين.
- لتقييم التغيرات التنكسية في مفصل الركبة، أخذ عينات الغضروف المفصلية التي تم الحصول عليها من منطقة الحمل من التوابل الفخذية بعد استئصال الأنسجة من المرضى.
- قسم Cryotome للغضاريف
- باستخدام cryotome القياسية، مقطع الأنسجة بسماكة 35 ميكرومتر من الطبقة العليا (أي السطح المفصلي) من الغضاريف المفصلية التي هي جزءا لا يتجزأ من وسط التضمين القابل للذوبان في الماء المجمدة.
ملاحظة: في المجموع، يمكن قسمة ما يصل إلى 300 ميكرومتر (وهو ما يعادل حوالي تسعة أقسام) واستخدامها في التحليلات. ويتوافق الحد المقترح البالغ 300 ميكرومتر مع عمق الاختراق البصري الذي يمكن الحصول عليه عادة باستخدام المجهر الفلوري في غضروف الهيلاين مثل الغضاريف المفصلية. وبالتالي ، فمن الممكن لفرز الغضاريف وفقا لنمط المكانية المحلية السائدة ومن ثم قياس هذه الأنماط في المقاطع المقابلة. - جمع المقاطع على شريحة زجاجية وشطف المقاطع 3x مع الفوسفات المخزنة المؤقتة المالحة (PBS) لإزالة المتوسطة التضمين للذوبان في الماء.
- باستخدام cryotome القياسية، مقطع الأنسجة بسماكة 35 ميكرومتر من الطبقة العليا (أي السطح المفصلي) من الغضاريف المفصلية التي هي جزءا لا يتجزأ من وسط التضمين القابل للذوبان في الماء المجمدة.
- الإلتصاق من أقسام الغضاريف على طبق بيتري متوافق مع AFM
ملاحظة: لأن AFM يجمع البيانات عن طريق المسافة البادئة الميكانيكية على العينة، يجب إصلاح المقاطع في مكانها للسماح بإجراء قياسات دقيقة.- الغراء بلطف أقسام سميكة 35 ميكرون مع الغراء عينة متوافقة بيولوجيا على أطباق ثقافة الأنسجة التي تتوافق مع جهاز AFM. للقيام بذلك، خذ 2-3 قطرات من الغراء ووضعها على طبق زراعة الأنسجة في الموقع الذي سينتهي به المطاف على حافة القسم. الآن وضع قسم الغضروف على الغراء والسماح لها بالعصا بحزم على سطح طبق زراعة الأنسجة.
ملاحظة: أقسام 35 ميكرومتر سميكة من الغضروف المفصلي الهيالين ليست عرضة جدا للالشباك. ومع ذلك، إذا الشباك يحدث عند إزالة العينات من الوسط المخزن المؤقت، تأكد من أن أقل قدر ممكن من السوائل العصي إلى العينات. بمجرد أن تجف المياه الزائدة ، انتشرت الأنسجة مباشرة على البقع المتناثرة من الغراء بحيث يتم إصلاحها على سطح طبق ثقافة الخلية. يتم تطبيق الغراء في طبقة رقيقة فقط عند حواف العينة وليس على القسم بأكمله. قياس فقط هذا الجزء من العينة التي هي بعيدة عن المنطقة لصقها للقضاء على إمكانية الغراء تتداخل مع القياسات. - احتضان المقاطع في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 دقيقة للسماح للغراء والأنسجة للسندات بشكل صحيح. ثم تغطية المقاطع مع L-15 متوسطة Leibovitz دون L-الجلوتامين ودون بيكربونات الصوديوم بحيث يتم غمرها بالكامل.
ملاحظة: الحركات المفاجئة للعينة أثناء التثبيت أو عدم كفاية تطبيق الغراء هي الأخطاء الشائعة التي تؤدي إلى انفصال الأنسجة عن طبق الثقافة. وعلاوة على ذلك، يجب تطبيق وسيط ليبويتز بطريقة لطيفة، حتى لا فصل العينة عن السطح بسبب "موجات" التي أنشأتها المتوسطة. - ضع طبق بيتري مع الأقسام الملصقة في حاضنة ثقافة الخلية القياسية عند 37 درجة مئوية حتى يتم إجراء القياسات.
ملاحظة: تأكد من أن أقسام الأنسجة مستقرة ولا تنفصل عن سطح طبق زراعة الأنسجة عن طريق أداء كل خطوة ببطء.
- الغراء بلطف أقسام سميكة 35 ميكرون مع الغراء عينة متوافقة بيولوجيا على أطباق ثقافة الأنسجة التي تتوافق مع جهاز AFM. للقيام بذلك، خذ 2-3 قطرات من الغراء ووضعها على طبق زراعة الأنسجة في الموقع الذي سينتهي به المطاف على حافة القسم. الآن وضع قسم الغضروف على الغراء والسماح لها بالعصا بحزم على سطح طبق زراعة الأنسجة.
2. إعداد Cantilever (لصق الكائنات الدقيقة)
- إعداد جهاز AFM وتمييع المايكروسفيرات
- ضع الكانتيليفر على الكتلة الزجاجية المحددة لقياسات الهواء ، وأصلحها مع الربيع ، وقم بتركيب الكتلة الزجاجية على رأس AFM.
- تمييع الجزيئات الدقيقة في الإيثانول 100٪ (100 جسيمات/10 ميكرولتر) والموجات فوق الصوتية لمدة 10 s، بحيث يتم فصل الجسيمات الدقيقة وعدم تكتل معا.
- إعداد الإعداد للإلتصاق
- قم بتنظيف شريحة زجاجية بالإيثانول بنسبة 70% وقم بتركيبها على حامل العينة على جهاز AFM.
ملاحظة: يمنع تطهير الشريحة بقع الغبار التي قد تتداخل مع عملية الإلتصاق من التراكم على سطح الشريحة. - ضع 2 ميكرولتر من تعليق الغلاف الصغير في منتصف الشريحة و2 ميكرولتر من الغراء بالقرب من تعليق الغلاف الصغير.
ملاحظة: يوصى بوضع تعليق الغلاف الصغير والغراء بالقرب من بعضهما البعض للسماح بانتقال سريع للكانتيليفر بين الغراء والميكروسفيرات. إذا كان الانتقال بين غمس cantilever في الغراء وإجراء اتصال مع microsphere طويلة جدا، فإن الغراء تصلب في نهاية المطاف، وبالتالي فقدان خصائصه لاصقة. - دع سائل الإيثانول في الغلاف الدقيق يُوقف الهواء جافًا ، مع ترك الأجزاء الدقيقة في مكانها.
- قم بتنظيف شريحة زجاجية بالإيثانول بنسبة 70% وقم بتركيبها على حامل العينة على جهاز AFM.
- الإلتصاق microspheres على طرف cantilever
- تراجع cantilever يدويا في الغراء مع مساعدة من محرك السائر في خطوات 10 ميكرون حتى يتم تغطية طرف من قبل الغراء. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة، كما يجف الغراء بسرعة.
- تراجع cantilever مرة أخرى بمقدار 100 ميكرومتر، وحركها نحو الميكروسفيرات، ووضع طرف cantilever مباشرة فوق ميكروسفير واحد.
- قم بتشغيل قياس مطياف القوة لغمس طرف cantilever على الغلاف الدقيق المحدد مع المعلمات الموضحة في الجدول 1.
ملاحظة: من خلال تنفيذ هذه الخطوة، يتم استخدام قياس سطح الغلاف الصغير لإقامة اتصال بين طرف cantilever والغلاف الصغير. يسمح وقت الاتصال الطويل نسبيًا المبين في الجدول 1 بوقت ترابط واسع بين الغراء والغلاف الصغير. يتم إنشاء منحنى مسافة القوة التي تم الحصول عليها خلال هذه الخطوة كمنتج ثانوي للصق الغلاف الصغير على طرف cantilever ولا تتم معالجته لمزيد من التحليل. - بمجرد إرفاق ميكروسفير إلى cantilever ، اسحب الكتلة الزجاجية مع الكانتيليفر المثبتة على القمة ثم قم بإزالة رأس AFM من المجهر. وأخيرا، إلغاء تحميل كتلة الزجاج وcantilever من رئيس AFM.
- احتضان cantilever في 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة والسماح لها الجافة بين عشية وضحاها في RT قبل البدء في القياسات.
ملاحظة: حضانة cantilever يعزز خصائص لاصقة الغراء، مما يجعل cantilever-microsphere-complex أكثر استقرارا.
3. إعداد جهاز AFM للقياسات
- ضبط كتلة زجاجية محددة للقياس في بيئة سائلة على حامل AFM بحيث يكون السطح العلوي مستقيمًا ومتوازيًا مع حامل AFM.
- مع مساعدة من ملاقط، جبل بعناية cantilever مختارة على سطح كتلة الزجاج، بحيث تلميح AFM مع الغلاف الصغير تبرز على الطائرة البصرية المصقولة.
ملاحظة: تحتاج نصيحة cantilever إلى إبراز الطائرة المصقولة من أجل أن تكون قادرة على عكس ليزر AFM على الكاشف الضوئي. كن حذرا جدا عند وضع cantilever على AFM حتى لا خدش السطح البصري المصقول للكتلة الزجاجية. قد يؤدي خدش الكتلة الزجاجية إلى صعوبات في ضبط محاذاة الليزر وقد تتداخل مع القياسات اللاحقة. - لأن cantilever سوف تكون عرضة للضغط الميكانيكي، فإنه يحتاج إلى أن تكون ثابتة في مكانها. استقرار cantilever على كتلة الزجاج عن طريق انزلاق الربيع المعدني في الأخدود من كتلة ولقط الجزء العلوي من cantilever مع الربيع مع مساعدة من ملاقط.
- ضع الكتلة الزجاجية بعناية مع الكانتيليفر على رأس AFM ويؤمنونها مع آلية القفل المتكاملة. تأكد من أن الربيع يواجه الجانب الأيسر بحيث يتم وضع cantilever في الاتجاه الصحيح. ثم قم بتركيب رأس AFM مع الكانتيليفر على جهاز AFM.
4. تحميل العينة ومعايرة cantilever
ملاحظة: هنا، يتم إجراء معايرة الجهاز عن طريق تشغيل منحنى قوة على السطح النظيف لطبق بيتري المليء بوسيط ليبوفيتز دون أي أنسجة عينة. يمكن أيضًا إجراء المعايرة باستخدام طبق AFM تحكم منفصل مملوء فقط بوسيط AFM بدون العينة.
- تركيب العينة على جهاز AFM
- ضع طبق بيتري الذي تم إعداده في الخطوة 1.3.3 على حامل عينة AFM.
- بدوره على سخان طبق بيتري وتعيينه في 37 درجة مئوية. السماح لطبق زراعة الأنسجة بالوصول إلى درجة الحرارة المثلى (أي 20 دقيقة).
- ضع احباط حماية على قاعدة الجمعية cantilever لتجنب التكثيف المتوسطة في الرأس AFM.
- معايرة الجهاز
- افتح البرنامج(جدول المواد)متبوعاً بنافذة محاذاة الليزر والنافذة التي تصور إعدادات معلمة النهج. ثم قم بتشغيل محرك السائر وضوء الليزر وكاميرا CCD.
- استخدام CCD الكاميرا على المجهر لتصور وتحديد cantilever. باستخدام وظيفة محرك السائر، خفض cantilever في 100 ميكرومتر خطوات حتى يتم غمر cantilever تماما في الوسط.
ملاحظة: يمكن التعرف بصريا ً على غمر الكانتيليفر في السائل عبر كاميرا CCD. عندما يكسر سطح الماء، فإن طرف الكانتيليفر يخلق انعكاسات دائرية ملحوظة بسهولة في الماء. - توجيه الليزر على رأس cantilever باستخدام مسامير التكيف.
ملاحظة: لا تُبالغ في البراغي، لأن هذا سيفسد آلية محاذاة الليزر. وينظر إلى cantilever من أسفل وشعاع الليزر يأتي من فوق. - بمجرد وضع الليزر على cantilever ، قم بضبط شعاع الليزر بمساعدة مسامير في جهاز AFM بحيث يقع الشعاع المنعكس على مركز الكاشف الضوئي. الحفاظ على رصد موقف شعاع الليزر باستخدام وظيفة محاذاة الليزر.
ملاحظة: يلتقط الكاشف انحراف شعاع الليزر الذي تعكسه الكانتيليفر ويحوله إلى إشارة كهربائية. - بعد ضبط التكنيليفر بالليزر، يجب أن تكون إشارة المجموع 1 V أو أعلى بينما يجب أن تكون الانحرافات الجانبية والعمودية قريبة من 0. إذا لم يتم الحصول على هذه القيم، قم بضبط جهاز الكشف الضوئي.
- الحصول على منحنى قوة المعايرة
- من أجل الوصول إلى السطح على طبق AFM لبدء القياسات ، قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي مع معلمات النهج الواردة في الجدول 2. بمجرد الوصول إلى الجزء السفلي من طبق زراعة الأنسجة ، اسحب الكانتيليفر بمقدار 100 ميكرومتر.
ملاحظة: عند هذه النقطة يكون المسبار بالضبط 100 ميكرومتر أعلاه من أسفل طبق زراعة الأنسجة. - إعداد معلمات RUN وضبط المعلمات المعروضة في الجدول 3. انقر على زر التشغيل لبدء القياس والحصول على منحنى معايرة قوة المسافة.
ملاحظة: يظهر منحنى القوة الذي تم الحصول عليه هنا في الشكل 1. - على منحنى معايرة قوة المسافة، حدد المنطقة لاحتواء خطي من منحنى تراجع في البرنامج.
ملاحظة: يتم الملاءمة الخطية لقياس حساسية cantilever. بمجرد وضع الملاءمة الخطية، سيتم حفظ القيم بواسطة البرنامج. يتم حساب القياس المستمر الربيع أو الضوضاء الحرارية من cantilever من قبل البرنامج بعد ذلك. - كما يتم تنفيذ القياسات في المتوسط في درجة حرارة 37 درجة مئوية، تعيين متغير درجة الحرارة في 37 درجة مئوية في البرنامج لمحاكاة الظروف الفسيولوجية عن كثب قدر الإمكان.
ملاحظة: بحلول نهاية المعايرة، يتم حفظ الانحراف الرأسي وعرضه في وحدة القوة، نيوتن (N)، بدلاً من فولت (V)، وهي وحدة التسجيل الأصلي بواسطة كاشف الديوديات الضوئية.
- من أجل الوصول إلى السطح على طبق AFM لبدء القياسات ، قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي مع معلمات النهج الواردة في الجدول 2. بمجرد الوصول إلى الجزء السفلي من طبق زراعة الأنسجة ، اسحب الكانتيليفر بمقدار 100 ميكرومتر.
5. التوصيف البيوميكانيكي لECM وPCM من خلال إجراء قياسات مرونة عبر AFM
- تحديد أنماط الشوندروكيت في قسم الغضاريف
- مراقبة قسم الغضروف تحت مجهر تباين المرحلة المتكاملة في نظام AFM وتحديد أنماط الخلوية المحددة10 من الغضروف المفصلي من الركبة هشاشة العظام: سلاسل واحدة (مناطق الأنسجة السليمة)، سلاسل مزدوجة (الضمور الأنسجة بداية)، مجموعات صغيرة وكبيرة (على حد سواء انحطاط الأنسجة المتقدمة). انظر الشكل 2A-D.
- وبمجرد تحديد النمط المطلوب المحدد، قم بقياس موقعين لكل نمط مختار لكل نوع مصفوفة (PCM أو ECM) وإجراء تسعة تكرارات قياس على كل موقع قياس(الشكل 2E، F). تأكد من حجم عينة كبير بما يكفي لحساب عدم الدقة المحتملة.
ملاحظة: بالنسبة لقياسات PCM، ضع الكانتيليفر على مقربة من الخلايا (كما هو موضح في الدوائر الحمراء في الشكل 2E، F). من أجل إجراء قياسات لـ ECM، حدد منطقة بدون أي خلايا (تظهر من قبل المنطقة الزرقاء في الشكل 2E, F)وتنفيذ المسافة البادئة كما هو موضح في الخطوة 5.2.
- المسافة البادئة للموقع المستهدف
- تنفيذ نهج يتبعه تراجع بحيث يتم وضع cantilever 100 ميكرومتر فوق الأنسجة ، والتي ستكون موضع البداية للقياسات اللاحقة.
- التركيز على PCM أو ECM من النمط الذي سيتم قياسه وإصلاح فأرة الكمبيوتر عند هذه النقطة.
ملاحظة: الماوس سيكون بمثابة علامة مرئية للموقع المستهدف من المسافة البادئة. بمجرد أن يتحول التركيز إلى طرف cantilever ، ستصبح هياكل الأنسجة غير قابلة للتمييز أو غير واضحة. - الآن التركيز على التحقيق ونقل غيض من التحقيق إلى النقطة التي تم إصلاحها سابقا من قبل سهم الكمبيوتر. بعد ذلك ، ابدأ القياسات باستخدام RUN، باستخدام معلمة النقطة المحددة التي تم الحصول عليها عن طريق معايرة cantilever.
ملاحظة: يظهر منحنى قوة نموذجي تم الحصول عليه من قياس PCM لسلسلة واحدة في الشكل التكميلي 1.
6 - معالجة البيانات
ملاحظة: يتم إجراء تحليل البيانات أو تحديد معامل مرن باستخدام نموذج هيرتز كما هو موضحسابقا11,,12. كان شكل indenter كروية بسبب استخدام microspheres على الطرف وأبقى نسبة بواسون في 0.5 على أساس الأدب السابق13،14،15.
- افتح برنامج معالجة البيانات(جدول المواد)المتوافق مع البيانات التي تم الحصول عليها من جهاز AFM.
- حدد نموذج Hertz في البرنامج لمعالجة منحنيات مسافة القوة. تعيين نسبة بويسون في 0.5 وحدد شكل تلميح كروية ونصف قطر تلميح من 12.5 ميكرومتر.
- بمجرد تعديل جميع المعلمات ، يتم تركيب النتائج ، ويتم حساب معامل Young وعرضه بواسطة البرنامج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على طول النموذج physiopathological من السلاسل إلى سلاسل مزدوجة ، إلى صغيرة وأخيرا إلى مجموعات كبيرة ، كل من ECM(الشكل 3A)وPCM(الشكل 3B)مودولي مرنة انخفضت بشكل كبير بين كل تغيير نمط. الاستثناء الوحيد كان الفرق في ECM بين السلاسل والسلاسل المزدوجة (p = 0.072). تظهر النتائج أن نسبة ECM/PCM(الشكل 4B)لم تتغير بشكل كبير ، في حين لوحظ انخفاض ملحوظ في الاختلافات المطلقة في المرونة بين ECM و PCM(الشكل 4A). وعلاوة على ذلك، لا تظهر النتائج أي ارتباط كبير فيما يتعلق بنسبة ECM/PCM أو التغيرات المكانية الخلوية المرتبطة بها (ص = -0.099، p = 0.281).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لمنحنى مسافة القوة في وضع الاتصال AFM. مع اقتراب المسبار من السطح ، تكون القوى صغيرة جدًا بحيث لا تعطي انحرافًا قابلًا للقياس للتلميح في البداية ، مما يترك الطرف في موضعه غير المضطرب (1). ثم، عندما cantilever قريبة جدا من العينة، وذلك بسبب القوى اللاصقة النشطة بين الطرف والتحقيق، وcantilever يستقر في الواقع بسرعة نحو العينة (2). مع التحقيق تقترب من العينة ، وانحراف مثير للاشمئزاز ثم يواجه ضد حركة الاتجاه ، مع وظيفة خطية تقريبا من الارتفاع والانحراف حتى انحراف عمودي يصل إلى قيمة نقطة مجموعة نسبية (3). عند التراجع (4)، بالإضافة إلى خفض القوى المنحرفة، تكون قوى الالتصاق موجودة أيضًا بينما يتم سحب الكانتيليفر في المحور Z من العينة. كما يتم سحب التحقيق AFM قبالة الاتصال مع العينة، فإنه يحصل أولا "عالقة" قبل أن تكون قادرة على تخفيف من التصاق في واجهة، حتى مما يؤدي إلى انحراف سلبي قصير من cantilever، قبل أن تصل مرة أخرى موقفها محايدة غير عازمة دون اتصال مع التحقيق (5). يتم التعبير عن مدى الانحراف في القوة التي تعمل على الكانتيليفر المعبر عنها في النانونيوتن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التوصيف المكاني التمثيلي للشوندروكوييتس وقياسات AFM للمصفوفة خارج الخلية (ECM) والمصفوفة المحيطة بالخلية (PCM). (A-D) توصيف الأنماط الخلوية: السلاسل(A)، السلاسل المزدوجة(B)، المجموعات الصغيرة(C)، والمجموعات الكبيرة(D). تم تقييم مودولي مرنة من PCM (الدوائر الحمراء) وECM (المنطقة الزرقاء)(E/F)لأنماط الخلوية المختلفة في غضروف هشاشة العظام. وقد تم اختيار مواقع القياس لـ ECM وPCM من قبل المجرب ويشار لها بيانيا بواسطة الصلبان السوداء. يتم وضع علامة على طرف الكانتيليفر المستخدم للقياسات بنجمة بيضاء. تمثل أشرطة المقياس 10 ميكرومتر(A-D)و100 ميكرومتر(E/F). تم تكييف هذا الرقم وتعديله من Danalache وآخرون9. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة مودولي يونغ الكمي للمصفوفة خارج الخلية (ECM) والمصفوفة المحيطة بالخلية (PCM) كدالة لتنظيم chondrocyte المكاني. مع التنظيم المكانية المرضية التدريجية chondrocyte، لوحظ انخفاض تدريجي من المرونة في boxplots لكل من ECM(A)وPCM(B)(* ع < 0.05، ***p < 0.001). اختصارات: SS: سلاسل واحدة، DS: سلاسل مزدوجة، SC: مجموعات صغيرة، قبل الميلاد: مجموعات كبيرة. الأرقام مأخوذة من دانالاكو وآخرون9. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: علاقة مودولي يونغ للمصفوفة خارج الخلية (ECM) والمصفوفة المحيطة بالخلية (PCM) كدالة للتنظيم المكاني الخلوي. ارتبطت منظمة chondrocyte المكانية المرضية على نحو متزايد مع انخفاض في مودولي يونغ لكل من ECM وPCM(A). في حين أن هذه التغيرات المكانية حدثت ، ظلت نسبة مرونة ECM و PCM ثابتة ، مما لا يظهر أي تغييرات كبيرة(B). يتم تقديم البيانات كمخطط خط مع متوسط ± خطأ قياسي(A)وboxplots(B). اختصارات: SS: سلاسل واحدة، DS: سلاسل مزدوجة، SC: مجموعات صغيرة، قبل الميلاد: مجموعات كبيرة. الأرقام مأخوذة من دانالاكو وآخرون9. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: منحنى القوة التمثيلية التي تم الحصول عليها عن طريق المسافة البادئة للمصفوفة المحيطة بالخلية (PCM) لنمط سلسلة واحدة تظهر نتائج الملاءمة (السهم البرتقالي) وكذلك مربع متوسط الجذر المتبقي (RMS المتبقية؛ السهم الأسود). تتضمن نتائج الملاءمة نقطة الاتصال بين العينة والبقشيش، ومعامل Young، والأساس. وتصف RMS المتبقية المعروضة أدناه الفرق بين البيانات الملائمة وبيانات القوة، وبالتالي تمثل جودة منحنى القوة المناسب. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
| الجدول 1 - ما إذا كانت هناك معلمات لصق ميكروسفير على مسبار AFM | |
| معلمات | قيمه |
| نقطة البداية | 5.0 V |
| ضبط خط الأساس | 1 |
| سحب طول | 90.0 ميكرومتر |
| Z الحركة | سرعة ثابتة |
| تمديد السرعة | 5.0 ميكرومتر/سنة |
| تمديد الوقت | 18.0 سنة |
| وقت الاتصال | 90.0 ث |
| وضع التأخير | قوة ثابتة |
| معدل العينة | 2000 هرتز |
الجدول 1 - ما إذا كانت هناك معلمات لصق ميكروسفير على مسبار AFM.
| الجدول 2 - ما إذا كانت هناك معلمات النهج | |
| معلمات النهج | قيمه |
| نهج IGain | 5.0 هرتز |
| نهج PGain | 0.0002 |
| ارتفاع الهدف للنهج | 10.0 ميكرومتر |
| نقطة ضبط النهج | 5.00 V |
| خط الأساس للنهج | 0.00 فولت |
الجدول 2 - ما إذا كانت هناك معلمات النهج.
| الجدول 3 - ما إذا كانت هناك تشغيل المعلمات | |
| معلمات | قيمه |
| نقطة البداية | 1.0 V |
| ضبط خط الأساس | 1 |
| سحب طول | 90.0 ميكرومتر |
| Z الحركة | سرعة ثابتة |
| تمديد السرعة | 5.0 ميكرومتر/سنة |
| تمديد الوقت | 18.0 سنة |
| وقت الاتصال | 0.0 s |
| وضع التأخير | قوة ثابتة |
| معدل العينة | 2000 هرتز |
الجدول 3 - ما إذا كانت هناك تشغيل المعلمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام AFM كتقنية جديدة وقوية لقياس الخصائص الميكانيكية الحيوية للمواد البيولوجية على مستوى النانو، قمنا بقياس الخصائص المرنة لـ ECM و PCM في الغضروف المفصلي لهشاشة العظام البشرية. تم اختيار عينات الغضاريف وفقًا لنمطها المكاني السائد في منظمة chondrocyte كعلامة بيولوجية قائمة على الصور لانحطاط الأنسجة المحلية. وكما هو متوقع، لوحظ انخفاض قوي في قيم مرونة كل من الإدارة الاستراتيجية وإدارة المبايض على طول عملية إعادة تنظيم الشوندروكسيت المكانية. هذه الملاحظات تبرز بوضوح أن الانحرافات في الترتيب المكاني للchondrocytes لم ترتبط فقط مع التغيرات في خصائص مرنة من البيئة الدقيقة الخلوية (PCM)، ولكن أيضا في جميع أنحاء الغضروف بأكمله (ECM). وعلاوة على ذلك، فإن نسبة ECM/PCM لم تظهر أي تغييرات كبيرة على الرغم من التغيرات القوية في مودولي مرنة PCM وECM خلال OA. وتشير هذه النتائج إلى أن التغييرات في الخصائص الميكانيكية لـ ECM وPCM حدثت بشكل أحادي الاتجاه وفي الوقت نفسه، مما قد يعني أن طبيعة التدمير التدريجي متشابهة بالنسبة لكل من PCM و ECM. وبالتالي فإن بدء عملية الإنشاء والتقدم في سوق العمل يؤدي إلى تدهور كبير في نظام إدارة الـ PCM وECM والتدمير في نهاية المطاف. وارتبطت كلتا الخسارتين بفقدان كبير للخصائص الميكانيكية الحيوية للغضروف المفصلي مثل مرونته، كما هو مبين في هذه الدراسة. وهذا يؤكد على الأهمية الوظيفية للتنظيم المكاني للشوندروكوييتس كعلامة للخصائص الميكانيكية الحيوية. على العكس من ذلك ، فإنه يسمح لنا باستخدام قياسات المرونة المحلية لاستخلاص استنتاجات حول الأنماط المكانية السائدة محليًا وبالتالي انحطاط الأنسجة المحلية في الغضاريف.
وقد برز المجهر القوة الذرية (AFM) كأداة عالية الدقة لدراسة الأنسجة بطريقة غير مدمرة. وهي تعمل من خلال فحص العينات جسديا مع cantilever حساسة ومرنة التي تعكس الليزر على الفوتوديويد. يتم تسجيل أي تغييرات في هذا الانعكاس وتحويلها إلى إشارة كهربائية. في حين أن AFM هو أداة قوية لإجراء قياسات ذات مقياس نانوي ، إلا أنه لا يأتي دون قيوده والمزالق. حاسمة بشكل خاص هو إعداد cantilever عن طريق لصق microspheres. وفي سياق هذه الطريقة، تُستخدم المجالات الدقيقة لتعديل عمق المسافة البادئة والضغط المحلي أثناء القياسات. باستخدام microspheres الصغيرة تعلق على غيض من التحقيق يسمح قياس الخصائص الميكانيكية الحيوية لشبكة الألياف بدلا من مرونة الألياف واحد عند استخدام طرف وحدها. كما أنه يمنع تلف الأنسجة أثناء عملية القياس. نظرًا للطبيعة الدقيقة لمجسات الكانتيليفر ، يجب إنشاء طريقة إعداد يقظة ودقيقة من أجل الحصول على قياسات متسقة ودقيقة. من أجل منع microspheres من فصل من طرف الاستشعار، نوصي الغراء الطازج مختلطة لا يزيد عمرها عن أسبوع واحد. وعلاوة على ذلك، من الضروري لوظائف المستشعر أن تضع الغلاف الصغير في مركز الطرف لأن الانحراف الجانبي في مرفق الغلاف الصغير يؤدي بسهولة إلى قياسات غير متسقة.
وضع cantilever على كتلة الزجاج وإصلاحه مع الربيع المناسب هو عملية حساسة وعرضة للخطأ التي تحتاج إلى اهتمام دقيق والأيدي الثابتة. نظرًا لأن الكانتيليفرات من المرجح جدًا أن يتم تدميرها من قبل المشغلين غير المدربين ، فإننا نوصي بإجراء العديد من عمليات الاختبار والممارسة للتعامل بشكل مريح مع مكونات AFM القابلة للكسر بسهولة.
كتلة زجاجية نظيفة أمر حتمي لمعايرة الجهاز بشكل صحيح والحصول على قياسات موثوقبها. قد تمنع الأوساخ أو الغبار على السطح البصري للكتلة محاذاة الليزر المناسبة على كاشف الصور الضوئي. لذلك ، إذا واجهت مشاكل أثناء محاذاة الليزر ، قد يكون من الضروري غسل الكتلة الزجاجية مع الإيثانول مرة ثانية.
يمكن إجراء تحليل البيانات أو تحديد معامل مرن باستخدام نموذج هيرتز كما هو موضح سابقًا11،12. باختصار ، فإن البيانات الناتجة عن المسافة البادئة هي مؤامرات للقوة على حركة طرف cantilever. أثناء القياسات ، يتم نقل الكانتيليفر في اتجاه العينة. وهذا يؤدي إلى cantilever جعل الاتصال مع العينة وبعد ذلك إلى الانحناء في الاتجاه المعاكس للواحد الذي انتقلت أصلا. في نفس الوقت، يحدث المسافة البادئة للعينة بمقدار معين. من أجل استخدام نموذج Hertz-fit ، يجب حساب المسافة البادئة للعينة وتعديلها لعزل معلمة الانحناء cantilever. المعلمة التي تصف العينة هي نسبة بواسون ، والتي تعتمد على المواد التي تم التحقيق فيها. بالنسبة للعينات البيولوجية الناعمة ، غالبًا ما يتم تعيين نسبة بواسون إلى 0.515. كما ذكر أعلاه ، شكل indenter المستخدمة ذات الصلة لحساب معامل يونغ ، لأنه يملي التمديدات التي يجب إجراؤها على معادلة هيرتز الأصلية. في حالة التجربة الموصوفة ، يفترض شكل indenter كروية بسبب استخدام microspheres.
وفي حين أن AFM قد توفر إمكانيات جديدة ومثيرة للاهتمام لجمع البيانات، فإن اتساق وموثوقية البيانات التي تم إنتاجها تعتمد بشدة على خبرة المشغل المعني. العديد من الخطوات المذكورة أعلاه عرضة للخطأ البشري وتتطلب الصبر والدقة لتنفيذها بشكل صحيح.
نظرًا للعديد من المتغيرات الحساسة التي يمكن أن تؤثر على نتائج القياس ، لا يمكن تعميم قيم القوة المطلقة المبلغ عنها في هذه الدراسة ولكنها محددة لإعدادنا التجريبي. عند استخدام هذه التقنية لتقييم انحطاط الأنسجة من الغضاريف، بعض القياسات تطبيع على أنماط مكانية مختلفة تحتاج أولا إلى إجراء لتوسيع نطاق النتائج إلى إعدادات القياس التجريبية المحددة الحالية. العلاقة بين مرونة مختلفة مودولي والأنماط المكانية، ومع ذلك، لن تتأثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر المؤلفين المشاركين من المنشور الأصلي على مساعدتهم ودعمهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
