जल्दी ऑस्टियोआर्थराइटिस का पता लगाने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का आवेदन
Summary
हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके आर्टिकुलर उपास्थि में सेलुलर स्तर पर प्रारंभिक ऑस्टियोआर्थर्मेटिक परिवर्तनों की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
कोशिकाओं और ऊतकों के जैव यांत्रिक गुण न केवल उनके आकार और कार्य को विनियमित करते हैं बल्कि उनकी जीवन शक्ति को बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। लोच में परिवर्तन कैंसर या ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) जैसी प्रमुख बीमारियों की शुरुआत का प्रचार या ट्रिगर कर सकते हैं। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से सूक्ष्म पैमाने पर विशिष्ट जैविक लक्ष्य संरचनाओं के जैव यांत्रिक गुणों की विशेषता के लिए एक मजबूत उपकरण के रूप में उभरा है, जो पिकोन्यूटन से माइक्रोन्यूटन तक छोटी सीमा में बलों को मापने के लिए है। मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों में बायोमैकेनिकल गुणों का विशेष महत्व है, जो उच्च स्तर के तनाव के अधीन हैं। उपास्थि की अपक्षयी बीमारी के रूप में ओए के परिणामस्वरूप पेरिकोशियलर मैट्रिक्स (पीसीएम) और उनके बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड कॉन्ड्रोसाइट्स की स्थानिक पुनर्व्यवस्था में व्यवधान होता है। पीसीएम और ईसीएम में व्यवधान उपास्थि के जैव यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है। वर्तमान अध्ययन में हमने कोन्ड्रोसाइट्स के विशिष्ट स्थानिक पैटर्न परिवर्तनों के संबंध में इन परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एएफएम का उपयोग किया। प्रत्येक पैटर्न परिवर्तन के साथ, पीसीएम और ईसीएम दोनों के लिए लोच में महत्वपूर्ण परिवर्तन देखे गए। स्थानीय लोच को मापने इस प्रकार ओए में स्थानीय ऊतक पतन की डिग्री के बारे में सीधे निष्कर्ष निकालने के लिए अनुमति देता है।
Introduction
आर्टिकुलर उपास्थि एक अवास्कुलर, एन्यूरल टिश्यू है। विरल रूप से बिखरे हुए कॉन्ड्रोसाइट्स एक विशाल बाह्य मेट्रिक्स (ईसीएम) का उत्पादन, व्यवस्थित और बनाए रखते हैं जिसमें वे एम्बेडेड होते हैं। ईसीएम के एक अलग और विशेष भाग के रूप में, कॉन्ड्रोसाइट्स विशेष मैट्रिक्स की एक पतली परत से घिरे हुए हैं जिसे पेरिसेल्युलर मैट्रिक्स (पीसीएम) के रूप में जाना जाता है। पीसीएम एक मेचनोसेंसिटिव सेल-मैट्रिक्स इंटरफेस1 के रूप में कार्य करता है जो कॉन्ड्रोसाइट्स2 की रक्षा करता है और उनके बायोसिंथेटिक रिस्पांस3को मिलाता है। जैसा कि पहले वर्णित4,स्वस्थ उपास्थि में, कॉन्ड्रोसाइट्स विशिष्ट, विशिष्ट स्थानिक पैटर्न में व्यवस्थित किए जाते हैं जो प्रत्येक ऊतक परत और संयुक्त4,,5 के लिए विशिष्ट होते हैं और संयुक्त-विशिष्ट यांत्रिक लोडिंग तंत्र6पर निर्भर करते हैं। ये पैटर्न स्वस्थ उपास्थि में जोड़े और तार से ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) की शुरुआत के साथ डबल स्ट्रिंग ्स तक बदल जाते हैं। रोग की आगे की प्रगति के साथ कोन्ड्रोसाइट्स छोटे समूह ों का निर्माण करते हैं, जो उन्नत ओए में बड़े समूहों में आकार में धीरे-धीरे बढ़ते हैं। किसी भी संगठनात्मक संरचना का पूर्ण नुकसान और एपोप्टोसिस को शामिल करना अंतिम चरण में देखा जाता है। इस प्रकार, कोन्ड्रोसाइट सेलुलर व्यवस्था का उपयोग ओए प्रगति4के लिए छवि आधारित बायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है।
कोशिकाओं और ऊतकों के जैव यांत्रिक गुण न केवल उनके आकार और कार्य को विनियमित करते हैं बल्कि उनकी जीवन शक्ति को बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। लोच में परिवर्तन कैंसर या ओए जैसी प्रमुख बीमारियों की शुरुआत का प्रचार या ट्रिगर कर सकते हैं। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से एक सूक्ष्म पैमाने पर विशिष्ट जैविक लक्ष्य संरचनाओं के जैव यांत्रिक गुणों की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है, जो पिकोन्यूटन से माइक्रोन्यूटन तक बल की एक विस्तृत श्रृंखला को मापता है। एएफएम का प्रमुख अनुप्रयोग सबनैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन7पर नमूनों की सतह स्थलाकृति और यांत्रिक गुणों को मापना है । माप उपकरण में तीन मुख्य घटक होते हैं: 1) एक एएफएम जांच, जो एक तेज टिप है जो कैंटिलीवर पर चढ़कर है और इसका उपयोग नमूने की सतह के साथ सीधी बातचीत के लिए किया जाता है। जब बल कैंटिलीवर पर लागू होता है, तो मापा ऊतक के गुणों के अनुसार उत्तरार्द्ध का विरूपण होता है। 2) एक ऑप्टिकल सिस्टम जो कैंटिलीवर पर लेजर बीम प्रोजेक्ट करता है, जिसे तब डिटेक्टर यूनिट में परिलक्षित किया जाता है। 3) एक फोटोडायोड डिटेक्टर जो कैंटिलीवर से विक्षेपित प्रकाश को पकड़ता है। यह कैंटिलीवर द्वारा लेजर विक्षेप के बारे में प्राप्त जानकारी को एक बल वक्र में परिवर्तित करता है जिसका विश्लेषण किया जा सकता है।
इस प्रकार, एएफएम का मुख्य सिद्धांत एएफएम जांच और नमूने के लक्ष्य संरचना के बीच कार्य करने वाले बल का पता लगाना है। प्राप्त बल घटता लोच, चार्ज वितरण, चुंबकीकरण, उपज तनाव, और लोचदार प्लास्टिक विरूपण गतिशीलता8जैसे नमूना सतह पर लक्ष्य संरचनाओं के यांत्रिक गुणों का वर्णन करते हैं। अन्य इमेजिंग तकनीकों पर एएफएम का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एएफएम का उपयोग ऊतक ों को नुकसान पहुंचाए बिना एक देशी राज्य में मध्यम या ऊतकों में लाइव कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए किया जा सकता है। एएफएम तरल या शुष्क दोनों स्थितियों में काम कर सकता है। सैंपल तैयार करने की कोई जरूरत नहीं है। एएफएम एक नमूने को छवि बनाने और शारीरिक परिस्थितियों के पास मौजूद नमूनों में एक साथ अपने यांत्रिक गुणों को मापने की संभावना प्रदान करता है। वर्तमान अध्ययन में हम देशी आर्टिकुलर उपास्थि में पीसीएम और ईसीएम की लोच को मापने के द्वारा ओए प्रगति का आकलन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। स्थानीय ऊतक पतन की डिग्री के साथ chondrocytes के स्थानिक संगठन के सहसंबंध OA के जल्दी पता लगाने के लिए एक पूरी तरह से नया परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है । इन पैटर्न की कार्यात्मक प्रासंगिकता का मूल्यांकन अब तक नहीं किया गया है, लेकिन । क्योंकि आर्टिकुलर उपास्थि का प्रमुख कार्य कम घर्षण पर लोड असर होता है, ऊतक में लोचदार गुण होने चाहिए। एएफएम न केवल ईसीएम की लोच को मापने की अनुमति देता है बल्कि उनके पीसीएम में एम्बेडेड स्थानिक सेलुलर पैटर्न की भी अनुमति देता है। कॉन्ड्रोसाइट्स के स्थानिक पैटर्न परिवर्तन के साथ लोच का मनाया संबंध इतना मजबूत है कि अकेले लोच को मापने से स्थानीय ऊतक पतन के स्तरीकरण की अनुमति हो सकती है।
पीसीएम और ईसीएम के लोचदार मोडुली का मूल्यांकन 35 माइक्रोन-थिन खंडों में किया गया था, जो एक उल्टे चरण विपरीत माइक्रोस्कोप में एकीकृत एएफएम प्रणाली का उपयोग करके एकीकृत था जिसने उपास्थि नमूने के एक साथ दृश्य की अनुमति दी थी। यह प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला9 से पहले से प्रकाशित एक अध्ययन पर आधारित है और विशेष रूप से वर्णन करता है कि कैसे chondrocytes की स्थानिक व्यवस्था की विशेषता है और कैसे उनके जुड़े पीसीएम और ECM की लोच को मापने के लिए । कॉन्ड्रोसाइट्स के प्रत्येक पैटर्न परिवर्तन के साथ, लोच में महत्वपूर्ण परिवर्तन भी पीसीएम और ईसीएम दोनों के लिए देखे जा सकते हैं, जिससे इस तकनीक का उपयोग उपास्थि के पतन के चरण को सीधे मापने के लिए किया जा सकता है।
यह मान्य दृष्टिकोण स्थूल ऊतक क्षरण वास्तव में प्रकट होने से पहले प्रारंभिक चरणों में ओए प्रगति और चिकित्सीय प्रभावों का मूल्यांकन करने का एक नया तरीका खोलता है। लगातार एएफएम माप प्रदर्शन एक दुरूह प्रक्रिया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम बताते हैं कि एएफएम द्वारा मापा जाने वाला नमूना कैसे तैयार किया जाए, कैंटिलीवर की तैयारी से शुरू होने वाले वास्तविक एएफएम मापन को कैसे करें, एएफएम को कैसे कैलिब्रेट करें, और फिर माप कैसे करें। कदम-दर-कदम निर्देश विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने और प्रसंस्करण और व्याख्या के लिए बुनियादी रणनीतियां प्रदान करने के लिए एक स्पष्ट और संक्षिप्त दृष्टिकोण देते हैं। चर्चा अनुभाग भी इस कठोर विधि के सबसे आम नुकसान का वर्णन करता है और उपयोगी समस्या निवारण युक्तियां प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नैनोस्केल स्तर पर जैविक सामग्रियों के जैव यांत्रिक गुणों को मापने के लिए एक उपन्यास और शक्तिशाली तकनीक के रूप में एएफएम का उपयोग करते हुए, हमने मानव ऑस्टियोआर्थरिक आर्टिकुलर उपास्थि में ईसीएम और पीस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी मदद और समर्थन के लिए मूल प्रकाशन से हमारे सह लेखकों का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
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