Summary
우리는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 사용하여 관절 연골의 세포 수준에서 초기 골관절염 변화를 조사하는 방법을 제시합니다.
Abstract
세포와 조직의 생체 역학적 특성은 모양과 기능을 조절할 뿐만 아니라 활력을 유지하는 데에도 중요합니다. 탄력의 변화는 암이나 골관절염 (OA)과 같은 주요 질병의 발병을 전파하거나 유발할 수 있습니다. 원자력 현미경 검사법(AFM)은 피코뉴턴에서 마이크로뉴턴에 이르는 범위에서 측정력을 측정하는 미세한 스케일에서 특정 생물학적 표적 구조의 생체역학적 특성을 정성적및 정량적으로 특성화하는 강력한 도구로 부상했습니다. 생체 역학적 특성은 높은 수준의 변형을 받는 근골격계 조직에서 특히 중요합니다. 연골의 퇴행성 질환으로서 OA는 세포외 매트릭스(ECM)에 내장된 연골 세포의 세포질(PCM)과 공간 적 재배열의 중단을 초래한다. PCM 및 ECM의 붕괴는 연골의 생체 역학적 특성의 변화와 관련이 있습니다. 본 연구에서 우리는 연골 세포의 특정 공간 패턴 변화와 관련하여 이러한 변화를 정량화하기 위해 AFM을 사용했습니다. 각 패턴 변화에 따라 PCM 및 ECM 모두에 대해 탄성의 상당한 변화가 관찰되었습니다. 따라서 국소 탄성을 측정하면 OA에서 국소 조직 변성의 정도에 대한 직접적인 결론을 도출 할 수 있습니다.
Introduction
관절 연골은 혈관, 신경 조직입니다. 드물게 산란된 연골세포는 광대한 세포외 기종(ECM)을 생성, 구성 및 유지합니다. ECM의 뚜렷하고 전문화된 부분으로서, 연골세포는 pericellular 매트릭스 (PCM)로 알려져 있는 전문화한 매트릭스의 얇은 층으로 포위됩니다. PCM은 연골세포2를 보호하고 생합성 반응을 조절하는 메카노민성 세포 매트릭스 인터페이스1의 역할을 한다3. 앞서 설명한바와 같이,건강한 연골에서, 연골세포는 각 조직층 및 관절4,,5에 특이적이고 관절 특이적 기계적 로딩 메커니즘에 의존하는 특이적이고 뚜렷한 공간 패턴으로 배열된다6. 이러한 패턴은 건강한 연골의 쌍과 문자열에서 골관절염 (OA)의 발병과 함께 이중 문자열로 변경됩니다. 질병의 추가 진행과 함께 연골 세포는 작은 클러스터를 형성하고 고급 OA에서 큰 클러스터로 점차 크기가 증가합니다. 모든 조직 구조의 완전한 손실과 사멸의 유도는 최종 단계 OA에서 관찰됩니다. 따라서, 연골세포 세포 배열은 OA 진행에 대한 이미지 기반 바이오마커로서 사용될 수있다 4.
세포와 조직의 생체 역학적 특성은 모양과 기능을 조절할 뿐만 아니라 활력을 유지하는 데에도 중요합니다. 탄력성의 변화는 암이나 OA와 같은 주요 질병의 발병을 전파하거나 유발할 수 있습니다. 원자력 현미경 검사법(AFM)은 피코뉴턴에서 마이크로뉴턴에 이르는 광범위한 힘을 측정하는 현미경 규모의 특정 생물학적 표적 구조의 생체역학적 특성을 정성적및 정량적으로 특성화하는 강력한 도구로 부상했습니다. AFM의 주요 응용 프로그램은 서브 나노 미터 해상도7에서샘플의 표면 지형 및 기계적 특성을 측정하는 것입니다. 측정 장치는 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다: 1) 캔틸레버에 장착된 날카로운 팁이며 시료 표면과 직접 상호 작용하는 데 사용되는 AFM 프로브. 힘이 캔틸레버에 가해지면 측정 된 조직의 특성에 따라 후자의 변형이 발생합니다. 2) 레이저 빔을 캔틸레버에 투사한 다음 검출기 장치에 반사되는 광학 시스템입니다. 3) 캔틸레버에서 반사된 빛을 포착하는 포토다이오드 검출기입니다. 캔틸레버에 의한 레이저 편향에 관한 수신된 정보를 분석할 수 있는 힘 곡선으로 변환합니다.
따라서, AFM의 주요 원리는 AFM 프로브와 샘플의 표적 구조 사이에서 작용하는 힘의 검출이다. 얻어진 힘 곡선은 탄성, 전하 분포, 자화, 항복 응력 및 탄성 소성 변형 역학8과같이 샘플 표면에 대상 구조의 기계적 특성을 설명합니다. 다른 이미징 기술에 비해 AFM의 중요한 장점은 AFM이 조직을 손상시키지 않고 기본 상태에서 중간 또는 조직에서 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. AFM은 액체 또는 건조 조건에서 모두 작동 할 수 있습니다. 샘플 준비에 대한 요구 사항은 없습니다. AFM은 생리적 조건에 가까운 표본에서 동시에 시편을 이미지화하고 기계적 특성을 측정할 수 있는 가능성을 제공합니다. 본 연구에서 우리는 네이티브 관절 연골에서 PCM 및 ECM의 탄성을 측정하여 OA 진행을 평가하는 새로운 접근법을 설명합니다. 국소 조직 변성의 정도와 연골 세포의 공간 조직의 상관 관계는 OA의 조기 발견을위한 완전히 새로운 관점을 제공합니다. 그러나 이러한 패턴의 기능적 관련성은 지금까지 평가되지 않았습니다. 관절 연골의 주요 기능은 낮은 마찰에서 부하 베어링이기 때문에, 조직은 탄성 특성을 가지고 있어야합니다. AFM은 ECM의 탄성뿐만 아니라 PCM에 내장된 공간 셀룰러 패턴을 측정할 수 있습니다. 연골 세포의 공간 패턴 변화와 탄성의 관찰 상관 관계는 탄성을 측정하는 것만으로국부 조직 변성의 계층화를 허용할 수 있도록 강하다.
PCM 및 ECM의 탄성 계수는 연골 샘플의 동시 시각화를 허용하는 반전된 상 대비 현미경에 통합된 AFM 시스템을 사용하여 35 μm-thin 섹션에서 평가하였다. 이 프로토콜은 이미 우리의 실험실9에서 간행된 연구 결과에 근거를 두고 및 특히 연골 세포의 공간 배열을 특성화하는 방법과 관련 PCM 및 ECM의 탄성을 측정하는 방법을 기술합니다. 연골 세포의 각 패턴 변화와 함께, 탄성의 중요한 변화는 또한 PCM과 ECM 모두에 대해 관찰 될 수있다, 이 기술은 직접 연골의 변성 단계를 측정하는 데 사용할 수 있도록.
이 검증된 접근은 거시적인 조직 분해가 실제로 나타나기 시작하기 전에 초기 단계에서 OA 진행 및 치료 효력을 평가하는 새로운 쪽을 엽니다. AFM 측정을 일관되게 수행하는 것은 힘든 과정입니다. 다음 프로토콜에서는 AFM에 의해 측정될 샘플을 준비하는 방법, 캔틸레버 의 준비로 시작하는 실제 AFM 측정을 수행하는 방법, AFM을 교정하는 방법 및 측정을 수행하는 방법을 설명합니다. 단계별 지침은 신뢰할 수 있는 데이터를 가져오고 이를 처리하고 해석하기 위한 기본 전략을 제공하기 위한 명확하고 간결한 접근 방식을 제공합니다. 또한 토론 섹션에서는 이 엄격한 방법의 가장 일반적인 함정에 대해 설명하고 유용한 문제 해결 팁을 제공합니다.
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Protocol
인간 연골 샘플은 독일 튜빙겐 대학 병원의 정형외과 과에서 총 무릎 관절 성형술을 받은 환자들로부터 얻어졌으며, 무릎의 말기 OA를 위해 독일 로텐부르크 a.N.의 윙호퍼 병원이 되었다. 전체 부서, 기관 및 지역 윤리위원회의 승인을 받은 후 연구 개시 전에(프로젝트 번호 674/2016BO2). 서면 통보 된 동의는 참여하기 전에 모든 환자로부터 수신되었습니다. 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었다.
1. 견본 준비
- 극저온 절편을위한 연골 준비
- 무릎 관절의 퇴행성 변화를 평가하기 위해, 환자로부터 조직 절제술 후 대퇴 부도덕의 하중 베어링 영역에서 얻은 관절 연골 샘플을 가져 가라.
참고 : 조사 샘플은 여전히 내부 및 외부 표면에 대한 조직 배향의 명확한 식별을 허용하기 위해 뼈의 적어도 얇은 층을 포함해야, 따라서 또한 최상위 연골 층의 표준화 된 조직 수확을 허용. 연골은 수술 후 24 시간까지 AFM 측정에 사용할 수 있습니다. 이 조직은 사용 전에 2% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신과 1.2% (v/v) 암포테리신 B를 사용하여 혈청이 없는 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에 보관할 수 있습니다. 그러나 24시간 이상 샘플을 저장하면 조직 부종으로 인해 AFM 측정에 아티팩트가 발생할 수 있습니다. - 메스의 도움으로 관절 연골을 전체적으로 자르고 그 후 극저온 장치에서 저온에서 동결되는 극저온 손잡이에 수용성 내장 매체에 연골 샘플을 내장합니다.
참고 : 냉동 배지는 둘러싸는 조직을 안정화시다. 또한 삽입 매체와 함께 연골 샘플의 동결을 초래한다. 뼈에서 연골을 절단 할 때, 조직의 방향을 추적. 저온 절에 내장 된 조직은 연골의 상부 층 (즉, 관절 표면)이 블레이드를 향하는 방식으로 배치해야합니다. 조직은 포함 매체에 의해 완전히 덮여 있어야합니다.
- 무릎 관절의 퇴행성 변화를 평가하기 위해, 환자로부터 조직 절제술 후 대퇴 부도덕의 하중 베어링 영역에서 얻은 관절 연골 샘플을 가져 가라.
- 연골의 극저온 절편
- 표준 극저온을 사용하여, 동결된 수용성 임베딩 배지에 내장되어 있는 관절 연골의 최상층(즉, 관절 표면)으로부터 35 μm의 두께로 조직을 단면화한다.
참고: 총 300 μm(약 9개 섹션에 해당)을 단면화하여 분석에 사용할 수 있습니다. 제안된 300 μm의 한계는 일반적으로 관절 연골과 같은 hyaline 연골에서 형광 현미경으로 얻을 수 있는 시각적 침투 깊이에 해당한다. 따라서, 우세한 국소 공간 패턴에 따라 연골을 분류한 다음 해당 섹션에서 이러한 패턴을 측정할 수 있다. - 유리 슬라이드의 단면을 수집하고 인산완충식염수(PBS)로 3x 섹션을 헹구어 수용성 임베딩 매체를 제거합니다.
- 표준 극저온을 사용하여, 동결된 수용성 임베딩 배지에 내장되어 있는 관절 연골의 최상층(즉, 관절 표면)으로부터 35 μm의 두께로 조직을 단면화한다.
- AFM 호환 페트리 접시에 연골 섹션의 접착
참고: AFM은 시료의 기계적 들여쓰기에 의해 데이터를 수집하기 때문에 정밀한 측정을 위해 섹션을 고정해야 합니다.- 생체 적합성 샘플 접착제로 35 μm 두께의 섹션을 AFM 장치와 호환되는 조직 배양 접시에 부드럽게 붙입니다. 이렇게하려면, 접착제의 2−3 방울을 가지고 섹션의 가장자리가 끝날 위치에 조직 문화 접시에 넣어. 이제 접착제에 연골 섹션을 넣고 조직 배양 접시의 표면에 단단히 붙일 수 있습니다.
참고: 35 μm 두께의 hyaline 관절 연골 섹션은 컬링에 매우 취약하지 않습니다. 그러나 버퍼 매체에서 샘플을 제거 할 때 컬링이 발생하는 경우 가능한 한 적은 유체가 샘플에 달라 붙는지 확인하십시오. 여분의 물이 마르자마자, 직접 세포 배양 접시의 표면에 고정되도록 접착제의 분산 된 반점에 조직을 확산. 접착제는 전체 단면이 아닌 샘플 가장자리에만 얇은 레이어에 적용됩니다. 접착제 영역에서 멀리 떨어진 시료의 해당 부분만 측정하여 접착제가 측정을 방해할 가능성을 제거합니다. - 접착제와 조직이 제대로 결합 될 수 있도록 2 분 동안 실온 (RT)에서 섹션을 배양. 그런 다음 L-글루타민이 없고 중탄산나트륨없이 Leibovitz의 L-15 배지로 섹션을 덮어 완전히 잠기게하십시오.
참고 : 고정 또는 불충분 한 접착제 응용 프로그램 동안 샘플의 갑작스런 움직임은 배양 접시에서 조직의 분리를 초래하는 일반적인 실수입니다. 또한, 레이보위츠 배지를 적용하는 것은 매체에 의해 생성된 "파도"로 인해 표면에서 샘플을 분리하지 않도록 부드러운 방식으로 이루어져야 한다. - 측정이 수행될 때까지 37°C에서 표준 세포 배양 인큐베이터에 접착된 섹션과 함께 페트리 접시를 놓습니다.
참고 : 조직 섹션이 안정적이고 각 단계를 천천히 수행하여 조직 배양 접시의 표면에서 분리되지 않도록하십시오.
- 생체 적합성 샘플 접착제로 35 μm 두께의 섹션을 AFM 장치와 호환되는 조직 배양 접시에 부드럽게 붙입니다. 이렇게하려면, 접착제의 2−3 방울을 가지고 섹션의 가장자리가 끝날 위치에 조직 문화 접시에 넣어. 이제 접착제에 연골 섹션을 넣고 조직 배양 접시의 표면에 단단히 붙일 수 있습니다.
2. 캔틸레버 준비 (마이크로 스피어 접착)
- AFM 장치 준비 및 마이크로스피어 희석
- 공기 측정을 위해 지정된 유리 블록에 캔틸레버를 놓고 스프링으로 고정한 다음 AFM 헤드에 유리 블록을 장착합니다.
- 100 % 에탄올 (100 입자 / 10 μL)에서 마이크로 스피어를 희석하고 10 초 동안 초음파를 희석하여 마이크로 스피어가 분리되고 함께 뭉치지 않도록하십시오.
- 접착 을 위한 설정 준비
- 70% 에탄올로 유리 슬라이드를 청소하고 AFM 장치의 샘플 홀더에 장착합니다.
참고: 슬라이드를 클렌징하면 접착 과정을 방해할 수 있는 먼지 얼룩이 슬라이드 표면에 쌓이는 것을 방지할 수 있습니다. - 슬라이드 중간에 마이크로스피어 현탁액의 2 μL을 놓고 2 μL의 접착제를 마이크로스피어 현탁액 근처에 놓습니다.
참고: 마이크로스피어 현탁액과 접착제를 서로 가까이 두면 접착제와 마이크로스피어 간에 캔틸레버가 빠르게 전환될 수 있습니다. 캔틸레버를 접착제에 담그고 마이크로스피어와 접촉하는 것 사이의 전이가 너무 길면 접착제가 결국 굳어져 접착특성을 잃게 됩니다. - 마이크로스피어 현탁액의 에탄올 액체를 공기 건조시키고, 마이크로스피어를 제자리에 둡렛으로 남겨 둡자.
- 70% 에탄올로 유리 슬라이드를 청소하고 AFM 장치의 샘플 홀더에 장착합니다.
- 캔틸레버 팁에 마이크로스피어 접착
- 팁이 접착제로 덮일 때까지 10 μm 단계에서 스테퍼 모터의 도움으로 캔틸레버를 접착제에 수동으로 담급급합니다. 접착제가 빨리 마르면 이 단계를 신속하게 수행하십시오.
- 캔틸레버를 다시 100 μm으로 철회하고 마이크로스피어쪽으로 이동한 다음 캔틸레버 팁을 단일 마이크로스피어 바로 위에 놓습니다.
- 힘 분광법 측정을 실행하여 캔틸레버 팁을 선택한 마이크로스피어에 담그고 표 1에표시된 매개 변수를 사용합니다.
참고: 이 단계를 실행하면 마이크로스피어 표면의 측정을 사용하여 캔틸레버 팁과 마이크로스피어 사이의 접촉을 설정합니다. 표 1에 나타낸 비교적 긴 접촉 시간은 접착제와 마이크로스피어 사이의 충분한 접합 시간을 허용한다. 이 단계에서 얻어진 힘 거리 곡선은 캔틸레버 팁에 마이크로스피어를 접착하는 부산물로 생성되며 추가 분석을 위해 처리되지 않습니다. - 마이크로스피어가 캔틸레버에 부착되면 캔틸레버가 상단에 장착된 유리 블록을 철회한 다음 현미경에서 AFM 헤드를 제거합니다. 마지막으로 AFM 헤드에서 유리 블록과 캔틸레버를 분리합니다.
- 캔틸레버를 65°C에서 2시간 동안 인큐베이션하고 측정을 시작하기 전에 RT에서 밤새 건조시키십시오.
참고: 캔틸레버의 인큐베이션은 접착제의 접착 특성을 향상시켜 캔틸레버-마이크로스피어 복합체를 보다 안정적으로 렌더링합니다.
3. 측정을 위한 AFM 장치 준비
- 상부 표면이 AFM 홀더와 직선및 평행하도록 AFM 홀더의 액체 환경에서 측정하기 위해 지정된 유리 블록을 조정합니다.
- 핀셋의 도움으로, 조심스럽게 유리 블록의 표면에 선택한 캔틸레버를 장착, 그래서 마이크로 스피어와 AFM 팁은 광택 광학 평면 위에 돌출.
참고: 캔틸레버의 팁은 AFM의 레이저를 광검출기에 반사하기 위해 연마된 평면 위로 돌출되어야 합니다. 유리 블록의 광택 광학 표면이 긁히지 않도록 캔틸레버를 AFM에 배치 할 때 매우 주의하십시오. 유리 블록을 긁으면 레이저 정렬조정에 어려움이 생길 수 있으며 후속 측정을 방해할 수 있습니다. - 캔틸레버는 기계적 압력을 받을 수 있으므로 제자리에 고정해야 합니다. 금속 스프링을 블록의 홈으로 밀어 넣고 핀셋의 도움으로 스프링으로 캔틸레버 상단을 고정하여 유리 블록의 캔틸레버를 안정화합니다.
- AFM 헤드에 캔틸레버가 있는 유리 블록을 조심스럽게 놓고 통합 잠금 메커니즘으로 고정합니다. 캔틸레버가 올바른 방향으로 배치되도록 스프링이 왼쪽을 향하고 있는지 확인합니다. 그런 다음 AFM 장치에 캔틸레버로 AFM 헤드를 장착합니다.
4. 캔틸레버의 샘플 및 교정
참고 : 여기에서 장치의 교정은 샘플 조직없이 Leibovitz의 매체로 채워진 페트리 접시의 깨끗한 표면에 힘 곡선을 실행하여 수행됩니다. 캘리브레이션은 또한 샘플 없이 AFM 배지로만 채워진 별도의 제어 AFM 접시를 사용하여 수행될 수 있다.
- AFM 장치에 샘플 장착
- 1.3.3단계에서 준비된 페트리 접시를 AFM 샘플 홀더에 놓습니다.
- 페트리 접시 히터를 켜고 37 °C로 설정합니다. 조직 배양 접시가 최적의 온도(즉, 20분)에 도달하도록 합니다.
- AFM 헤드의 매질 응결을 방지하기 위해 캔틸레버 어셈블리의 베이스에 보호 호일을 놓습니다.
- 장치 교정
- 소프트웨어(재료표)를열고 레이저 정렬 창과 접근 매개 변수 설정을 묘사한 창을 엽니다. 그런 다음 스테퍼 모터, 레이저 라이트 및 CCD 카메라를 켭니다.
- 현미경의 CCD 카메라를 사용하여 캔틸레버를 시각화하고 식별합니다. 스테퍼 모터 기능을 사용하여 캔틸레버가 매질에 완전히 잠길 때까지 100 μm 단계에서 캔틸레버를 낮춥습니다.
참고: 액체에 캔틸레버가 잠기면 CCD 카메라를 통해 시각적으로 식별할 수 있습니다. 캔틸레버 팁은 물 표면을 부수면 물 속에서 쉽게 눈에 띄는 원형 반사를 생성합니다. - 조정 나사를 사용하여 캔틸레버 위에 레이저를 직접 사용하십시오.
참고: 나사를 과도하게 감지 마십시오. 캔틸레버는 아래에서 볼 수 있으며 레이저 빔은 위에서 나옵니다. - 레이저가 캔틸레버에 배치되면 AFM 장치의 나사로 레이저 빔을 조정하여 반사된 빔이 광검출기의 중앙에 떨어지도록 합니다. 레이저 정렬 기능을 사용하여 레이저 빔의 위치를 계속 모니터링하십시오.
참고: 검출기는 캔틸레버에 의해 반사되는 레이저 빔의 편향을 포착하여 전기 신호로 변환합니다. - 레이저 캔틸레버 조정 후 합계 신호는 1V 이상이어야 하며 측면 및 수직 편향은 0에 가까워야 합니다. 이러한 값을 얻지 못하면 광검출기를 조정합니다.
- 교정력 곡선 구이
- AFM 접시의 표면에 도달하여 측정을 시작하려면 표 2에제공된 접근 변수를 사용하여 스캐너 접근 방식을 실행합니다. 조직 배양 접시의 바닥에 도달하면 캔틸레버를 100 μm씩 철회하십시오.
참고 : 이 시점에서 프로브는 조직 배양 접시의 바닥에서 정확히 100 μm입니다. - RUN 매개 변수를 설정하고 표 3에표시된 매개 변수를 조정합니다. RUN 버튼을 클릭하여 측정을 시작하고 보정 힘 거리 곡선을 구합니다.
참고: 여기서 얻은 힘 곡선은 그림 1에나와 있습니다. - 교정 힘 거리 곡선에서 소프트웨어에서 리트랙션된 곡선의 선형 맞춤 에 대한 영역을 선택합니다.
참고: 선형 맞춤은 캔틸레버의 감도를 측정하기 위해 수행됩니다. 선형 맞춤이 제자리에 있으면 소프트웨어에 의해 값이 저장됩니다. 스프링 상수 측정 또는 캔틸레버의 열 노이즈는 이후에 소프트웨어에 의해 계산됩니다. - 측정이 37°C의 온도에서 매체로 수행됨에 따라 소프트웨어에서 온도 변수를 37°C로 설정하여 생리적 조건을 가능한 한 가깝게 모방합니다.
참고: 보정이 끝나면 수직 편향이 저장되고 광다이오드 검출기에 의해 원래 등록된 장치인 볼트(V) 대신 힘의 단위인 뉴턴(N)에 표시됩니다.
- AFM 접시의 표면에 도달하여 측정을 시작하려면 표 2에제공된 접근 변수를 사용하여 스캐너 접근 방식을 실행합니다. 조직 배양 접시의 바닥에 도달하면 캔틸레버를 100 μm씩 철회하십시오.
5. AFM을 통해 탄성 측정을 수행하여 ECM 및 PCM의 생체 역학 적 특성화
- 연골 섹션에서 연골 세포 패턴을 식별
- AFM 시스템에 통합 된 단계 대비 현미경에서 연골 섹션을 관찰하고 골관절염 무릎에서 관절 연골의 특정 세포 패턴10을 식별 : 단일 문자열 (건강한 조직 영역), 이중 문자열 (시작 조직 변성), 크고 작은 클러스터 (모두 고급 조직 변성). 그림 2A-D를 참조하십시오.
- 특정 원하는 패턴이 확인되면 매트릭스 유형(PCM 또는 ECM)당 선택한 패턴당 두 개의 사이트를 측정하고 각 측정 사이트에서 9개의 측정 반복을 수행합니다(그림2E,F). 가능한 부정확성을 고려할 수 있을 만큼 큰 샘플 크기를 확인합니다.
참고: PCM 측정의 경우 캔틸레버를 셀에 가까운 곳에 배치합니다(그림 2E,F의빨간색 원참조). ECM의 측정을 수행하기 위해, 어떤 셀이 없는 영역을 선택하고(도 2E,F의파란색 영역으로 나타남) 단계 5.2에 설명된 바와 같이 들여쓰기를 수행한다.
- 대상 사이트의 들여쓰기
- 캔틸레버가 조직 위에 100 μm 위에 위치하도록 후퇴 한 다음 접근법을 수행하여 후속 측정을위한 시작 위치가 됩니다.
- 측정할 패턴의 PCM 또는 ECM에 초점을 맞추고 해당 시점에서 컴퓨터 마우스를 수정합니다.
참고: 마우스는 들여쓰기의 대상 사이트에 대한 시각적 마커역할을 합니다. 초점이 캔틸레버 팁으로 이동하면 조직 구조가 구별되지 않거나 흐려집니다. - 이제 프로브에 초점을 맞추고 프로브 의 끝을 이전에 컴퓨터 화살표로 고정한 지점으로 이동합니다. 그런 다음 캔틸레버의 보정을 통해 얻은 설정점 매개변수를 사용하여 RUN으로측정을 시작합니다.
참고: 단일 문자열의 PCM을 측정하여 얻은 예시적인 힘 곡선은 보충 그림 1에나와 있습니다.
6. 데이터 처리
참고: 탄성 계수의 데이터 분석 또는 측정은 앞서11,,12에설명된 Hertz 모델을 사용하여 수행됩니다. 인덴터의 형상은 팁에 마이크로스피어의 사용으로 인해 구형이었고 푸아송의 비율은 이전 문헌13,,14,,15에기초하여 0.5로 유지되었다.
- AFM 장치에서 얻은 데이터와 호환되는 데이터 처리소프트웨어(자료 표)를엽니다.
- 힘 거리 곡선을 처리하기 위해 소프트웨어에서 Hertz 모델을 선택합니다. 푸아송 비율을 0.5로 설정하고 팁 모양을 구형 및 팁 반지름 12.5μm로 선택합니다.
- 모든 매개 변수가 조정되면 결과가 장착되고 영의 계수는 소프트웨어에 의해 계산되고 표시됩니다.
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Representative Results
현에서 이중 현까지의 생리학적 모델을 따라, 작고 마지막으로 큰 클러스터에 이르기까지, ECM(그림3A)과PCM(그림3B)은각각의 패턴 변화 사이에서 탄성 계수가 현저히 감소하였다. 유일한 예외는 문자열과 이중 문자열 간의 ECM 차이(p = 0.072)였습니다. 결과는 ECM/PCM 비율(도4B)이크게 변하지 않은 반면, ECM과 PCM 사이의 절대적인 탄성 차이의 현저한 감소가 관찰되었다는 것을 보여준다(도4A). 더욱이, 결과는 ECM/PCM 비 또는 관련 셀룰러 공간 변화에 관한 어떠한 유의한 연관성도 나타내지 않는다(r = -0.099, p = 0.281).
그림 1: AFM 접촉 모드에서 힘 거리 곡선의 개략적 표현. 프로브가 표면에 접근할 때 힘이 너무 작아서 처음에는 팁의 측정 가능한 편향을 제공하므로 팁이 방해받지 않는 위치(1)에 남습니다. 그런 다음, 캔틸레버가 시료에 매우 가까우면, 팁과 프로브 사이에 활성인 접착제력으로 인해 캔틸레버가 실제로 샘플(2)쪽으로 빠르게 스냅됩니다. 프로브가 시료에 더 가까워지면 반발 편향은 방향 의 움직임에 대해 직면하며, 수직 편향이 상대 설정점 값(3)에 도달할 때까지 높이와 편향의 거의 선형 함수가 있습니다. 리트랙팅(4)은 하강 편향력 외에도 캔틸레버가 시료에서 Z축으로 후퇴하는 동안 접착력도 존재합니다. AFM 프로브가 샘플과의 접촉을 당겨지면 먼저 인터페이스에서 접착력을 느슨하게 하기 전에 "붙어"되어 캔틸레버의 짧은 음의 편향으로 이어지며 프로브(5)와 접촉하지 않고 다시 구부러지지 않은 중립 위치에 도달합니다. 편향의 정도는 나노 뉴턴으로 표현된 캔틸레버에서 작동하는 힘으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 세포외 기종(ECM) 및 세포내 기매트릭스(PCM)의 연골세포 및 AFM 측정의 대표적인 공간 특성화. (A-D) 셀룰러 패턴의 특성: 문자열(A),이중 문자열(B),작은 클러스터(C)및 큰 클러스터(D). PCM(빨간 원) 및 ECM(청색 영역)의 탄성F계수(E/F)를 골관절염 연골에서 상이한 세포 패턴에 대해 평가하였다.E ECM 및 PCM에 대한 측정 사이트는 실험자가 선택했으며 검은 십자가로 그래픽으로 표시됩니다. 측정에 사용되는 캔틸레버 팁은 흰색 별으로 표시됩니다. 축척 막대는 10 μm(A-D)및 100 μm(E/F)를나타냅니다. 이 그림은 다날라체 외9에서조정 및 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 공간 연골세포 조직의 함수로서 세포외 기매트릭스(ECM) 및 주세포 매트릭스(PCM)의 정량화된 영의 변둘리의 비교. 진보적 인 병리학 적 공간 연골 세포 조직으로, ECM(A)및 PCM(B)모두에 대한 박스 플롯에서 탄성의 점진적 감소가 지적되었다 (*p & 0.05, ***p & 0.001). 약어 : SS : 단일 문자열, DS : 이중 문자열, SC : 작은 클러스터, BC : 큰 클러스터. 수치는 다날라체 외9에서가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 세포외 기매트릭스(ECM)와 세포 공간 조직의 함수로서 세포외 기매트릭스(PCM)의 영계의 관계. 점점 더 병리학적인 공간 연골 세포 조직은 ECM 및 PCM(A)모두에대한 영의 계수의 감소와 관련이 있었다. 이러한 공간 변화가 일어나는 동안, ECM 및 PCM 탄성의 비율은 일정하게 유지되어 유의한변화(B)를보여주지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준오차(A)및 박스플롯(B)이B있는 선 다이어그램으로 표시됩니다. 약어 : SS : 단일 문자열, DS : 이중 문자열, SC : 작은 클러스터, BC : 큰 클러스터. 수치는 다날라체 외9에서가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 단일 문자열 패턴의 골막 매트릭스(PCM)의 들여쓰기에 의해 얻어진 대표적인 힘 곡선은 잔류 근근 평균 제곱(잔류 RMS; 검정 화살표)뿐만 아니라 적합 도표(주황색 화살표)를 나타낸 것이다. 맞춤 결과에는 샘플과 팁 사이의 접촉점, Young's 계수 및 기준선이 포함됩니다. 아래에 표시된 잔류 RMS는 맞춤 데이터와 힘 데이터의 차이를 설명하여 힘 곡선 맞춤의 품질을 나타냅니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 표 1. AFM 프로브에 마이크로스피어를 붙이는 파라미터 | |
| 매개 변수 | 값 |
| 설정점 | 5.0 V |
| 기준선 조정 | 1 |
| 당기는 길이 | 90.0 μm |
| Z 무브먼트 | 일정한 속도 |
| 연장 속도 | 5.0 μm/s |
| 시간 연장 | 18.0s |
| 연락 시간 | 90.0s |
| 지연 모드 | 상수력 |
| 샘플 속도 | 2000Hz |
표 1. AFM 프로브에 마이크로스피어를 붙이는 매개 변수.
| 표 2. 접근 매개 변수 | |
| 접근 매개 변수 | 값 |
| 접근 IGain | 5.0 Hz |
| 어프로치 피게 | 0.0002 |
| 목표 높이 접근 | 10.0 μm |
| 접근 설정점 | 5.00 V |
| 접근 기준 | 0.00 V |
표 2. 접근 매개 변수.
| 표 3. 매개 변수 실행 | |
| 매개 변수 | 값 |
| 설정점 | 1.0 V |
| 기준선 조정 | 1 |
| 당기는 길이 | 90.0 μm |
| Z 무브먼트 | 일정한 속도 |
| 연장 속도 | 5.0 μm/s |
| 시간 연장 | 18.0s |
| 연락 시간 | 0.0s |
| 지연 모드 | 상수력 |
| 샘플 속도 | 2000Hz |
표 3. 매개 변수를 실행합니다.
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Discussion
나노 수준에서 생물학적 물질의 생체 역학적 특성을 측정하는 신규하고 강력한 기술로 AFM을 사용하여, 우리는 인간의 골관절염 관절 연골에서 ECM 및 PCM의 탄성 특성을 측정했다. 연골 샘플은 국부 조직 변성을 위한 이미지 기반 바이오마커로서 연골세포 조직의 그들의 우세한 공간 패턴에 따라 선택되었다. 예상대로, ECM 및 PCM 모두의 탄성값의 강한 하락은 공간 연골세포 재구성을 따라 관찰되었다. 이러한 관찰은 연골 세포의 공간 배열의 편차가 세포 미세 환경 (PCM)의 탄성 특성의 변화와 관련이뿐만 아니라 전체 연골 (ECM)을 통해 뿐만 아니라 있음을 명확하게 강조한다. 더욱이, ECM/PCM 비는 OA 동안 PCM 및 ECM의 탄성 계수의 강력한 변화에도 불구하고 어떠한 큰 변화도 나타내지 않았다. 이러한 사실 인정은 ECM 및 PCM의 기계적 특성의 변화가 일방적으로 동시에 발생했음을 나타내며, 이는 진보적 파괴의 본질이 PCM 및 ECM 모두에 대해 유사하다는 것을 의미할 수 있다. OA 개시 및 진행은 이렇게 중요한 PCM 및 ECM 저하 및 궁극적으로 파괴를 트리거합니다. 두 손실 모두 본 연구에서 나타난 바와 같이 탄성과 같은 관절 연골의 생체 역학적 특성의 상당한 손실과 연관되었다. 이것은 생체 역학적 특성에 대한 마커로서 연골 세포의 공간 적 조직의 기능적 관련성을 강조합니다. 반대로, 그것은 우리가 로컬 지배적 인 공간 패턴따라서 연골의 국부 조직 변성에 대한 결론을 도출하기 위해 로컬 탄성 측정을 사용할 수 있습니다.
원자력 현미경 검사법 (AFM)은 비파괴적인 방법으로 조직을 공부하는 고해상도 공구로 나타났습니다. 그것은 포토 다이오드에 레이저를 반사하는 섬세하고 유연한 캔틸레버로 샘플을 물리적으로 프로빙하여 작동합니다. 이 반사의 모든 변경 사항은 등록되어 전기 신호로 변환됩니다. AFM은 나노 스케일 측정을 수행하는 강력한 도구이지만 제한과 함정이 없는 것은 아닙니다. 특히 중요한 것은 마이크로스피어를 접착하여 캔틸레버 제제입니다. 이 방법의 맥락에서 마이크로스피어는 측정 중에 들여쓰기 깊이와 국부압력을 수정하는 데 사용됩니다. 프로브의 팁에 부착된 작은 마이크로스피어를 사용하면 팁만 사용할 때 단일 섬유의 탄성보다는 섬유 네트워크의 생체역학적 특성을 측정할 수 있습니다. 또한 측정 과정에서 조직 손상을 방지합니다. 캔틸레버 센서의 섬세한 특성으로 인해 일관되고 정확한 측정을 위해서는 세심하고 신중한 준비 모드가 설정되어야 합니다. 마이크로스피어가 센서 끝에서 분리되는 것을 방지하기 위해 1주일 이상 오래 되지 않은 갓 혼합된 접착제를 권장합니다. 또한 센서의 기능은 마이크로스피어 부착의 측면 편차로 인해 일관되지 않은 측정을 쉽게 초래하므로 팁 중앙에 마이크로스피어를 배치하는 것이 중요합니다.
캔틸레버를 유리 블록에 놓고 피팅 스프링으로 고정하는 것은 세심한 주의와 꾸준한 손이 필요한 섬세하고 오류가 발생하기 쉬운 과정입니다. 캔틸레버는 숙련되지 않은 작업자에 의해 파괴될 가능성이 매우 높기 때문에 AFM의 쉽게 부서질 수 있는 구성 요소를 편안하게 처리하기 위해 여러 테스트 실행 및 연습을 수행하는 것이 좋습니다.
깨끗한 유리 블록은 장치를 적절하게 교정하고 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위해 필수적입니다. 블록의 광학 표면에 먼지나 먼지가 있어 광검출기에 적절한 레이저 정렬이 방지될 수 있습니다. 따라서 레이저 정렬 중에 문제가 발생하면 에탄올로 유리 블록을 두 번째로 세척해야 할 수 있습니다.
탄성 계수의 데이터 분석 또는 측정은 앞서11,,12에설명된 바와 같이 Hertz 모델을 사용하여 수행될 수 있다. 요컨대, 들여쓰기에 의해 생성된 데이터는 캔틸레버 팁의 이동에 대한 힘의 플롯입니다. 측정 중에 캔틸레버가 샘플 방향으로 이동됩니다. 이것은 캔틸레버가 샘플과 접촉하고 그 후에 원래 이동한 방향과 반대 방향으로 구부러지게 됩니다. 동시에 특정 양만큼 샘플의 들여쓰기가 발생합니다. Hertz-fit 모델을 사용하려면 캔틸레버 굽힘 매개변수를 격리하기 위해 샘플의 들여쓰기를 계산하고 조정해야 합니다. 샘플을 설명하는 매개 변수는 조사 된 재료에 따라 달라지는 푸아송의 비율입니다. 연약한 생물학 견본을 위해, 푸아송의 비율은 수시로 0.515로설정됩니다. 위에서 언급했듯이 사용된 인덴터의 모양은 원래 Hertz 방정식으로 만들어져야 하는 확장을 지시하기 때문에 영의 계수 계산과 관련이 있습니다. 기재된 실험의 경우, 마이크로스피어의 사용으로 인해 구형 인덴터 형상이 가정된다.
AFM은 데이터를 수집하는 새롭고 흥미로운 가능성을 제공할 수 있지만, 산출된 데이터의 일관성과 신뢰성은 각 운영자의 경험에 따라 크게 좌우됩니다. 위에서 설명한 몇 가지 단계는 사람의 실수에 취약하며 제대로 실행하려면 인내와 세심함이 필요합니다.
측정 결과에 영향을 줄 수 있는 많은 민감한 변수로 인해 이 연구에서 보고된 절대 물력 값은 일반화할 수 없지만 실험 설정에 따라 다소 구체적입니다. 이 기술을 사용하여 연골의 조직 변성을 평가할 때, 다른 공간 패턴에 대한 일부 정규화 측정은 먼저 존재하는 특정 실험 측정 설정으로 결과를 확장하기 위해 수행될 필요가 있다. 그러나 다른 탄성 계수와 공간 패턴의 관계는 영향을 받지 않습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 그들의 도움과 지원에 대한 원래 출판물에서 우리의 공동 저자에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
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