Anvendelse av atomic force mikroskopi for å oppdage tidlig slitasjegikt
Summary
Vi presenterer en metode for å undersøke tidlige osteoarthritic endringer på mobilnivå i leddbrusk ved hjelp av atomkraft mikroskopi (AFM).
Abstract
Biomekaniske egenskaper av celler og vev ikke bare regulere sin form og funksjon, men er også avgjørende for å opprettholde sin vitalitet. Endringer i elastisitet kan forplante eller utløse utbruddet av store sykdommer som kreft eller slitasjegikt (OA). Atomkraftmikroskopi (AFM) har dukket opp som et sterkt verktøy for kvalitativt og kvantitativt karakterisere de biomekaniske egenskapene til spesifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, målekrefter i et område fra så lite som piconewton til mikronewton. Biomekaniske egenskaper er av særlig betydning i muskel-skjelettvev, som er utsatt for høye nivåer av belastning. OA som en degenerativ sykdom i brusk resulterer i forstyrrelsen av pericellulær matrise (PCM) og romlig omorganisering av kondrocytter innebygd i deres ekstracellulære matrise (ECM). Avbrudd i PCM og ECM har vært forbundet med endringer i de biomekaniske egenskapene til brusk. I den nåværende studien brukte vi AFM til å kvantifisere disse endringene i forhold til de spesifikke romlige mønsterendringene i kondrocytter. Med hver mønsterendring ble det observert betydelige endringer i elastisitet en PCM og ECM. Måling av lokal elastisitet gjør det mulig å trekke direkte konklusjoner om graden av lokal vevdegenerasjon i OA.
Introduction
Leddbrusk er et avaskulært, aneuralt vev. Tynt spredte kondrocytes produsere, organisere og opprettholde en ekspansiv ekstracellulær matrise (ECM) der de er innebygd. Som en distinkt og spesialisert del av ECM, er chondrocytes omgitt av et tynt lag av spesialisert matrise kjent som den pericellulære matrisen (PCM). PCM fungerer som en mechanosensitive celle-matrise grensesnitt1 som beskytter chondrocytes2 og modulerer deres biosyntetisk respons3. Som tidligere beskrevet4, i sunn brusk, er kondrocytes arrangert i spesifikke, distinkte romlige mønstre som er spesifikke for hvert vev lag og felles4,5 og avhenger av fellesspesifikke mekaniske lastemekanismer6. Disse mønstrene endres fra par og strenger i sunn brusk til doble strenger med utbruddet av slitasjegikt (OA). Med videre progresjon av sykdommen danner kondrocytter små klynger, og øker gradvis i størrelse til store klynger i avansert OA. Et fullstendig tap av enhver organisatorisk struktur og induksjon av apoptose observeres i sluttfasen OA. Dermed kan kondrocyte cellulær arrangement brukes som en bildebasert biomarkør for OA progresjon4.
Biomekaniske egenskaper av celler og vev ikke bare regulere sin form og funksjon, men er også avgjørende for å opprettholde sin vitalitet. Endringer i elastisitet kan forplante eller utløse utbruddet av store sykdommer som kreft eller OA. Atomkraftmikroskopi (AFM) har dukket opp som et kraftig verktøy for kvalitativt og kvantitativt karakterisere de biomekaniske egenskapene til spesifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, som måler et bredt spekter av kraft, fra piconewton til mikronewton. Den store anvendelsen av AFM er å måle overflatetopografien og mekaniske egenskapene til prøver ved subnanometeroppløsning7. Måleenheten består av tre hovedkomponenter: 1) En AFM-sonde, som er en skarp spiss montert på en cantilever og brukes til direkte interaksjon med overflaten av prøven. Når det påføres kraft på cantilever, oppstår deformasjon av sistnevnte i henhold til det målte vevets egenskaper. 2) Et optisk system som projiserer en laserstråle på cantilever, som deretter reflekteres til en detektorenhet. 3) En fotodiodedetektor som fanger lyset avledet fra cantilever. Den konverterer mottatt informasjon om lasernedbøyning av cantilever til en kraftkurve som kan analyseres.
Dermed er hovedprinsippet for AFM påvisning av kraften som virker mellom AFM-sonden og målstrukturen til prøven. Kraftkurvene som er oppnådd beskriver de mekaniske egenskapene til målstrukturene på prøveoverflaten som elastisitet, ladefordeling, magnetisering, utbyttestress og elastisk plastdeformasjonsdynamikk8. En viktig fordel med AFM over andre bildeteknikker er at AFM kan brukes til å måle de mekaniske egenskapene til levende celler i medium eller vev i en innfødt tilstand uten å skade vevet. AFM kan operere både under flytende eller tørre forhold. Det er ikke noe krav til prøveforberedelse. AFM gir mulighet til å bilde av en prøve og måle sine mekaniske egenskaper samtidig i prøver som er nær fysiologiske forhold. I den nåværende studien beskriver vi en ny tilnærming for å vurdere OA-progresjon ved å måle elastisiteten til PCM og ECM i innfødt leddbrusk. Korrelasjonen av romlig organisering av chondrocytes med graden av lokal vevdegenerasjon gir et helt nytt perspektiv for tidlig påvisning av OA. Den funksjonelle relevansen av disse mønstrene har imidlertid ikke blitt evaluert så langt. Fordi den viktigste funksjonen til leddbrusk er bærende ved lav friksjon, må vevet ha elastiske egenskaper. AFM tillater måling ikke bare elastisiteten til ECM, men også av de romlige cellulære mønstrene innebygd i deres PCM. Den observerte korrelasjonen av elastisitet med romlig mønsterendring av kondrocytter er så sterk at måling av elastisitet alene kan tillate stratifisering av lokal vevdegenerasjon.
Elastisk moduli av PCM og ECM ble vurdert i 35 μm tynne seksjoner ved hjelp av et AFM-system integrert i et omvendt fasekontrastmikroskop som tillot samtidig visualisering av bruskprøven. Denne protokollen er basert på en studie som allerede er publisert fra vårt laboratorium9 og beskriver spesifikt hvordan man karakteriserer det romlige arrangementet av kondrocytter og hvordan man måler elastisiteten til deres tilknyttede PCM og ECM. Med hver mønsterendring av kondrocytter kan det også observeres betydelige endringer i elastisitet for både PCM og ECM, slik at denne teknikken kan brukes til å måle fasen av degenerasjon av brusk.
Denne validerte tilnærmingen åpner opp en ny måte å evaluere OA progresjon og terapeutiske effekter i tidlige stadier før makroskopisk vev nedbrytning faktisk begynner å vises. Å utføre AFM-målinger konsekvent er en vanskelig prosess. I følgende protokoll beskriver vi hvordan du klargjør prøven som skal måles av AFM, hvordan du utfører de faktiske AFM-målingene som starter med utarbeidelse av cantilever, hvordan du kalibrerer AFM, og deretter hvordan du utfører målingene. Trinnvise instruksjoner gir en klar og konsis tilnærming til å skaffe pålitelige data og gi grunnleggende strategier for behandling og tolking av dem. Diskusjonsdelen beskriver også de vanligste fallgruvene i denne strenge metoden og gir nyttige feilsøkingstips.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av AFM som en ny og kraftig teknikk for å måle de biomekaniske egenskapene til biologiske materialer på nanoskalanivå, målte vi de elastiske egenskapene til ECM og PCM i menneskelig osteoartritisk leddbrusk. Bruskprøver ble valgt i henhold til deres dominerende romlige mønster av chondrocyte organisasjon som en bildebasert biomarkør for lokal vevdegenerasjon. Som forventet ble det observert en sterk nedgang i verdiene av elastisitet en både ECM og PCM sammen med romlig kontrocyttomorganisering. Disse o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker våre medforfattere fra den opprinnelige publikasjonen for deres hjelp og støtte.
Materials
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F., Ramalingam, M., Ramakrishna, S. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. , 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis–I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young’s modulus and Poisson’s ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson’s ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
