Sunulan protokol, potansiyel antiepileptik maddeler için bir preklinik değerlendirme aracı olarak hayati beyin dilimleri kullanmak nihai hedefi ile rezeke insan hipokampal doku taşıma ve hazırlanması açıklar.
Epilepsi dünya nüfusunun yaklaşık % 1’ini etkiler ve devam eden nöbetler nedeniyle yaşam kalitesinde ciddi bir düşüşe ve ani ölüm riskinin yüksek olmasıyla sonuçlanmaktadır. Mevcut tedavi seçeneklerinin bolluğuna rağmen, hastaların yaklaşık %30’u ilaca dirençlidir. Çeşitli yeni terapötikhayvan modelleri kullanılarak geliştirilmiştir, ancak ilaca dirençli hastaların oranı değişmeden kalır. Olası nedenlerden biri kemirgen modelleri ve insanlar arasında çeviri eksikliği, hayvan modellerinde insan farmakodirenci zayıf bir temsil ilerler gibi. Bir preklinik değerlendirme aracı olarak rezeke insan beyin dokusu bu çevirisel boşluğu köprü avantajı vardır. Burada açıklanan insan hipokampal beyin dilimleri ve epileptiform aktivite sonraki istikrarlı indüksiyon yüksek kaliteli hazırlık için bir yöntemdir. Protokol, 8 mM KCl ve 4-aminopyridin uygulaması sırasında patlama aktivitesiin indüksiyonunu açıklar. Bu aktivite, dimethylethanolamine (DMEA) gibi yerleşik AED lacosamide veya yeni antiepileptik adaylara karşı hassastır. Buna ek olarak, yöntem ekstrasellüler Mg azaltılması ile insan hipokampal beyin dilimleriNIN CA1 nöbet benzeri olayların indüksiyon açıklar+ ve bikülliline uygulama, BIR GABAA reseptör bloker. Deneysel kurulum epileptiform aktivite üzerindeki etkileri için potansiyel antiepileptik maddelerin ekran için kullanılabilir. Ayrıca, belirli bileşikler için öne sürülebilir etki mekanizmaları insan dokusunda bu yaklaşım kullanılarak doğrulanabilir (örneğin, yama-kelepçe kayıtları kullanılarak). Sonuç olarak, hayati insan beyin dokusu ex vivo soruşturma (burada, temporal lob epilepsi muzdarip hastalardan rezeke hipokampus) insan beyninde fizyolojik ve patolojik mekanizmaların mevcut bilgi artıracaktır.
Epilepsi en sık görülen nörolojik hastalıklardan biridir, dünya nüfusunun% 1 etkileyen, ve artan morbidite ve mortalite ile ilişkili1,2. Ne yazık ki, epilepsi muzdarip hastaların üçte biri ilaca dirençli, 20’den fazla onaylı antiepileptik ilaçlar da dahil olmak üzere mevcut tedavi seçenekleri bir bolluk rağmen (AED)3. Preklinik hayvan araştırmalarından sonuçları klinik çalışmalara çevirememe, umut verici tedavi stratejilerinin birçok hastada etkili olmamasının bir nedenidir4. Son zamanlarda, nöropeptid Y (NPY) ve galanin hayvan modellerinde antiepileptik etkileri olduğu gösterilmiştir; rağmen, rezeke insan beyin dokusunda test edildiğinde, sadece NPY etkili oldu5.
Temel nörolojik mekanizmalar ve hastalık tedavisi yaklaşımları ile ilgili mevcut bilginin çoğu hayvan modelleri ve hücre kültürü deneylerinden kaynaklanmaktadır. Bilgilendirici olmasına rağmen, bu modeller sadece karmaşık insan hastalıkları ve yetişkin insan beyin ağı nın tek yönlerini temsil. Alternatif olarak, insan beyin dokusu çeviri boşluğu köprü potansiyeline sahiptir ama nadiren fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir. Örneğin, post mortem beyin dokusu protein ekspresyonu, beyin morfolojisi, ya da anatomik bağlantıları araştırmadeğerli bir araç olmuştur, nöronal aktivite genellikle tehlikeye rağmen bu doku6,7,8,9,10,11.
Buna karşılık, yaşayan rezeke insan beyin dokusu preklinik ilaç değerlendirmesi ile ilgili araştırılmıştır, temel nöronal fonksiyonlar ve gen ekspresyonu desenleri12,13,14,15,16,17. Kemirgen dilimleri ile karşılaştırıldığında insan beyin dilimlerinin büyük bir avantajı rezeksiyon ve hazırlık sonrası nöronal dokunun uzun canlılık olduğunu. Kemirgen beyin dilimleri ile karşılaştırıldığında, genellikle hazırlık tan sonra 8 saate kadar kaydedilebilir, insan beyin dilimleri kadar istikrarlı nöronal aktivite göstermek 72 saat, Bu nadir ve değerli örneklerin ayrıntılı soruşturma sağlayan12,18.
Çeşitli çalışmalar rezeke kortikal ve hipokampal insan dokusunun çeşitli alanlarda epileptiform aktivite özelliklerini araştırdı ve epileptiform aktivite indüksiyon için farklı yöntemler kullanılır. Kemirgen dilimlerinde, epileptiform aktivitesi çeşitli yöntemlerle indüklenebilir: DG hiler hücrelerinin elektriksel uyarılması, ekstrasellüler K+ (8-12 mM KCl), gabaA reseptörlerinin biküllin (BIC) ile bloke edilmesi, potasyum kanallarının 4-aminopyridine (4-AP) tarafından bloke edilmesi ve ekstrasellüler çözeltide Mg2+’nın çıkarılması veya azaltılması19. Ancak, insan dokusunda epileptiform aktivitein indüksiyonu yukarıda belirtilen yöntemlerden en az ikisinin kombinasyonunu gerektirir20,21,22.
Burada sunulan insan hipokampal beyin dilimleri hazırlanması için bir yöntemdir, hangi kadar uygulanabilir 20 saat ve yüksek K uygulanması üzerine epileptiform aktivitesiin indüksiyon göstermek+ (8 mM) ve 4-AP veya düşük Mg2 + ve BIC.
Canlı rezeke insan beyin dokusu AED’lerin klinik öncesi değerlendirilmesinde son derece değerli bir araçtır, çünkü sağlam bir insan beyni mikro ağını doğru bir şekilde temsil eder. Sunulan protokol, yüksek kaliteli hipokampal dilimlerin yanı sıra AED değerlendirmesi için kritik olan epileptiform aktivite için kararlı bir indüksiyon yöntemi sağlayan doku taşıma ve hazırlama yöntemini tanımlar.
İnsan beyin dilimlerinde kimyasal veya elektriksel indüksiyon yöntemlerinin yanı sıra epileptiform aktivitenin araştırılması daha önce diğer gruplar tarafından gösterilmiştir17,20,21,22. Bu protokol, yüksek K++4-AP uygulaması ile farklı hastalardan dilimler halinde stabil patlama aktivitesiin indüksiyonunun yanı sıra düşük Mg2++BIC uygulaması ile CA1 alanında SLE’lerin indüksiyonuna neden olundu. Patlama aktivitesiin indüksiyonunun SLE indüksiyonuna göre daha tutarlı olduğu (15 hastada test edilen dilimlerin %80’i) (bir hastada test edilen dilimlerin %50’si) saptandı. Ancak, şimdiye kadar, SLEs indüksiyon sadece bir hastada test edilmiştir. Bununla birlikte, SLE’lerin düşük Mg2++BIC ile indüksiyonu tavsiye edilir, çünkü SLE’ler henüz yüksek K++4-AP kullanılarak indüklenmeilmelidir.
Çeşitli çalışmalar taşıma ve insan beyin dokusunun hazırlanması için yöntemler tanıttı ve genellikle nöronal sağkalım için kritik üç faktör vurgulamak: ulaşım süresi, kullanılan ulaşım çözümleri, ve depolama koşulları.
Optimal dilim canlılığı için, bazı gruplar rezeke beyin dokusunun taşınması mümkün olduğunca kısa olduğunu öneririz. Ancak, ameliyathaneler ve laboratuvarlar nadiren yakın dır, bu da uzun ulaşım nedeniyle dilim kalitesinin tehlikeye atılabileceği anlamına gelir. Bazı gruplar taşıma12sırasında çözüme sabit O2 uygulayarak bu engeli aşmış. Biz kısa (max = 15 dk) ve uzun (1 saate kadar) süreler için taşıma sırasında sabit ek O2 kaynağı olmadan zaman beyin dokusu taşınan var, diğer gruplara benzer18,25. Bu olgularda epileptiform kayıtlarda doku kalitesinde farklılıklar gözlenmemiştir. Enstitümüzdeki diğer gruplarla iletişimde, yamalı kıskaç deneyleri için de dilim kalitesi değişmedi. Buna karşılık, doku kalitesindeki varyans muhtemelen operasyonlar sırasında hasar kaynaklanıyor, uzun süreli rezeksiyon, ve dilimleme prosedürü.
Taşıma ve kesme çözeltisi ile ilgili olarak, yayınlanan tüm yöntemler, kemirgen yama-kelepçe deneyleri için standart prosedüre benzer şekilde, ozmotik basınç nedeniyle hücre şişmesini azaltmak için nacl çözeltilerinden atlar. Ancak, birkaç yerine şimdiye kadar tanıtıldı (yani, sakaroz bazlı aCSF13,22, NMDG tabanlı aCSF12,26, ve kolin bazlı aCSF27). Ting ve meslektaşları 201426 yılında dilim hazırlama için NMDG tabanlı aCSF tanıttı ve daha sonra yavaş yavaş dilimleri28NaCl yeniden tanıtan bir kurtarma protokolü eklendi. Ancak, Ting ve ark tarafından açıklandığı gibi, NMDG tabanlı aCSF hazırlanan beyin dokusunun nöronlar yüksek membran direnci göstermek, böylece yama-kelepçe deneyleri sırasında tüm hücre mühür etkileyen26. Bu nedenle, nmdg tabanlı aCSF kolin tabanlı aCSF20kullanımına geçiş yaptık , hangi alan potansiyeli ve yama-kelepçe kayıtları için yüksek kaliteli dilimler verir.
Dilimlerin depolanması ile ilgili olarak, genellikle arayüz koşulları uzun dilim hayatta kalma için kritik optimum oksijenleme sağlamak kabul edilir18. Ancak, diğer gruplar 12 batıkkoşullaraltında 72 saate kadar dilim sağkalım göstermektedir. Önceki hipotezin aksine, insan beyin dilimleri kemirgen dilimleri ile karşılaştırıldığında düşük oksijenasyon veya oksidatif strese karşı daha dayanıklı gibi görünüyor. Öncelikle, arayüz odaları daha önce insan hipokampal dilimleri depolamak için kullanılmıştır, batık koşullar yama-kelepçe deneylerde insan beyin dilimlerinin bakımı için tavsiye edilir rağmen.
Diğer gruplar tarafından tartışıldığı gibi, uzun dilim sağkalım için ek bir kritik adım (arayüz <48 h18, için batık <72 h12) bakteriyel kontaminasyonun önlenmesidir. Kemirgen beyin dilimleri genellikle elektrofizyolojik kayıtlarda 8 saate kadar kullanılır ve bakteriyel kontaminasyonun bu dönemde dilimin canlılığını etkilediği düşünülmez. Bir rezeksiyondan hazırlanan yüksek sayıda dilim ve insan beyin dokusunun nadir bulunması, insan beyin dilimlerinin canlılığını uzatma ihtiyacını vurgular. Bu yöntem başarıyla kolayca steril koşullara adapte edilebilir yaşayan insan hipokampal beyin dilimleri, hazırlanması açıklar. Ancak, burada yapılan kayıtlar için, dilim hayatta kalma 20 saat uzanan bir öncelik değildi.
Arayüz odalarında kayıt da SLEs22gibi epileptiform aktivite indüksiyon için gerekli olduğu gösterilmiştir. Düşük oksijenlenme nedeniyle batık koşullar, SLE’lerin kaydı nda nadiren kullanılır; ancak, yama-kelepçe deneyleri için gerekli optik yüksek çözünürlük için gereklidir. Optimize edilmiş bir batık tip kayıt odasının kullanımı, yüksek oksijenasyon ve hızlı ilaç uygulaması nedeniyle insan beyin dilimlerinde epileptiform aktivitenin (hücre dışı alan veya tek nöron) kaydedilmesini sağlar29. Burada, alan potansiyeli kayıtları için yöntemler ve sonuçlar açıklanmıştır, ancak bu değiştirilmiş kayıt odası (veriler gösterilmez) kullanılarak fare ve insan beyin dilimlerinde yama-kıskaç kayıtlarının başarıyla gerçekleştirildiği vurgulanmalıdır.
Rezeke insan beyin dokusu kemirgen modellerine göre daha yüksek bir çeviri değerine sahiptir. Bu iPSCs tarafından çoğaltılamaz bir yetişkin, hastalıklı nöronal ağ temsil eder. Ancak, herhangi bir in vitro sisteminde olduğu gibi, insan beyin dilimleri bozulmamış bir insan beyni temsil etmez. Ayrıca, rezeke beyin dokusunun kayıtlı nöronal ağlar operasyon veya hazırlık sırasında hasar nedeniyle önemli moleküler ve fonksiyonel değişiklikler eolabilir. Dilimleme prosedürleri GABAerjik fonksiyonu etkilemek için gösterilmiştir ve epileptiform aktivite indüksiyon etkileyebilir30. Bir hipotez formüle edilirken bu sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Potansiyel antiepileptik ilaçlar test ederken, farklı beyin alanlarının kullanımı düşünülmelidir, ilaç hedefleri tüm insan beyin bölgeleri veya tüm hastalarda ifade olmayabilir gibi. Özellikle, TLE hastalarının hipokampi genellikle şiddetli nöronal hücre kaybı ile birlikte hipokampal skleroz belirtileri göstermektedir. İlaçlara karşı potansiyel refrakter gibi patolojik değişiklikler ve hastalık öyküsü hakkında hasta bilgileri elde etmek ve veri yorumlanması sırasında bunu göz önünde bulundurmak önerilir.
Sonuç olarak, bu yöntem başarıyla epileptiform aktivite iki farklı türde kayıt için yaşayan insan hipokampal beyin dilimleri ve indüksiyon teknikleri hazırlanması açıklar. Yaşayan insan beyin dokusunun kullanılabilirliği nadir olduğundan, insan beyin dilimleri kullanarak deneylerden maksimum verim sağlamak için optimize edilmiş taşıma ve kayıt koşulları kullanılmalıdır. Rezeke insan beyin dokusunun kemirgen modelleri ve hücre kültürü deneylerine ek olarak klinik öncesi doğrulama aracı olarak kullanılabilmesi önerilmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Mandy Marbler-Pötter’e (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. P.F. Alman Araştırma Vakfı (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi-EXC-2049-390688087 altında finanse edilmiştir. Bu çalışma, Berlin Sağlık Enstitüsü’ndeki QUEST Dönüşüm Biyomedikal Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir.
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |