Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Transport und die Vorbereitung von resektiertem menschlichen Hippocampusgewebe mit dem ultimativen Ziel, lebenswichtige Hirnscheiben als präklinisches Bewertungsinstrument für potenzielle antiepileptikatische Substanzen zu verwenden.
Epilepsie betrifft etwa 1% der Weltbevölkerung und führt zu einem starken Rückgang der Lebensqualität aufgrund anhaltender Anfälle sowie eines hohen Risikos für einen plötzlichen Tod. Trotz einer Fülle von verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten sind etwa 30% der Patienten medikamentenresistent. Mehrere neuartige Therapeutika wurden mit Tiermodellen entwickelt, obwohl die Rate der medikamentenresistenten Patienten unverändert bleibt. Einer der wahrscheinlichen Gründe ist die fehlende Übersetzung zwischen Nagetiermodellen und Menschen, wie z. B. eine schwache Darstellung der menschlichen Pharmakoresistenz in Tiermodellen. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Beschrieben hier ist eine Methode zur qualitativ hochwertigen Vorbereitung von menschlichen Hippocampus-Gehirnscheiben und anschließende stabile Induktion von epiptiformen Aktivität. Das Protokoll beschreibt die Induktion der Burstaktivität während der Anwendung von 8 mM KCl und 4-Aminopyridin. Diese Aktivität ist empfindlich gegenüber etablierten AED-Lacosamid oder neuartigen Antiepileptika-Kandidaten wie Dimethylethanolamin (DMEA). Darüber hinaus beschreibt die Methode die Induktion von anfallartigen Ereignissen in CA1 von menschlichen Hippocampus-Gehirnscheiben durch Reduktion von extrazellulären Mg2+ und Anwendung von Bicuculline, ein GABA-A-Rezeptor-Blocker.A Der Versuchsaufbau kann verwendet werden, um potenzielle antiepileptische Substanzen auf ihre Auswirkungen auf die epileptische Aktivität zu überprüfen. Darüber hinaus können wir, die für bestimmte Verbindungen postuliert sind, mit diesem Ansatz im menschlichen Gewebe (z. B. durch Patch-Clamp-Aufnahmen) postuliert werden. Abschließend möchte ich sagen, dass die Untersuchung des lebenswichtigen menschlichen Hirngewebes ex vivo (hier resezierte Hippocampus von Patienten mit zeitlicher Lappenepilepsie) das aktuelle Wissen über physiologische und pathologische Mechanismen im menschlichen Gehirn verbessern wird.
Epilepsie ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, von denen 1% der Weltbevölkerung betroffen sind, und ist mit erhöhter Morbidität und Mortalität1,2verbunden. Leider ist ein Drittel der Patienten, die an Epilepsie leiden, medikamentenresistent, trotz einer Fülle von verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten, darunter mehr als 20 zugelassene Antiepileptika (AEDs)3. Die Nichtübersetzung von Ergebnissen aus der präklinischen Tierforschung in klinische Studien ist ein Grund, warum vielversprechende Behandlungsstrategien bei vielen Patienten nicht wirksam sind4. In jüngster Zeit haben Neuropeptid Y (NPY) und Galanin gezeigt, dass sie antiepileptikatische Wirkungen in Tiermodellen haben; jedoch, wenn in reseziertem menschlichen Gehirngewebe getestet, nur NPY war wirksam5.
Die meisten vorhandenen Kenntnisse über grundlegende neurologische Mechanismen und Krankheitstherapieansätze stammen aus Tiermodellen und Zellkulturexperimenten. Obwohl diese Modelle informativ sind, stellen sie nur einzelne Aspekte komplexer menschlicher Krankheiten und des Erwachsenennetzwerks des menschlichen Gehirns dar. Alternativ hat menschliches Hirngewebe das Potenzial, die Translationslücke zu überbrücken, steht aber nur selten für funktionelle Studien zur Verfügung. Zum Beispiel, post mortem Gehirngewebe war ein wertvolles Werkzeug bei der Untersuchung von Protein-Expression, Gehirnmorphologie, oder anatomische Verbindungen, obwohl neuronale Aktivität ist oft kompromittiert ist dieses Gewebe6,7,8,9,10,11.
Im Gegensatz dazu wurde das lebende resezierte menschliche Hirngewebe hinsichtlich der präklinischen Arzneimittelbewertung, der grundlegenden neuronalen Funktionen und der Genexpressionsmuster12,13,14,15,16,17untersucht. Ein großer Vorteil der menschlichen Gehirnscheiben im Vergleich zu Nagetierscheiben ist die lange Lebensfähigkeit des neuronalen Gewebes nach Resektion und Vorbereitung. Im Vergleich zu Nagetier-Gehirnscheiben, die in der Regel für bis zu 8 h nach der Vorbereitung aufgezeichnet werden können, zeigen menschliche Gehirnscheiben stabile neuronale Aktivität für bis zu 72 h, was eine gründliche Untersuchung dieser seltenen und wertvollen Proben12,18ermöglicht.
Mehrere Studien haben die Eigenschaften der epileppmischen Aktivität in verschiedenen Bereichen des resezierten kortikalen und hippocampalen menschlichen Gewebes untersucht und verschiedene Methoden zur Induktion der epileppmischen Aktivität verwendet. In Nagetierscheiben kann die epileptime Aktivität durch verschiedene Methoden induziert werden: elektrische Stimulation von DG-Hilarzellen, Erhöhung der extrazellulären K+ (8–12 mM KCl), Blockierung von GABA-A-Rezeptoren durch Bicukulin (BIC), Blockierung von Kaliumkanälen durch 4-Aminopyridin (4-AP) und Entfernung oder Reduzierung von Mg2+ in extrazellulärer LösungA 19. Die Induktion der epileppiformen Aktivität im menschlichen Gewebe erfordert jedoch die Kombination von mindestens zwei der oben genannten Methoden20,21,22.
Präsentiert wird hier eine Methode zur Herstellung von menschlichen Hippocampus-Gehirnscheiben, die für bis zu 20 h lebensfähig sind und die Induktion von epilepptiformen Aktivität bei Anwendung von hohen K+ (8 mM) und 4-AP oder low Mg2+ und BIC zeigen.
Das Leben nach dem menschlichen Hirngewebe ist ein sehr wertvolles Werkzeug bei der präklinischen Bewertung von AEDs, da es ein intaktes menschliches Gehirnmikronetzwerk darstellt. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode für den Gewebetransport und die Gewebeaufbereitung, die hochwertige Hippocampusscheiben sowie eine stabile Induktionsmethode für die für die AED-Bewertung entscheidende epileptiforme Aktivität sicherstellt.
Untersuchung der epilepporganischen Aktivität sowie Methoden zur chemischen oder elektrischen Induktion in menschlichen Gehirnscheiben wurden zuvor von anderen Gruppen17,20,21,22gezeigt. Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer stabilen Burstaktivität in Scheiben von verschiedenen Patienten durch Anwendung von hohem K++4-AP sowie die Induktion von SLEs im CA1-Bereich durch Anwendung von low Mg2++BIC. Es wurde festgestellt, dass die Induktion der Burst-Aktivität konsistenter ist (80% der getesteten Scheiben bei 15 Patienten) als die Induktion von SLEs (50% der getesteten Scheiben bei einem Patienten). Bisher wurde die Induktion von SLEs jedoch nur bei einem Patienten getestet. Dennoch wird die Induktion von SLEs durch niedrigemg2++BIC empfohlen, da SLEs noch nicht mit hohem K++4-AP induziert werden konnten.
Mehrere Studien haben Methoden für den Transport und die Vorbereitung von menschlichem Hirngewebe eingeführt und zeigen oft drei Faktoren hervor, die für das neuronale Überleben entscheidend sind: Transportzeit, verwendete Transportlösungen und Lagerbedingungen.
Für eine optimale Slice-Lebensfähigkeit schlagen einige Gruppen vor, dass der Transport von resektiertem Hirngewebe so kurz wie möglich sein sollte. Operationsräume und Labore befinden sich jedoch selten in unmittelbarer Nähe, was bedeutet, dass die Qualität der Scheiben durch den langen Transport beeinträchtigt werden kann. Einige Gruppen haben dieses Hindernis überwunden, indem sie während des Transports12konstantes O2 auf die Lösung angewendet haben. Wir haben Hirngewebe für kurze (max = 15 min) und lange (bis zu 1 h) Zeiträume ohne konstante zusätzlicheO2-Versorgung während des Transports transportiert, ähnlich wie andere Gruppen18,25. In diesen Fällen wurden bei epileptiformen Aufnahmen keine Unterschiede in der Gewebequalität beobachtet. Auch in der Kommunikation mit anderen Gruppen unseres Instituts änderte sich die Schnittqualität bei Patch-Clamp-Experimenten nicht. Im Gegensatz dazu kann die Varianz in der Gewebequalität möglicherweise auf Schäden während operationen, längere Resektion und Schneidverfahren zurückzuführen sein.
In Bezug auf Transport- und Schneidlösung lassen alle veröffentlichten Methoden NaCl von Lösungen weg, um die Zellschwellung durch osmotischen Druck zu reduzieren, ähnlich dem Standardverfahren für Nagetier-Patch-Clamp-Experimente. Bisher wurden jedoch mehrere Substitute eingeführt (d.h. Saccharose-basierte aCSF13,22, NMDG-basierte aCSF12,26und Cholin-basierte aCSF27). Ting und Kollegen führten 2014 2014das NMDG-basierte aCSF für die Slice-Vorbereitung ein und fügten später ein Wiederherstellungsprotokoll hinzu, das NaCl langsam wieder in die Slices28einführt. Wie von Ting et al. beschrieben, weisen jedoch Neuronen von Hirngewebe, die in NMDG-basiertem aCSF hergestellt wurden, eine höhere Membranresistenz auf und wirken sich somit auf die Ganzzellversiegelung bei Patch-Clamp-Experimentenaus 26. Daher haben wir von NMDG-basierte aCSF auf die Verwendung von Cholin-basierte aCSF20umgestellt, die qualitativ hochwertige Slices für Feldpotenzial und Patch-Clamp-Aufnahmen liefert.
Hinsichtlich der Lagerung von Scheiben ist allgemein anerkannt, dass Schnittstellenbedingungen eine optimale Sauerstoffversorgung bieten, die für das Überleben langer Scheiben entscheidend ist18. Andere Gruppen zeigen jedoch ein Scheibenüberleben von bis zu 72 h unter getauchten Bedingungen12. Im Gegensatz zu früheren Hypothesen scheinen menschliche Gehirnscheiben resistenter gegen niedrige Sauerstoffversorgung oder oxidativen Stress im Vergleich zu Nagetierscheiben zu sein. In erster Linie wurden Schnittstellenkammern früher für die Lagerung von menschlichen Hippocampus-Scheiben verwendet, obwohl untergetauchte Bedingungen für die Aufrechterhaltung von menschlichen Gehirnscheiben in Patch-Clamp-Experimenten empfohlen werden.
Wie von anderen Gruppen diskutiert, ist ein zusätzlicher kritischer Schritt für das Überleben langer Scheiben (Schnittstelle für <48 h18, untergetaucht für <72 h12) die Verhinderung einer bakteriellen Kontamination. Nagetier-Gehirnscheiben werden in der Regel in elektrophysiologischen Aufnahmen für bis zu 8 h verwendet, und bakterielle Kontamination wird nicht als Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Scheibe während dieses Zeitraums betrachtet. Eine hohe Anzahl von Scheiben, die aus einer Resektion hergestellt werden, und die ungewöhnliche Verfügbarkeit von menschlichem Gehirngewebe unterstreichen die Notwendigkeit, die Lebensfähigkeit menschlicher Gehirnscheiben zu verlängern. Diese Methode beschreibt erfolgreich die Herstellung von lebenden menschlichen Hippocampus-Gehirnscheiben, die leicht an sterile Bedingungen angepasst werden können. Für die hier gezeigten Aufnahmen hatte das Scheibenüberleben von 20 h jedoch keine Priorität.
Die Aufnahme in Schnittstellenkammern hat sich auch als wesentlich für die Induktion von epileptiforme Aktivität wie SLEs22erwiesen. Untergetauchte Bedingungen aufgrund geringer Sauerstoffversorgung werden selten für die Aufzeichnung von SLEs verwendet; Sie sind jedoch für eine optische hohe Auflösung notwendig, die für Patch-Clamp-Experimente benötigt wird. Der Einsatz einer optimierten Aufnahmekammer vom Typ Untergetaucht ermöglicht die Aufzeichnung der epileppfigen Aktivität (extrazelluläres Feld oder einzelnes Neuron) in menschlichen Gehirnscheiben aufgrund hoher Sauerstoffversorgung und schneller Wirkstoffanwendung29. Hier werden Methoden und Ergebnisse für Feldpotentialaufnahmen beschrieben, aber es sollte betont werden, dass Patch-Clamp-Aufnahmen erfolgreich in Maus- und menschlichen Gehirnscheiben mit dieser modifizierten Aufnahmekammer durchgeführt wurden (Daten nicht dargestellt).
Resected human brain tissue hat einen höheren Translationswert im Vergleich zu Nagetiermodellen. Es stellt ein erwachsenes, krankes neuronales Netzwerk dar, das von iPSCs nicht reproduziert werden kann. Jedoch, wie in jedem In-vitro-System, menschliche Gehirnscheiben stellen kein intaktes menschliches Gehirn. Darüber hinaus können die aufgezeichneten neuronalen Netzwerke von reseziertem Hirngewebe erhebliche molekulare und funktionelle Veränderungen aufgrund von Schäden während der Operation oder Vorbereitung erfahren. Slicing-Verfahren haben gezeigt, dass GABAerge Funktion beeinflussen und kann die Induktion der epilepptiformen Aktivitätbeeinflussen 30. Diese Einschränkungen sollten bei der Formulierung einer Hypothese berücksichtigt werden. Bei der Prüfung potenzieller Antiepileptika sollte die Verwendung verschiedener Hirnbereiche in Betracht gezogen werden, da Arzneimittelziele möglicherweise nicht in allen menschlichen Hirnregionen oder allen Patienten ausgedrückt werden. Insbesondere die Hippocampi von TLE-Patienten zeigen oft Anzeichen von Hippocampus-Sklerose, begleitet von einem schweren neuronalen Zellverlust. Es wird empfohlen, Patienteninformationen über pathologische Veränderungen und Krankheitsverlauf, wie z. B. potenzielle Feuerfeststoffe gegenüber Medikamenten, zu erhalten und dies bei der Dateninterpretation zu berücksichtigen.
Zusammenfassend beschreibt diese Methode erfolgreich die Vorbereitung lebender menschlicher Hippocampus-Gehirnscheiben und Induktionstechniken zur Aufzeichnung von zwei verschiedenen Arten von epiptiformer Aktivität. Da die Verfügbarkeit von lebendem menschlichem Hirngewebe selten ist, sollten optimierte Transport- und Aufzeichnungsbedingungen verwendet werden, um eine maximale Leistung von Experimenten mit menschlichen Gehirnscheiben zu gewährleisten. Es wird vorgeschlagen, dass reseziertes menschliches Hirngewebe als präklinisches Validierungswerkzeug zusätzlich zu Nagetiermodellen und Zellkulturexperimenten verwendet werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) für die hervorragende technische Unterstützung. P.F. wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie EXC-2049-390688087 gefördert. Diese Arbeit wurde vom QUEST Center for Transforming Biomedical Research am Berliner Institut für Gesundheit unterstützt.
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |