Den præsenterede protokol beskriver transport og forberedelse af resected humant hippocampal væv med det ultimative mål at bruge vitale hjerne skiver som en præklinisk evaluering værktøj til potentielle antiepileptika stoffer.
Epilepsi påvirker omkring 1% af verdens befolkning og fører til et alvorligt fald i livskvaliteten på grund af igangværende anfald samt høj risiko for pludselig død. På trods af en overflod af tilgængelige behandlingsmuligheder, omkring 30% af patienterne er resistente. Flere nye terapier er blevet udviklet ved hjælp af dyremodeller, selv om antallet af resistente patienter forbliver uændret. En af de sandsynlige årsager er den manglende oversættelse mellem gnavere modeller og mennesker, såsom en svag repræsentation af humane lægemiddelsendance i dyremodeller. Resected human hjernevæv som en præklinisk evaluering værktøj har den fordel at bygge bro over denne translationelle hul. Beskrevet her er en metode til høj kvalitet forberedelse af menneskelige hippocampal hjerne skiver og efterfølgende stabil induktion af epileptiform aktivitet. Protokollen beskriver induktion af burst aktivitet under anvendelse af 8 mM KCl og 4-aminopyridin. Denne aktivitet er følsom over for etablerede AED-lacosamid eller nye antiepileptiske kandidater, såsom dimethylethanolamin (DMEA). Desuden beskriver metoden induktion af beslaglæggelse-lignende hændelser i CA1 af menneskelige hippocampal hjerne skiver ved reduktion af ekstracellulære Mg2 + og anvendelse af bicucullin, en GABAEn receptor blokker. Den eksperimentelle set-up kan bruges til at screene potentielle antiepileptiske stoffer for deres virkninger på epileptiform aktivitet. Desuden kan virkningsmekanismer, der postuleres for specifikke forbindelser, valideres ved hjælp af denne fremgangsmåde i humant væv (f.eks. ved hjælp af patch-clamp-optagelser). Afslutningsvis vil undersøgelse af vitale humane hjernevæv ex vivo (her, resected hippocampus fra patienter, der lider af tidsmæssig lap epilepsi) forbedre den nuværende viden om fysiologiske og patologiske mekanismer i den menneskelige hjerne.
Epilepsi er en af de mest almindelige neurologiske lidelser, der påvirker 1% af verdens befolkning, og er forbundet med øget sygelighed og dødelighed1,,2. Desværre, en tredjedel af patienter, der lider af epilepsi er resistente, på trods af en overflod af tilgængelige behandlingsmuligheder, herunder mere end 20 godkendte antiepileptika (AED’ er)3. Manglende oversættelse af resultater fra præklinisk dyreforsøg til kliniske forsøg er en af grundene til, at lovende behandlingsstrategier ikke er effektive hos mange patienter4. For nylig, neuropeptid Y (NPY) og galanin har vist sig at have antiepileptiske virkninger i dyremodeller; men, når testet i resected humant hjernevæv, kun NPY var effektiv5.
De fleste af de eksisterende viden om grundlæggende neurologiske mekanismer og sygdomsterapi tilgange stammer fra dyremodeller og cellekultur eksperimenter. Selv om disse modeller er informative, repræsenterer de kun enkelte aspekter af komplekse sygdomme hos mennesker og det voksne menneskes hjernenetværk. Alternativt har humant hjernevæv potentiale til at bygge bro over den translationelle kløft, men er sjældent tilgængelig for funktionelle undersøgelser. For eksempel, post mortem hjernevæv har været et værdifuldt redskab i at undersøge protein udtryk, hjerne morfologi, eller anatomiske forbindelser, selvom neuronal aktivitet er ofte kompromittereter dettevæv6,7,,8,,9,,10,11.
I modsætning hertil er levende resected human hjernevæv blevet undersøgt vedrørende prækliniske stof evaluering, grundlæggende neuronale funktioner og genekspression mønstre12,13,14,15,16,17. En stor fordel ved menneskelige hjerne skiver i forhold til gnaver skiver er den lange levedygtighed af neuronal væv efter resektion og forberedelse. Sammenlignet med gnavere hjerne skiver, som typisk kan registreres i op til 8 timer efter præparat, menneskelige hjerne skiver viser stabil neuronal aktivitet i op til 72 timer, muliggør grundig undersøgelse af disse sjældne og værdifulde prøver12,18.
Flere undersøgelser har undersøgt egenskaber af epileptiform aktivitet i forskellige områder af resected kortikale og hippocampal humant væv og brugt forskellige metoder til induktion af epileptiform aktivitet. I gnavere skiver, epileptiform aktivitet kan induceres ved flere metoder: elektrisk stimulation af DG hilar celler, stigning i ekstracellulære K+ (8-12 mM KCl), blokering af GABAA receptorer ved bicuculline (BIC), blokering af kalium kanaler ved 4-aminopyridin (4-AP), og fjernelse eller reduktion Mg2 + i ekstracellulær opløsning19. Induktion af epileptiform aktivitet i humant væv kræver imidlertid en kombination af mindst to af ovennævnte metoder20,21,22.
Præsenteret her er en metode til fremstilling af menneskelige hippocampal hjerne skiver, som er levedygtige for op til 20 h og vise induktion af epileptiform aktivitet ved anvendelse af høj K+ (8 mM) og 4-AP eller lav Mg2 + og BIC.
Levende resected human hjernevæv er et meget værdifuldt redskab i præklinisk evaluering af AED’er, da det korrekt repræsenterer en intakt menneskelige hjerne mikro-netværk. Den præsenterede protokol beskriver en metode til vævstransport og -forberedelse, som sikrer flodheste i høj kvalitet samt en stabil induktionsmetode til epileptiform aktivitet, der er kritisk for AED-evaluering.
Andre grupper17,20,21 ,22har tidligere påvist undersøgelser af epileptiform aktivitetsamtmetoder til kemisk ellerelektriskinduktion i menneskehjernens skiver . Denne protokol beskriver induktion af stabil burst aktivitet i skiver fra forskellige patienter via anvendelse af høj K++4-AP samt induktion af SLEs i CA1 område via anvendelse af lav Mg2 ++BIC. Det blev konstateret, at induktionen af burst aktivitet er mere konsekvent (80% af testede skiver i 15 patienter) end induktion af små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og små og brug (50% af testede skiver hos en patient). Indtil videre er induktionen af SLE’er imidlertid kun blevet testet hos én patient. Ikke desto mindre anbefales induktion af små og små og mellemstore enheder ved lav Mg2++BIC, da sles endnu ikke har været i stand til at blive induceret ved hjælp af høj K++4-AP.
Flere undersøgelser har indført metoder til transport og forberedelse af humant hjernevæv og fremhæver ofte tre faktorer, der er afgørende for neuronal overlevelse: transporttid, brugte transportløsninger og opbevaring af betingelser.
For optimal skive levedygtighed, nogle grupper tyder på, at transport af resected hjernevæv være så kort som muligt. Men operationsrum og laboratorier er sjældent i umiddelbar nærhed, hvilket betyder, at skivekvaliteten kan blive kompromitteret på grund af lang transport. Nogle grupper har overvundet denne hindring ved at anvende konstant O2 på løsningen under transport12. Vi har transporteret hjernevæv i korte (max = 15 min) og lange (op til 1 h) perioder uden konstant yderligere O2 forsyning under transport, svarende til andregrupper 18,,25. I disse tilfælde blev der ikke observeret forskelle i vævskvalitet under epileptiform-optagelser. I kommunikation med andre grupper på vores institut, skive kvalitet ikke ændre sig for patch-clamp eksperimenter, enten. I modsætning hertil, varians i vævskvalitet muligvis skyldes skader under operationer, langvarig resektion, og udskæring procedure.
Med hensyn til transport- og skæreopløsning udelader alle offentliggjorte metoder NaCl fra opløsninger til at reducere cellehævelse på grund af osmotisk tryk, svarende til standardproceduren for forsøg med gnaverespatch-clamp. Der er dog indtil videre indført flere erstatninger (dvs. saccharosebaseret aCSF13,22, NMDG-baseret aCSF12,26og cholinbaseret aCSF27). Ting og kolleger introducerede NMDG-baserede aCSF til slice forberedelse i 201426 og senere tilføjet en genopretning protokol, som langsomt genindfører NaCl til skiver28. Men, som beskrevet af Ting et al., neuroner af hjernevæv fremstillet i NMDG-baserede aCSF viser højere membranresistens, hvilket påvirker hele celle forsegling under patch-clamp eksperimenter26. Derfor har vi skiftet fra NMDG-baserede aCSF til brugen af cholin-baserede aCSF20, som giver høj kvalitet skiver til både feltpotentiale og patch-clamp optagelser.
Med hensyn til opbevaring af skiver er det almindeligt accepteret, at grænsefladebetingelser giver optimal iltning, der er afgørende for overlevelsen af langeskiver 18. Men andre grupper viser skive overlevelse i op til 72 timer under neddykkede forhold12. I modsætning til tidligere hypotese, menneskelige hjerne skiver synes at være mere modstandsdygtige over for lav iltning eller oxidativstress i forhold til gnaver skiver. Primært, interface kamre har tidligere været brugt til opbevaring af menneskelige hippocampal skiver, selvom neddykkede betingelser anbefales til vedligeholdelse af menneskelige hjerne skiver i patch-clamp eksperimenter.
Som diskuteret af andre grupper, en yderligere kritisk skridt for lange skive overlevelse (interface for <48 h18, nedsænket for <72 h12)er forebyggelse af bakteriel forurening. Gnavere hjerne skiver bruges typisk i elektrofysiologiske optagelser i op til 8 timer, og bakteriel forurening anses ikke for at påvirke skivens levedygtighed i denne periode. Stort antal skiver fremstillet af en resektion og den ualmindelige tilgængelighed af humant hjernevæv fremhæver behovet for at forlænge levedygtigheden af menneskelige hjerne skiver. Denne metode med succes beskriver udarbejdelsen af levende menneskelige hippocampal hjerne skiver, som let kan tilpasses sterile forhold. Men for de optagelser, der udføres her, skive overlevelse strækker sig 20 h var ikke en prioritet.
Registrering i grænsefladekamre har også vist sig at være afgørende for induktion af epileptiform aktivitet såsom SLEs22. Neddykkede forhold, på grund af lav iltning, bruges sjældent til registrering af sles; selv om, de er nødvendige for optisk høj opløsning er nødvendige for patch-clamp eksperimenter. Brugen af en optimeret neddykket type optagelse kammer gør det muligt at optage epileptiform aktivitet (ekstracellulær felt eller enkelt neuron) i menneskelige hjerne skiver, på grund af høj iltning og hurtig lægemiddelapplikation29. Her beskrives metoder og resultater for feltpotentialeoptagelser, men det skal understreges, at patch-clamp-optagelser er blevet udført med succes i muse- og hjerneskiver ved hjælp af dette modificerede optagelseskammer (data ikke vist).
Resected human hjernevæv har en højere translationel værdi i forhold til gnavere modeller. Det repræsenterer et voksent, syge neuronalt netværk, der ikke kan gengives af iPSCs. Men som i ethvert in vitro-system, menneskelige hjerne skiver repræsenterer ikke en intakt menneskelige hjerne. Derudover kan de registrerede neuronale netværk af resected hjernevæv gennemgå betydelige molekylære og funktionelle ændringer på grund af skader under drift eller forberedelse. Udskæringsprocedurer har vist sig at påvirke GABAergic funktion og kan påvirke induktion af epileptiform aktivitet30. Disse begrænsninger bør overvejes, samtidig med at der formuleres en hypotese. Ved test af potentielle antiepileptika bør brugen af forskellige hjerneområder overvejes, da narkotikamål muligvis ikke udtrykkes i alle menneskelige hjerneregioner eller alle patienter. Især hippocampi af TLE patienter viser ofte tegn på hippocampal sklerose ledsaget af svær neuronal celletab. Det anbefales at indhente patientoplysninger om patologiske ændringer og sygdomshistorie, såsom potentiel ildfast mod medicin, og overveje dette under datafortolkning.
Afslutningsvis beskriver denne metode med succes forberedelsen af levende menneskelige hippocampal hjerne skiver og induktion teknikker til registrering af to forskellige typer af epileptiform aktivitet. Da tilgængeligheden af levende humant hjernevæv er sjældent, bør der anvendes optimerede transport- og registreringsforhold for at sikre maksimal effekt fra eksperimenter, der bruger menneskehjernskiver. Det foreslås, at resected human hjernevæv kan bruges som en præklinisk validering værktøj ud over gnaver modeller og cellekultur eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) for fremragende teknisk bistand. P.F. blev finansieret af den tyske forskningsfond (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) under Tysklands Excellence Strategy-EXC-2049-390688087. Dette arbejde er blevet støttet af QUEST Center for Transforming Biomedical Research ved Berlin Institute of Health.
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |