Formålet med denne protokol er at anvende molekylærdynamiksimuleringer til at undersøge de dynamiske strukturelle ændringer, der opstår som følge af aktivering af mutationer af EGFR-kinaseproteinet.
Talrige somatiske mutationer, der forekommer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) familie (ErbB) af receptor tyrosin kinaser (RTK) er blevet rapporteret fra kræftpatienter, selv om relativt få er blevet testet og vist sig at forårsage funktionelle ændringer i ErbBs. ErbB-receptorerne er nedtonede og aktiveres ved ligandbinding, og dynamiske konformationsmæssige ændringer af receptorerne er iboende til induktion af downstream-signalering. For to mutationer, der eksperimentelt er påvist for at ændre EGFR-funktion, A702V og Δ746ELREA 750-sletningsmutationen, illustrerer vi i følgende protokol, hvordan molekylær dynamik (MD) simuleringer kan sonde den (1) kropslige stabilitet af den mutante tyrosin kinasestruktur sammenlignet med egfr af vildtypen;750 2) strukturelle konsekvenser og kropslige overgange og deres forhold til observerede funktionelle ændringer 3) mutationers virkninger på styrken af bindende ATP samt til binding mellem kinasedomæderne i den aktiverede asymmetriske dimer og (4) mutationers virkninger på nøgleinteraktioner inden for EGFR-bindingsstedet i forbindelse med det aktiverede enzym. Protokollen giver en detaljeret trinvis procedure samt vejledning, der kan være mere generelt nyttige til undersøgelse af proteinstrukturer ved hjælp af MD simuleringer som et middel til at sonde strukturelle dynamik og forholdet til biologiske funktion.
Den humane epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) familie (ErbB) af receptor tyrosin kinaser (RTKs) omfatter fire medlemmer – EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 og ErbB4/HER4. ErbB-receptorerne regulerer grundlæggende cellulære processer såsom cellevækst og spredning, differentiering, migration og overlevelse1,2, og er således potente proto-onkogener. Afvigende aktivitet af ErbB receptorer, især EGFR og ErbB2, har været ofte forbundet med menneskelige kræftformer gør ErbB receptorer centrale mål for kræft terapeutiske2,3.
Flere somatiske ændringer af ERBB-gener er blevet rapporteret fra humanemaligniteter 3,4,5. De bedst karakteriserede eksempler omfatter tilbagevendende, aktiverende punktmutationer og korte in-frame sletninger i EGFR kinase domæne i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Disse EGFR-mutationer udgør de vigtigste drivkræfter bag kræftvækst og forudsiger følsomhed over for EGFR rettet modkræftlægemidler6,7,8. Men i de fleste kræftformer forekommer somatiske mutationer i EGFR uden for disse tilbagevendende “hotspots” og fordeles over hele receptorens 1210-restspænd. Faktisk har de fleste af resterne langs EGFR primærsekvensen vist sig at være muteret i human kræft9. Ikke desto mindre er den funktionelle betydning af langt størstedelen af de kræftrelaterede EGFR-mutationer fortsat ukendt, bortset fra de få hotspots.
ErbBs’ monomeriske struktur består af et stort aminoterminal ekstracellulært domæne, efterfulgt af en enkelt transmembrane helix, der fører til det intracellulære tyrosinkinasedomæne og C-terminal haleregionen, der indeholder dockingsteder for intracellulære signalproteiner. Ligand binding udløser en dramatisk konformationsændring i det ekstracellulære domæne, som letter dannelsen af receptordæmpere ved at udsætte dimeriseringsarmene, der symmetrisk krydser over hinanden og interagerer med deres aromatiske/hydrofobe overflader. Ved receptordysningsdannelse kommer tyrosinkinasedomæderne asymmetrisk i kontakt (figur 1), hvilket resulterer i aktivering af de kinaser, der fosforlater receptormonommeres C-terminale haler og efterfølgende aktivering af nedstrømssignalering10,11.
Figur 1: Struktur af EGFR-dimer. EGFR dimerizes når de ekstracellulære domæner binde vækstfaktor (EGF, epidermal vækstfaktor). Modtageren kinase domæne aktiveres derefter gennem asymmetrisk interaktion med aktivator kinase domæne, og C-terminal haler er autophosphorylated på tyrosin rester (Ændret fra Tamirat et al.12). Klik her for at se en større version af dette tal.
På grund af de dynamiske strukturelle omorganiseringer, der opstår under monomerdæmperovergangene, sammen med kinaseaktivering, der er forbundet med dannelsen af en asymmetrisk dimer, kan mutationer langs receptorstrukturens fulde længde potentielt have en effekt på receptorfunktionen. Her beskriver vi flere eksempler fra vores tidligere undersøgelser, hvor modellering af mutationen og visualiseringen var tilstrækkelig til at forklare konsekvenserne for funktion.
Eksempel 1: En rapporteret mutation, D595V i ErbB413, førte til øget ErbB4 dimerization og fosforylering14. Visualisering af placeringen af mutationen var en kritisk faktor i forståelsen af de observerede funktionelle virkninger: D595V opstod ved den symmetriske crossover af de dimeriske arme af ectodomain (Figur 2A). Armene er i vid udstrækning aromatiske og hydrofobe, og udskiftning af polære aspartinsyre med valin forventes at øge den “klæbrige” hydrofob interaktioner, stabilisere dimer og dermed øge længden af tid, når fosforylering finder sted14. Det var en overraskelse i starten at finde aspartate i hver arm, men set i bakspejlet kunne man tænke på det som en timing mekanisme for aktivitet, hvor polarsyre sidekæder reducere affinitet og levetid af intakt dimer og dermed begrænse kinase-medieret fosforylering og signalering. Udskiftning med valin ville derefter fjerne denne sikkerhedsforanstaltning ved yderligere at stabilisere ErbB4 dimer.
Figur 2: Placering af en ErbB4-aktiverende mutation og mutationer, der producerer kinasedød ErbB4. a) D595 (aktivering af D595V-mutationen) er placeret på erbBB4-modellens aromatiske/hydrofobiske dimeriske arme våben associeret på vækstfaktor bindende; (rester i nærheden vises som pinde). (B) I ErbB4 hjælper G802 (inaktiverende G802dup mutation) med at danne bindelommen omkring adeninringen af ATP og katalytisk D861 (inaktivering af D861Y-mutation) binder både Mg2+ (ikke vist) og γ-fosfatgruppen AF ATP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Eksempel 2: Man kunne forudse, at somatiske mutationer, der er målrettet ATP-bindende sted for kinase domæne ville ændre eller fjerne enzymatisk aktivitet, der fører til en nedsat eller kinase-døde receptor ude af stand til at signalere. Ud af ni rapporterede mutationer fra patienter med bryst, gastrisk, kolorektal eller NSCLC15, to af de ni mutationer, når de blev testet havde stærkt formindsket fosforylering aktivitet16: G802dup (G → GG) og D861Y. Begge inaktiverende somatiske mutationer blev fundet inden for ATP bindende sted af tyrosin kinase domæne struktur(Figur 2B):fleksibel glycin, duplikeret, ville ændre adenin ring site og små aspartisyre erstattet af volumin tyrosin nær terminal fosfater ville fysisk forhindre Mg2 +-ATP fra bindende. Dog da ErbB4 kan danne en heterodimer med ErbB2 – ErbB2 ikke binder en vækstfaktor og afhænger af tilknytning til en ErbB, der gør for at heterodimerize – ErbB2 (aktiv)– ErbB4 (kinase-døde) heterodimer ville stimulere celleprolifererende via Erk / Akt signalering vej endnu celler ville ikke differentiere på grund af kinase-døde ErbB4 og mangel på STAT5 pathway aktivering16.
I nyere undersøgelser viste det sig, at ErbBs dynamiske bevægelser var relevante for at forstå nogle mutanters virkninger på ErbB-funktionen, især mutationer, der forekommer inden for tyrosinkinasedomænet. Den tyrosin kinase domæne består af en N-lap (hovedsagelig β-ark) og C-lap (stort set alfa spiralformet), som er adskilt af katalytisk sted, hvor ATP binder. N-lap omfatter αC helix og P-loop, mens aktivering (A-loop) og katalytiske sløjfer er til stede i C-lap17,18,19. Krystal strukturer af tyrosin kinase domæne afslørede to inaktive konformiteter, de fleste strukturer har Src-lignende inaktiv tilstand. I den aktive kropsbygning er den katalytiske aspartat af A-loop-punkterne mod ATP-bindingsstedet, og αC-helixen er orienteret mod ATP-bindingslommen (“αC-in”-kropsbygning), der danner en stærk glutamat-lysinion-par-interaktion.
Da ErbBs og det komponentkinedomæne er meget dynamiske enheder, og især i tilfælde, hvor mutationens virkninger på funktion og biologisk aktivitet sandsynligvis er tæt forbundet med Erbbbs’ kropslige tilstande, er det vigtigt at vurdere mutationer med hensyn til de forskellige dynamiske ændringer, de ville opleve. Røntgenkrystalstrukturer af ErbBs giver statiske øjebliksbilleder af 3D-strukturen, som måske eller måske ikke er relevante for at forstå de dynamiske konsekvenser af en mutation. For at kunne undersøge de dynamiske ændringer, der svarer til det “energilandskab”, der er tilgængeligt for en tredimensionel (3D) struktur, anvendes molekylære dynamikuleringer (MD) i vidudstrækning 20. I tilfælde af mutationer, der ville føre til lokale konformationelle ændringer inden for tyrosin kinase domæne eller stabilisering af et kompleks, simuleringer i rækkefølgen af 100 ns kan være tilstrækkelig. Men større konformationelle ændringer (f.eks overgange mellem den aktive og inaktive konformation af kinase domæne) kræver en længere simuleringstid – i størrelsesordenen mikrosekunder21.
Med hensyn til den protokol, der er beskrevet nedenfor, overvejer vi to aktiverende mutationer inden for tyrosinkinasedomænet (figur 3). Begge mutationer er placeret inden for kinase domæne på steder, der oplever lokale konformationelle ændringer, der dikterer, om kinasen er aktiv eller ej, og dermed MD simuleringer blev anvendt i begge tilfælde. I det første tilfælde, vi overveje ændringer, der direkte påvirker ATP bindende site og katalysator maskiner i EGFR modtager kinase domæne, specifikt undersøge konsekvenserne af en exon 19 sletning mutation, der er meget involveret i NSCLC4,7. Δ746ELREA750-mutationen, som reducerer længden af β3-αC-løkken forud for αC-helixen – den helix, der bevæger sig mod bindingen/det aktive sted ved kinaseaktivering og deltager i at danne det kritiske elektrostatiske samspil mellem Helix og K745 ved at placere lysinen til interaktion med ATP – prædisponerer domænet til aktivering12. I det andet tilfælde, vi anser A702V mutation af EGFR, vist sig at være en ny gevinst-of-funktion aktiverende mutation afsløret af iScream platform9 og identificeret i en NSCLC patient22. Alanine-702 på modtageren kinase domæne er placeret på sidekvarma segment B på grænsefladen af modtageren og aktivator kinase domæner, hvor denne asymmetriske kinase dimer kompleks og kinase kropsbygning ændringer er nødvendige for aktivering9.
Figur 3: EgfR’s asymmetriske kinasedomænegred. A702V-mutationen vil blive placeret på aktivator- og modtagerkinasedomædernes kritiske grænseflade, der støder op til αC-helix og tæt på isoleucin 941 af aktivatorkinase. Konformationelle ændringer induceret ved dannelse af den asymmetriske dimer føre til kinase aktivering. Β3-αC-løkken, der indeholder ELREA-sekvensen, går umiddelbart foran αC-helixen. under aktivering bevæger αC-helixen sig indad mod ATP-bindingsstedet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse fokuserer på at bruge molekylær dynamik simuleringer til at undersøge lokale og globale strukturelle ændringer, der opstår fra aktivering somatiske mutationer af EGFR kinase domæne. Selv om røntgenkrystalstrukturer af vilde og mutante EGFR’er giver uvurderlig strukturel indsigt, skildrer de en eller nogle få statiske fremstillinger. Iboende for ErbBs’ biologiske funktion er imidlertid de nødvendige overgange mellem enzymatisk inaktiv og aktiv tyrosinkinase, der påberåber sig dynamiske ændringer i både strukturen og de intramolekylære interaktioner mellem kinasemonomerer. Der blev således foretaget MD-simuleringer for at undersøge EGFR-tyrosinkinasedomænets dynamiske karakter, herunder den vilde struktur, den indførte ΔELREA-sletningsmutation og A702V-mutationen. Disse simuleringer var en succes med at belyse disse mutationers sandsynlige rolle i strukturerne, og hvordan deres virkninger på kropsbygning af tyrosinkinasedomænet ville føre til de eksperimentelt observerede stigninger i EGFR-kinaseaktiviteten.
Et afgørende skridt i denne protokol er brugen af en relevant struktur til at vurdere virkningen af mutationen. En måde at vælge en relevant simulering input struktur er at visualisere placeringen af mutationen i den statiske 3D-struktur og undersøge dens mulige indvirkning med hensyn til de omkringliggende aminosyrer og strukturelle enheder. I denne undersøgelse, for eksempel, da A702V EGFR mutation er placeret på den sidetøbiske B segment, der danner den asymmetriske dimer interface, brugen af dimer struktur for simuleringen i modsætning til monomer er kritisk. Anvendelsen af en monomerisk struktur ville have udsat modtagerens menekskinase-segmentet for opløsningsmidlet, hvilket ville have frataget det fra de stabiliserende interaktioner, forstærket af mutationen til en større hydrofobe rest og interaktioner med isoleucin 941 fra C-lobe rester af aktivatorkinaser. Det er desuden værd at bemærke, at den 3D-struktur, der udgøres af koordinaterne i en FBF-fil, ikke nødvendigvis svarer til den biologisk relevante struktur, der bør anvendes til undersøgelse. FBF-koordinaterne svarer f.eks. Matricer i FBF-filen kan bruges (f.eks. inden for Chimera) til at rekonstruere de krystallografisk relaterede strukturer, som kan visualiseres for at identificere kæder, der svarer til den biologisk relevante 3D-struktur som rapporteret i den oprindeligepublikation 42. Et andet vigtigt trin i protokollen er at forberede simuleringsinputstrukturen korrekt, såsom opbygning af manglende aminosyrer i forskellige loop-regioner, og især hvor de er placeret i nærheden af mutationen. Selv om der findes mange EGFR-strukturer af vildtypen i FBF, er der kun et begrænset antal mutante EGFR-strukturer til rådighed. Derfor skal de mutante strukturer også modelleres; for en enkelt restmutation som A702V blev Chimera brugt til at mutere restproduktet; der henviser til, at modeller blev anvendt til ΔELREA-sletningsmutationen.
De forskellige parametre, der anvendes i simuleringsinputfilerne – for eksempel antallet af minimeringscyklusser, opvarmning af systemet til den ønskede temperatur på én gang eller i stedet opvarmes langsomt gennem flere mellemliggende temperaturer, tidsperioden for ligevægt og for produktionssimuleringer – kan ændres baseret på studiemolekylet, arbejdets formål og ens egne præferencer. Mens du udfører MD simuleringer, er det også almindeligt at komme på tværs af fejl, der kan opstå fra input-filer, spørgsmål i forbindelse med simulering software i brug eller endda en brugerfejl. Derfor er det meget vigtigt at forstå kilden til fejlene ved nøje at undersøge eventuelle fejlmeddelelser. De fleste simuleringsprogrammer har en postliste, hvor brugerne kan stille spørgsmål til softwareudviklerne og andre brugere, som de fleste problemer kan løses. Derudover yder brugermanualer betydelig hjælp til at forstå detaljerne i simuleringsprotokollen, herunder antagelser og begrænsninger. Selvom MD-simulering er et vigtigt redskab til at udforske molekylernes dynamiske egenskaber, skal du huske, at beregningsresultater skal evalueres omhyggeligt sammen med andre informationskilder for at vurdere deres gyldighed. Når det er muligt, arbejde sammen med forskere, der er eksperter på de proteiner, der undersøges, især hvor det er relevant våd-lab eksperimentelle undersøgelser er lavet, som tjener til at give resultater for strukturel fortolkning samt at foreslå eksperimenter, der kan foretages baseret på strukturelle observationer for at teste hypoteser.
I denne undersøgelse var protokollen effektiv til at undersøge de dynamiske strukturelle virkninger af ΔELREA- og A702V-mutationerne på EGFR-kinasestrukturerne. Simuleringerne viste, at ΔELREA fastholder de funktionelt væsentlige αC helix og fremmer et konformationsskift fra den inaktive kinase til en stabiliseret aktiv kinase. Simuleringsresultaterne understøttes uafhængigt af data om lægemiddelrespons, der påviste virkningerne af tyrosinkinasehæmmere på lungekræftcellelinjer med ΔELREA-sletningsmutationen og den vilde EGFR, hvor der blev rapporteret større hæmning af lægemidler, der anerkendte den aktive kinase kropsbygning, for ΔELREA end for egfr12af vildtypen. Med A702V-mutationen indikerer MD-simuleringerne i forhold til den vilde type øget stabilisering af aktivator-modtagerkinasegrænsefladen samt højere affinitet mellem aktivator og modtagerkinase for hinanden, sammen understøtter vedligeholdelsen af den aktiverede kropsbygning af EGFR-kinase. A702V-mutationen, der er placeret på den sammenkædiske B-segment af modtagerens kinase, vil øge hydrofobe interaktioner med aktivatorkinase, hvilket vil forlænge varigheden af den aktiverede tilstand. A702V-mutationen understøtter absence celleoverlevelse uden vækstfaktor og blev identificeret i en in vitro-screening for EGFR-mutationer9.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning finansieres af tilskud til M.S.J fra Akademiet i Finland (308317, 320005), Sigrid Juselius Foundation og Tor, Joe og Pentti Borg mindefond, og til K.E. fra Academy of Finland (274728, 316796), Cancer Foundation of Finland, og Turku University Central Hospital. M.Z.T. er finansieret af Åbo Akademi Ph.d.-netværk for informations- og strukturbiologi. Vi takker CSC IT Center for Science for computerressourcerne og Dr. Jukka Lehtonen for it-supporten under Biocenter Finlands bioinformatiknetværk; og Biocenter Finland strukturelle biologi infrastruktur netværk.
Amber software | University of California, San Francisco | Version 2018 | Executable |
Chimera program | Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco | Version 1.13.1 | Executable |
EGFR struture files | The Protein Data Bank | 3D coordinates of EGFR structures | |
Maestro | Schrödinger LLC | Version 2018-3 | Executable |
Modeller program | The Andrej Šali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco | Included in the Chimera program | |
VMD software | Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign | Version 1.9.3 | Executable |