एक ही वयस्क माउस दिल के अटरिया और वेंट्रिकल्स दोनों से मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप अत्यधिक व्यवहार्य कार्डियक मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स की लगातार पैदावार होती है और फेनोटाइपिंग और इन विट्रो विश्लेषण के लिए इष्टतम सेल-विशिष्ट संस्कृति की स्थिति का विवरण होता है।
कार्डियक फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी की समझ को आगे बढ़ाने के लिए चूहों से कार्डियक मायोसाइट्स का अलगाव और खेती जरूरी रही है । जबकि नवजात माउस दिल से मायोसाइट्स को अलग करना अपेक्षाकृत सीधा है, वयस्क मुरीन दिल से मायोसाइट्स को पसंद किया जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि नवजात कोशिकाओं की तुलना में, वयस्क मायोसाइट्स अधिक सटीक रूप से कोशिका कार्य को फिर से रीकैपिटेट करते हैं क्योंकि यह वीवो में वयस्क हृदय में होताहै। हालांकि, आवश्यक मात्रा और व्यवहार्यता में वयस्क माउस कार्डियक मायोसाइट्स को अलग करना तकनीकी रूप से मुश्किल है, जो एक प्रयोगात्मक गतिरोध में योगदान देता है। इसके अलावा, प्रकाशित प्रक्रियाएं एट्रियल और वेंट्रिकुलर गैर-मायोसाइट कोशिकाओं की कीमत पर या तो एट्रियल या वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के अलगाव के लिए विशिष्ट हैं। यहां वर्णित एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स दोनों को अलग करने के लिए एक विस्तृत विधि है, साथ ही एट्रियल और वेंट्रिकुलर गैर-मायोसाइट्स के साथ, एक ही माउस दिल से। इसके अलावा प्रदान की इष्टतम सेल विशिष्ट संस्कृति विधियों के लिए विवरण हैं, जो सेल व्यवहार्यता और कार्य को बढ़ाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य न केवल वयस्क मुरीन कार्डियक सेल अलगाव की प्रक्रिया में तेजी लानी है, बल्कि एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक कोशिकाओं की जांच के लिए कोशिकाओं की उपज और व्यवहार्यता को भी बढ़ाना है।
प्राथमिक कोशिका संस्कृति एक अभिन्न संसाधन है जो कार्डियक मायोसाइट फ़ंक्शन के विस्तृत मशीनी अध्ययन के लिए एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करता है। उनकी अधिक टिकाऊ प्रकृति और अलगाव में आसानी के कारण, नवजात चूहा एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स ऐसी कोशिका संस्कृतियों का आम स्रोत रहा है1। हालांकि, वयस्क माउस एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स (एएमएएमएस और एएमवीएमएस) इन विट्रो अध्ययनों के लिए अत्यधिक वांछनीय हैं, क्योंकि उनकी आणविक और कार्यात्मक विशेषताएं वयस्क हृदय कोशिकाओं की बेहतर नकल करती हैं। इस प्रकार, वे हृदय रोगों से संबंधित अध्ययनों के लिए प्रासंगिक हो गए हैं, जिनमें से अधिकांश वयस्कों में विकसित होते हैं2।
इसके अलावा, ट्रांसजेनिक और रोग माउस मॉडल की उपलब्धता और उपयोग अलग वयस्क कार्डियक मायोसाइट्स की उपयोगिता का विस्तार करता है। लघु और दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए माउस एएमवीएम के अलगाव और संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन पिछले कई प्रकाशनों2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11में किया गयाहै। इसकी तुलना में, AMAMs के अलगाव के लिए कुछ प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, जिन लोगों का वर्णन किया जाता है, वे मुख्य रूप से अलग-थलग कोशिकाओं के तीव्र अध्ययन के लिए अनुकूलित होते हैं, जिनमें11, 12, 13तारीख तक वर्णित कोईदीर्घकालिकसंस्कृति प्रोटोकॉल नहींहोताहै। जैसे, AMAM अलगाव प्रोटोकॉल को AMVMs के अलगाव और संस्कृति के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल की उपयोगिता और बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया था। इसके अलावा, जबकि AMAMs और AMVMs के अलगाव के लिए अग्रणी अध्ययन संसाधन साबित कर दिया है, वहां इष्टतम समवर्ती अलगाव और दोनों AMAMs और AMVMs, जो प्रत्येक तैयारी के लिए पूरे दिल के कुशल उपयोग में परिणाम की संस्कृति के लिए कोई प्रोटोकॉल हैं ।
अब तक, प्रकाशित एएमएएम और एएमवीएम आइसोलेशन प्रोटोकॉल दोनों सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए थे, क्योंकि एट्रियल और वेंट्रिकुलर फ़ंक्शन पर अधिकांश अध्ययनों में एक कक्ष-विशिष्ट ध्यान दिया गया है। उदाहरण के लिए, AMAMs मुख्य रूप से एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, आंशिक रूप से एट्रियल फिब्रिलेशन (एएफ) में रुचि के कारण, अमेरिका में सबसे आम कार्डियक अतालता हालांकि, वायु सेना एक ऐसी बीमारी नहीं है जो अटरिया को अलग-थलग करने को प्रभावित करती है, और इसे हल्के से गंभीर बाएं वेंट्रिकुलर डिसफंक्शन14में एक कारक भूमिका के रूप में फंसाया गया है। इसके अलावा, संरक्षित इंजेक्शन अंश (एचएफपीईएफ) के साथ दिल की विफलता वाले रोगियों से इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम ने स्पष्ट किया है कि बाएं एट्रियल आकार दिल की विफलता15की संवेदनशीलता के लिए सबसे मजबूत भविष्यवक्ताओं में से एक है।
इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और संकुचन में अपनी भूमिका के अलावा, एट्रियम एक एंडोक्राइन अंग भी है, जो कार्डियोकिन्स (यानी, एट्रियल नेट्रियाटिक पेप्टाइड [एएनपी] को स्रावित करता है जो होम्योपैथिक रूप से रक्तचाप और मात्रा16,17को विनियमित करता है। इसके अलावा, एएनपी (संभवतः एट्रियल मायोसाइट्स से) में वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स16, 17में एक प्रमुख सुरक्षात्मक और एंटी-हाइपरट्रोफिक भूमिका है। हालांकि विभिन्न रोग राज्यों में अटरिया और वेंट्रिकल्स के बीच न्यूरोहोर्मोनल संचार का एक मजबूत निहितार्थ है, इस संचार में अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से पता नहीं लगाया गया है । इस बिंदु को रोगग्रस्त हृदय में गैर-मायोसाइट्स (विशेष रूप से कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाओं) की भूमिका और 2) पर ध्यान केंद्रित करते हुए अनुसंधान में वृद्धि से आगे उदाहरण दिया जाता है कि रोग के एक समारोह के रूप में कार्डियक रीमॉडलिंग सीधे कार्डियक मायोसाइट व्यवहार्यता और वैश्विक हृदय कार्य18,19,20,21,22को कैसे प्रभावित करता है। इस प्रकार, दोनों अटरिया और वेंट्रिकल्स से हृदय कोशिकाओं का अध्ययन हृदय रोग विज्ञान में अपनी भूमिकाओं की एक और अधिक पूरी तस्वीर हासिल करने के लिए एक आवश्यक दृष्टिकोण है ।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल शारीरिक और रोगविज्ञानी स्थितियों के तहत एक ही माउस दिल से एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, यह विधि एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स की संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक इष्टतम स्थितियों का वर्णन करने वाला पहला है, क्योंकि वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए स्थितियां पहले ही प्रकाशित की जा चुकी हैं।
यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता, जैसा कि कोशिका उपज और संस्कृति में कोशिकाओं के समग्र स्वास्थ्य द्वारा निर्धारित किया जाता है, कई नियंत्रणीय कारकों पर निर्भर करता है। माउस से ही शुरू, यह प्रलेखित किया गया है कि जानवर पर लगाया गया तनाव संस्कृति में कोशिका उपज और व्यवहार्यता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, संभवतः अतिरिक्त प्रणालीगत कोर्टिसोल, कैटेकोलामिन,और कार्डियक ऊतक2,5,7की हाइपरकॉन्टाइल स्थिति के कारण। इन कारणों से बलि देने से पहले जानवर को चिंताजनक ढंग से न करने के उपाय किए जाने चाहिए। इस तरह के उपायों में जानवर के पिंजरे को कवर करना और बलिदान से पहले विवारियम के बाहर समय सीमित करना शामिल है । आमतौर पर इच्छामृत्यु के लिए उपयोग किए जाने वाले हेपरिन और कई बार्बिटुरेट्स सिग्नलिंग रास्तों को प्रभावित कर सकते हैं; इस प्रकार, इच्छामृत्यु की इष्टतम विधि तदनुसार अनुकूलित की जानी चाहिए। जानवर की उम्र का अलग-थलग कोशिकाओं की गुणवत्ता और व्यवहार्यता पर काफी प्रभाव पड़ता है, जो उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के साथ समवर्ती रूप से होने वाले इंटरस्टिटियल फाइब्रोसिस के प्रगतिशील संचय के कारण सबसे अधिक संभावना है, जो ऊतक पाचन25को प्रभावित कर सकता है। यहां प्रस्तुत नहीं किए गए आंकड़ों में, जबकि ऊपर वर्णित विधि 78 सप्ताह तक के चूहों में काम करती है, कोशिकाओं की गुणवत्ता इन पुराने जानवरों में कम थी।
वर्णित अलगाव प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम, साथ ही प्रतिगामी परफ्यूजन के लिए लैंगेंडोर्फ उपकरण की विशेषता वाले अन्य प्रोटोकॉल, दिल का कैनुलेशन और प्रारंभिक पर्फ्यूजन है। इष्टतम परिणामों के लिए, आरोही महाधमनी के कैनुलेशन और परफ्यूजन की दीक्षा के लिए हृदय उन्मूलन से समय 90 एस से अधिक नहीं लेना चाहिए। समय के अलावा, दो अतिरिक्त महत्वपूर्ण कारक कैनुला की गहराई और परफ्यूजन उपकरण से हवा एम्बोली शुरू करने की संभावना हैं। तदनुसार, कैनुला को आरोही महाधमनी में उन्नत किया जाना चाहिए ताकि महाधमनी जड़ में प्रवेश न किया जा सके और महाधमनी वाल्व में बाधा उत्पन्न न हो, जो कोरोनरी जहाजों के परफ्यूजन को ख़राब कर देगा।
पाचन प्रक्रिया के दौरान, पाचन एंजाइम कोलेजनाज के लंबे समय तक संपर्क में रहने से बचने के लिए दिल की कठोरता का नियमित रूप से परीक्षण करना महत्वपूर्ण है, जो कार्डियक मायोसाइट कैल्शियम सहिष्णुता को कम करता है। अलग वेंट्रिकुलर मायोसिटे संस्कृतियों में कैल्शियम पुनर्परिचय के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल स्टोर संचालित कैल्शियम चैनलों के माध्यम से अनुचित कैल्शियम प्रवाह के माध्यम से कार्डियक मायोसाइट मौत को सीमित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पछताया कैल्शियम पुनर्परिचय अलग अलिंद मायोसाइट संस्कृतियों के लिए नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह लघु और दीर्घकालिक संस्कृति12के दौरान सेल मृत्यु को बढ़ावा देगा। आगे की सावधानी के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले परफ्यूजन और पाचन बफ़र्स में कार्डियक मांसपेशी संकुचन अवरोधक ब्यूटेनेडिएक मोनोक्सीम (बीडीएम) शामिल हैं ताकि अलग-थलग मायोसाइट्स के हाइपरकंट्राशेक्शन से बचा जा सके, साथ ही कैल्शियम विरोधाभास, दोनों ही प्रभाव मायोसाइट व्यवहार्यता26। हालांकि, बीडीएम से ब्लेबिस्टिन में स्विच को नोट किया जाना चाहिए, क्योंकि यह अलग-थलग कार्डियक मायोसाइट्स के लिए मीडिया को बनाए रखने में पसंदीदा एंटी-कॉन्ट्रैक्टाइल एजेंट है। दिखाए गए आंकड़ों में, ब्लेबिस्टिन अलग-थलग कार्डियक मायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अधिक व्यवहार्यता प्रदान करता है।
अलगाव के तुरंत बाद, हृदय कोशिकाओं, विशेष रूप से मायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के असर पर विचार करना महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित कार्डियक नॉन-मायोसाइट आइसोलेशन एंड कल्टिंग प्रोटोकॉल सामान्य तरीकों पर आधारित है जो विभिन्न हृदय कोशिकाओं के विभिन्न घनत्व और चिपकने वाले गुणों का लाभ उठाते हैं। गैर-मायोसाइट्स का लाभ संस्कृति में उनकी उच्च विस्तार क्षमता है; इस प्रकार, कार्डियक मायोसाइट्स के विपरीत, वे स्थायीकरण के लिए पासिंग करने के लिए उत्तरदायी हैं। हालांकि, यह ज्ञात है कि एफबीएस के साथ मध्यम पूरकता सहित खेती की स्थिति, कार्डियक मायोसाइट कार्यक्षमता27को प्रभावित कर सकती है। यहां वर्णित संस्कृति मीडिया को व्यवहार्यता को अनुकूलित करने और कार्यात्मक derangements को सीमित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, विशेष रूप से अलग अलिंद मायोसाइट्स के लिए। जबकि ब्लेबिस्टिन पूरकता के अभाव में संस्कृति के बाद अलग-अलग कार्डियक मायोसाइट्स में कोई खुलकर बिगड़ा संकुचन क्षमता नहीं देखी गई थी, अध्ययन जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, संकुचन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और वीवो-आधारित आणविक सिग्नलिंग में अन्य एकल-कोशिका को अलगाव के तुरंत बाद किया जाना चाहिए, जब सारकोमीरिक संरचना और आणविक हस्ताक्षर अभी भी दिल की नकल करता है।
एट्रियल मायोसाइट की एक बानगी विशेषता उनके संकुचन समारोह के अलावा, अपार गुप्त क्षमता के साथ एक अंतःस्रावी कोशिका के रूप में चांदनी करने की क्षमता है। शारीरिक परिस्थितियों में, एट्रियल मायोसाइट्स बड़ी मात्रा में एएनपी का उत्पादन करते हैं, जो एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में संग्रहित होता है और बड़े घने-कोर स्रावित कणिकाओं में उत्तेजना16,17प्राप्त करने पर विनियमित एक्सोसाइटोसिस के लिए तैयार होता है। जबकि कई अलग-अलग एट्रियल मायोसाइट अध्ययन उनके अद्वितीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, यह संस्कृति मीडिया डिजाइन करने वाला पहला अध्ययन है। यह दीर्घकालिक व्यवहार्यता के साथ-साथ अलिंद मायोसाइट्स के एंडोक्राइन और संकुचन गुणों के बनाए गए कार्यों को बढ़ावा देने की अनुमति देता है। खेती के लिए यह उपन्यास विधि, साथ ही एक ही माउस दिल से एट्रियल और वेंट्रिकुलर कक्षों से सभी कोशिका प्रकारों का एक साथ अलगाव, एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स दोनों के शारीरिक और रोगविज्ञानी गुणों पर अध्ययन के लिए उपयोगी और प्रभावोत्पादक होगा।
The authors have nothing to disclose.
ईए.B को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1F31HL140850), एआरसीएस फाउंडेशन, इंक, सैन डिएगो अध्याय द्वारा समर्थित किया गया था, और एक रीस-चुरा रिसर्च फाउंडेशन फिलिप्स गॉसेविट्ज, एसडीएसयू हार्ट इंस्टीट्यूट के एमडी स्कॉलर हैं। ईए.B और एएस .B को इनमोरी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। CCG द्वारा (NIH) अनुदान R01 HL135893, R01 HL141463 और HL149931 ।
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
Spring Scissors – 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |