Summary
Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.
Abstract
Het isoleren en cultiveren van cardiale myocyten van muizen is essentieel geweest voor het bevorderen van het begrip van hartfysiologie en pathofysiologie. Hoewel het isoleren van myocyten uit neonatale muisharten relatief eenvoudig is, hebben myocyten van het volwassen murinehart de voorkeur. Dit komt omdat in vergelijking met neonatale cellen, volwassen myocyten nauwkeuriger celfunctie samenvatten zoals het voorkomt in het volwassen hart in vivo. Het is echter technisch moeilijk om volwassen muis cardiac myocyten te isoleren in de nodige hoeveelheden en levensvatbaarheid, wat bijdraagt aan een experimentele impasse. Bovendien zijn gepubliceerde procedures specifiek voor de isolatie van atriale of ventriculaire myocyten ten koste van atriale en ventriculaire niet-myocytencellen. Hier beschreven is een gedetailleerde methode voor het isoleren van zowel atriale als ventriculaire cardiale myocyten, samen met atriale en ventriculaire niet-myocyten, tegelijkertijd van een enkel muizenhart. Ook worden de details verstrekt voor optimale celspecifieke culturingmethoden, die de levensvatbaarheid en functie van cellen verbeteren. Dit protocol heeft niet alleen tot doel het proces van volwassen murine hartcelisolatie te versnellen, maar ook om de opbrengst en levensvatbaarheid van cellen voor onderzoeken van atriale en ventriculaire hartcellen te verhogen.
Introduction
Primaire celkweek is een integrale hulpbron die een gecontroleerde omgeving biedt voor gedetailleerde mechanistische studies naar de cardiale myocytenfunctie. Vanwege hun duurzamere aard en gemak van isolatie zijn neonatale rattenatriale en ventriculaire myocyten de gemeenschappelijke bron van dergelijke celculturen geweest1. Volwassen muisatriale en ventriculaire myocyten (AMAMs en AMVMs) zijn echter zeer wenselijk voor in vitro studies, omdat hun moleculaire en functionele kenmerken die van volwassen hartcellen beter nabootsen. Zo zijn ze relevant geworden voor studies met betrekking tot hartpathologieën, waarvan de meeste zich ontwikkelen bij volwassenen2.
Bovendien breidt de beschikbaarheid en het gebruik van transgene en ziektemuismodellen het nut van geïsoleerde volwassen cardiale myocyten uit. Protocollen voor de isolatie en cultuur van muis-AMVM 's voor korte- en langetermijnstudies zijn beschreven in talrijke eerdere publicaties2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Ter vergelijking: er zijn weinig protocollen beschreven voor het isoleren van AMAMs. Bovendien zijn de beschreven cellen in de eerste plaats geoptimaliseerd voor acute studies van vers geïsoleerde cellen, zonder dat er tot op heden 11,12 ,13een culturingprotocol voor de lange termijn is beschreven . Als zodanig zijn AMAM-isolatieprotocollen niet ontworpen om het nut en de veelzijdigheid van gepubliceerde protocollen voor de isolatie en cultuur van AMVM's te bieden. Hoewel de baanbrekende studies voor de isolatie van AMAMs en AMVM's vindingrijk zijn gebleken, zijn er bovendien geen protocollen voor optimale gelijktijdige isolatie en cultuur van zowel AMAMs als AMVMs, wat resulteert in een efficiënt gebruik van het hele hart voor elke voorbereiding.
Tot nu toe waren gepubliceerde AMAM- en AMVM-isolatieprotocollen niet ontworpen voor gelijktijdige isolatie van beide celtypen, omdat de meeste studies over de atriale en ventriculaire functie een kamerspecifieke focus hebben. AMAMs worden bijvoorbeeld voornamelijk gebruikt om atriale myocytelektrofysiologie te bestuderen, deels vanwege de interesse in atriumfibrilleren (AF), de meest voorkomende hartritmestoornissen in de VS. AF is echter geen ziekte die de atria op zichzelf aantast, en het is betrokken als een veroorzaker van milde tot ernstige linkerventrikeldisfunctie14. Bovendien hebben elektrocardiogrammen van patiënten met hartfalen met geconserveerde ejectiefractie (HFpEF) aangetoond dat de linker atriale grootte een van de sterkste voorspellers is voor gevoeligheid voor hartfalen15.
Naast zijn rol in elektrofysiologie en contractiliteit, is het atrium ook een endocriene orgaan, dat cardiokines afscheidt (d.w.z. atriale natriuretische peptide [ANP]) die de bloeddruk en volume16,17homeostatisch reguleren . Bovendien heeft ANP (vermoedelijk van atriale myocyten) een prominente beschermende en antihypertrofe rol in ventriculaire myocyten16,17. Hoewel er een sterke implicatie is van neurohormonale communicatie tussen atria en ventrikels in verschillende ziektetoestanden, zijn de mechanismen die aan deze communicatie ten grondslag liggen niet volledig onderzocht. Dit punt wordt verder geïllustreerd door de toename van onderzoek gericht op 1) de rol van niet-myocyten (met name cardiale fibroblasten en immuuncellen) in het zieke hart en 2) hoe cardiale remodellering als functie van de ziekte direct de levensvatbaarheid van cardiale myocyten en de wereldwijde hartfunctie beïnvloedt18,19,20,21,22. Het bestuderen van hartcellen uit zowel atria als ventrikels is dus een noodzakelijke aanpak om een vollediger beeld te krijgen van hun rol in de cardiale pathofysiologie.
Het volgende protocol beschrijft de gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een enkel muizenhart onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Bovendien is deze methode de eerste om optimale omstandigheden te beschrijven die nodig zijn voor het behoud van culturen van atriale cardiale myocyten, omdat er al voorwaarden zijn gepubliceerd voor het behoud van culturen van ventriculaire myocyten.
Protocol
Al het onderzoek naar muizen dat in dit artikel wordt gerapporteerd, is beoordeeld en goedgekeurd door de SDSU Institutional Animal Care and Use Committee en voldoet aan de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gepubliceerd door de National Research Council.
1. Voorbereiding van isolatie- en cultuurmedia en beplating
- Bereid 1 L hartperfusiemedia voor gebruik door Joklik gemodificeerde minimale essentiële media (MMEM) toe te voegen aan 1 L steriel water. Stel de pH in op 7,36 met 10 N NaOH, filter vervolgens door een filter van 0,2 μm en bewaar deze tot 2 weken bij 4 °C.
OPMERKING: Joklik MMEM bestaat uit 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2,9 mM NaH2PO4en 11,1 mM D-glucose. Dit wordt aangevuld met 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM taurine (3,75 g/L), 2 mM D-l-carnitine (0,4 g/L), 2 mM creatine en 10 mM butanedione monoxime (1,01 g/L). - Bereid de spijsverteringsbuffer vlak voor de perfusie voor, als volgt: vul 50 ml hartperfusiemedia aan met 6,25 μL van 100 mM CaCl2 (zie stap 1.3) en collagenase type 2 (enzymatische activiteit ~310–320 U/mg dw).
OPMERKING: Weeg het dier voordat u het offert. De hoeveelheid collagenase type 2 aangevuld in de spijsverteringsbuffer wordt bepaald door het gewicht van het dier (2,25 mg collagenase type 2 per 1 g lichaamsgewicht). - Om 100 mM CaCl2voor te bereiden, voeg 1,47 g CaCl2 tot 100 ml water van moleculaire biologiekwaliteit toe. Roer tot het opgelost is, ga dan door een filter van 0,2 μm en bewaar het tot 2 maanden op kamertemperatuur.
- Bereid myocytenstopbuffer 1 voor door 90 ml hartperfusiebuffer aan te vullen met 10 ml foetaal runderserum (FBS) en 125 μL van 100 mM CaCl2. Ga door een filter van 0,2 μm en bewaar het tot 2 weken bij 4 °C.
- Bereid myocytenstopbuffer 2 voor door 114 ml hartperfusiebuffer aan te vullen met 6 ml FBS en 150 μL van 10 mM CaCl2. Ga door een filter van 0,2 μm en bewaar het tot 2 weken bij 4 °C.
- Bereid atriale myocytenplating medium vlak voor de perfusie door 95 ml van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aan te vullen met 4 ml FBS, 1 ml van 100x pen/strep-glutamine, 1 ml 100x insuline-transferrine-selenium en 1 ml 10 μM dexamethason. Ga door een filter van 0,2 μm en bewaar het bij 37 °C tot het plateren.
- Bereid ventriculaire myocytenbeplatingsmedium voor door 95 ml minimaal essentieel medium (MEM) aan te vullen met 4 ml FBS, 1 ml 100x pen/strep-glutamine, 10 ml 1 M HEPES-oplossing, 1 ml 100x insuline-transferrine-selenium en 0,1 g butanedionemonoxime. Ga door een filter van 0,2 μm en bewaar het tot 2 weken bij 4 °C.
- Bereid ventriculaire myocyten met behoud van medium door 99 ml MEM aan te vullen met 1 ml 100x insuline-transferrine-selenium, 0,1 mg/ml runderserumalbumine (BSA), 10 ml 1 M HEPES-oplossing en 1 ml 100x pen/strep-glutamine. Ga door een filter van 0,2 μm en bewaar het tot 2 weken bij 4 °C.
- Om met laminine bedekte experimentele platen en glijbanen te bereiden, ontdooit u de voorraadoplossing voor laminine van de muis (1,19 mg/ml). Voeg 10 μL lamininevoorraadoplossing toe aan elke 1 ml DMEM en meng. Bedek experimentele platen en glijbanen gelijkmatig en bewaar in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur vóór de perfusie om evenwicht mogelijk te maken.
OPMERKING: Gecoate experimentele platen en dia's kunnen tot 2 dagen bij 4 °C worden bewaard.
2. Isolatieapparatuur
- Maak voorafgaand aan elke isolatie de slang en andere componenten van het systeem schoon met drie complete wasbeurten van 70% EtOH door de bellenvanger naar boven te vullen (sluit de onderste afsluitkraan af en houd de bovenste stopkraan open).
- Spoel het complete systeem 3x af met steriele H2O door de bellenvanger naar boven te vullen (sluit de onderste afsluitkraan af en houd de bovenste stopkraan open).
- Spoel het volledige systeem uit met een hartperfusiebuffer en vul de bellenvanger halverwege met media.
- Zet het circulerende waterbad op 37 °C.
- Zet een waterbad voor media op 37 °C.
- Verwijder eventuele luchtbellen in de peristaltische pompslang.
- Stel het debiet van de peristaltische pomp in op 3 ml/min.
3. Chirurgische ingreep (niet-overleving)
- Week chirurgische instrumenten in 70% EtOH gedurende ten minste 5 minuten.
- Plaats de hartperfusiemedia, myocytenstopbuffers en de spijsverteringsbuffer in het waterbad van 37 °C.
- Plaats het atriale myocytenplateermedium, het ventriculaire myocytenplateermedium en het ventriculaire myocytenbehoudt medium in een 37 °C, 5% CO2 incubator 1 uur voor gebruik en maak de doppen los om evenwicht mogelijk te maken.
- Injecteer 10 weken oude mannelijke of vrouwelijke C57b6/j muizen intraperitoneaal (i.p.) met 0,35 ml heparine, verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot 100 IE/ml. Laat het medicijn ongeveer 10 minuten in werking treden.
OPMERKING: Als twee harten aan deze isolatieprocedure moeten worden onderworpen, kan de tweede muis op dit punt in de eerste procedure worden verdoofd en heparine worden toegediend. Om stress op het dier te minimaliseren, kan lichte anesthesie worden toegediend met behulp van 2% isofluraan/zuurstofmengsel in een hermetisch afgesloten inductiekamer. - Verdoof het dier met een isofluraan/zuurstofmengsel van 2% en injecteer i.p. met pentobarbital (0,3 ml uit 10 mg/ml bouillon) en bereid vervolgens de borstkas voor door te zwabberen met 70% EtOH.
- Bereid een gebonden 5-0 zijden hechting voor om klaar te zijn om het hart aan de perfusie canule te binden. Monteer canule direct naast de chirurgische microscoop.
- Open snel de borstkas door eerst een midline huidincisie te maken, van de middenbuik tot de kaak, en vervolgens het buikvlies binnen te gaan met de grote schaar, waardoor het middenrif wordt verwijderd door stompe dissectie. Snijd vervolgens de ribbenkast weg met behulp van de schaar met sneden de borstwand aan de zijkant van beide zijden.
- Knip vezelige verbindingen tussen het hart en de borstwand weg (inclusief thymus). Snijd vervolgens de ribbenkast helemaal bij elkaar weg. Til met behulp van de kleine tang en schaar het hart voorzichtig op bij de top en stel het achterste aspect van het hart bloot.
- Explant het hart door onmiddellijk inferieur aan de innominate slagader op de stijgende aorta te ontleden en plaats het hart onmiddellijk in ijskoude PBS of koude hartperfusiemedia. Ontleed vervolgens snel het resterende weefsel van het geëplanteerde hart in ijskoude hartperfusiemedia, waardoor de opstijgende aorta wordt blootgelegd.
OPMERKING: Het is nuttig om het hart te explanten met de thymus intact om te gebruiken als een anatomisch oriëntatiepunt. - Reinig het gebied rond de aorta van overtollig weefsel met behulp van micro-ontledende tang en schaar. Plaats de aorta op de canule met een tang met fijne punt en zet deze vast met een 5-0 zijden hechting.
OPMERKING: De beste plaatsing vindt meestal plaats met de aorta die zich ongeveer 2 mm op de canule uitstrekt. - Perfuseer het ingeblikte hart met hartperfusiemedia met een debiet van 3 ml/min gedurende 4 minuten. Schakel vervolgens de media over van hartperfusiemedia naar de spijsverteringsbuffer gedurende 15,0−17,5 min perfusie (figuur 1A).
OPMERKING: Het coronaire debiet zal waarschijnlijk toenemen, wat wijst op een effectieve weefselvertering (d.w.z. bleek, gezwollen hart). - Verzamel 8 ml vergistingsbufferstroom tijdens de laatste minuten van de perfusie voor later gebruik in stap 5.4.
- Haal het hart uit de canule en leg het op een plastic kweekschaal van 60 mm. Verwijder overtollig weefsel (d.w.z. aorta, aderen) en dompel het hart onder in 2,5 ml spijsverteringsbuffer ter voorbereiding op mechanische scheiding.
OPMERKING: Op dit punt worden de atria ontleed en moet een experimenteerder het atriale celisolatieprotocol uitvoeren, terwijl een tweede experimenteerder de ventriculaire celisolatie moet uitvoeren.
4. Atriale celisolatie en cultuur
- Ontleed de atria weg van het hart en plaats het in een plastic kweekschaal van 30 mm. Dompel het onder in 0,75 ml vergistingsbuffer voor mechanische scheiding. Bewaar de ventrikels in de 60 mm schotel (stap 3.12) en voer de afzonderlijke isolatiemethoden gelijktijdig uit (punt 5, figuur 1B).
OPMERKING: Op dit punt kunnen de atria en ventrikels verder worden gescheiden als het nodig is om de linker- en rechterkantcellen te isoleren. - Begin met het gehakt en plaag de atria uit elkaar, aanvankelijk met een chirurgische schaar met fijne punt en gevolgd door fijne tang voor verder mincing. Vermijd het roeren van het weefsel en trek spiervezels niet snel uit elkaar.
- Blijf met behulp van een steriele transferpipettip het weefsel gedurende 15 minuten zachtjes mengen en loskoppelen. Observeer elke 5 minuten atriale myocytendissociatie van weefsel onder een 10x objectieve brightfield microscoop. Naarmate weefsel verder wordt verteerd, blijft u voorzichtig weefsel mengen en dissocieren met behulp van een steriele transferpipettip met een kleinere poriegrootte.
- Breng celsuspensie over in een steriele microcentrifugebuis van 2 ml. Spoel de plaat van 30 mm af met 0,75 ml myocytenstopbuffer 1 en combineer met de celsuspensie (eindvolume = 1,5 ml).
- Laat de atriale myocyten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur door de zwaartekracht bezinken. Roer voorzichtig de celsuspensie om myocyten naar de bodem van de conische buis te laten bezinken en een zichtbare pellet te vormen.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 20 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant, dat de niet-myocyten bevat, en breng over naar een 15 ml polypropyleen conische buis met behulp van een steriele pipetpunt zonder de pellet van atriale myocyten te storen.
- Centrifugeer de niet-myocytenfractie gedurende 5 min bij 20.000 x g. Aspireer het supernatant en resuspend de niet-myocytenkorrel in 10 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS).
- Tel niet-myocyten met behulp van een hemocytometer of een andere methode, plaat vervolgens volgens experimentele behoeften, of isoleer verder in individuele specifieke celpopulaties via fluorescentie-geactiveerde celsortering (figuur 1C).
- Resuspendeer de pellet van geïsoleerde atriale myocyten van stap 4,6 in 1 ml atriale myocytenplating medium en breng 10 μL van deze suspensie aan op een hemocytometer. Voer een celtelling uit van staafvormige myocyten per veld.
- Aspirate laminine van voorgecoate experimentele platen/dia's en resuspend de geïsoleerde atriale myocyten in het juiste volume van atriale myocytenplating medium aangevuld met 25 μM blebbistatine. Plaat met de gewenste dichtheid per experimentele behoefte (figuur 1C).
OPMERKING: Typische beplatingsdichtheid voor de hier beschreven langdurige cultivering is 5 x 105 cellen/kamer op vierkamer (1,7 cm2)glazen dia's.
5. Ventriculaire celisolatie en -cultuur
- Begin met het gehakt en plaag het hart uit elkaar ventriculaire weefsel, eerst met een chirurgische schaar met fijne punt en gevolgd door fijne tang voor verder mincing(figuur 1B). Vermijd het roeren van het weefsel door snel spiervezels uit elkaar te trekken.
- Breng de celsuspensie over in een 15 ml polypropyleen conische buis. Spoel de plaat af met 2,5 ml myocytenstopbuffer 1 van 37 °C en combineer met de celsuspensie (eindvolume = 5 ml).
- Blijf met behulp van een steriele transferpipettip het weefsel gedurende 4 minuten zachtjes mengen en loskoppelen. Breng 10 μL van deze celsuspensie aan op de dia en visualiseer de aanwezigheid van staafvormige myocyten om de kwaliteit van de isolatie te garanderen.
- Breng de celsuspensie door een steriel nylonfilter van 100 μm in een 50 ml polypropyleen conische buis. Gebruik 2 ml vergistingsbuffer verzameld in stap 3.12 om eventuele resterende cellen van het steriele nylonfilter te wassen.
- Laat de ventriculaire myocyten gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur bezinken door de zwaartekracht. Roer de gefilterde celsuspensie voorzichtig om myocyten op de bodem van de kegel te laten bezinken en een zichtbare pellet te vormen.
- Zonder de pellet van ventriculaire myocyten te storen, verwijdert u voorzichtig het supernatant (niet-myocyten) en gaat u over op een 50 ml polypropyleen conische buis met behulp van een steriele pipettip. Centrifugeer de niet-myocytenfractie gedurende 5 min bij 20.000 x g. Aspirateer de supernatant en resuspend de niet-myocytenkorrel in 10 ml DMEM aangevuld met 10% FCS.
- Tel niet-myocyten met behulp van een hemocytometer en resuspend in een geschikt volume DMEM aangevuld met 10% FCS. Plaats vervolgens volgens experimentele behoeften, of isoleer verder in individuele specifieke celpopulaties via fluorescentie-geactiveerde celsortering(figuur 1C).
- Resuspendeer de geïsoleerde ventriculaire myocyten in 2 ml myocytenstopbuffer 2 en breng 10 μL celsuspensie aan op de hemocytometer. Voer een celtelling uit van staafvormige myocyten per veld.
- Herintroductie van Ca2+ met behulp van een stapsgewijs paradigma
OPMERKING: Calciumreintroductiestappen zijn specifiek voor ventriculaire myocyten en mogen niet worden uitgevoerd voor atriale myocyten, omdat dit zal leiden tot celdood.- Voeg 50 μL van 10 mM CaCl2 toe aan de ventriculaire myocytencelsuspensie. Meng goed en broed gedurende 4 minuten op kamertemperatuur.
- Voeg nog eens 50 μL cacl2 van 10 mM toe aan de ventriculaire myocytencelsuspensie. Meng goed en broed gedurende 4 minuten op kamertemperatuur.
- Voeg nog eens 100 μL van 10 mM CaCl2 toe aan de ventriculaire myocytencelsuspensie. Meng goed en broed gedurende 4 minuten op kamertemperatuur.
- Voeg 80 μL van 100 mM CaCl2 toe aan de ventriculaire myocytencelsuspensie. Meng goed en broed gedurende 4 minuten op kamertemperatuur.
- Verwijder de lamininecoating van platen of dia's en resuspendeer de geïsoleerde ventriculaire myocyten in een geschikt volume ventriculaire myocytenplateermiddel volgens experimentele behoeften (figuur 1C).
OPMERKING: Typische beplatingsdichtheid voor de hier beschreven langdurige cultivering is 5 x 105 cellen/kamer op vierkamer (1,7 cm2)glazen dia's. Vermijd beplating bij een dichtheid van meer dan 75% samenvloeiing, omdat cellulaire oververdichting het samenklonteren van cellen bevordert, waardoor de bevestiging aan de plaat wordt geremd. Bovendien zullen grote aantallen cellen verloren gaan tijdens de eerste middelgrote verandering. Plaatcellen snel na isolatie, omdat extracellulaire Ca2+ hypercontractie en verlies van levensvatbare myocyten bevordert. - Laat de ventriculaire myocyten ten minste 1 uur bezinken en hechten. Verander vervolgens het medium in ventriculaire myocyten die medium behouden, aangevuld met 25 μM blebbistatine.
OPMERKING: Ventriculaire myocyten kunnen tot 96 uur na beplating in μM blebbistatine worden gekweekt. Experimenten moeten worden uitgevoerd in ventriculaire myocyten die medium behouden bij afwezigheid van blebbistatine.
Representative Results
Een wildtype 10 weken oud C57b6/j muishart resulteert meestal in tussen de 75.000−150.000 atriale myocyten en 1,0−1,5 x 106 ventriculaire myocyten, wat neerkomt op een geschatte opbrengst van 30%−50% voor atriale en ventriculaire myocyten18,19. Tijdens en onmiddellijk na isolementen moeten levensvatbare cardiale myocyten staafvormig en niet-samentrekkend lijken. Een meerderheid van geïsoleerde cardiale myocyten zou deze morfologie moeten aanpassen, wat een indicatie is van effectieve perfusie. De staafvormmorfologie kan ook een voorspeller van levensvatbaarheid zijn. Het protocol heeft tot doel de opbrengst en levensvatbaarheid van myocyten en niet-myocyten geïsoleerd uit een ziek muizenhart te verbeteren. Bovendien is het getest in een model van drukoverbelasting-geïnduceerd hartfalen (gegevens niet weergegeven).
Om een adequate en reproduceerbare isolatie van myocyten en niet-myocyten uit atriale en ventriculaire weefsels te bevestigen, werden cellen waargenomen en gefotografeerd op verschillende dagen in de cultuur (figuur 2). Bovendien werd kwantitatieve reverse-transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR) uitgevoerd om de niveaus van transcripties te meten die celtypespecifiek waren. Cardiale spiertroponine T (Tnnt2) is een marker van cardiale myocyten en werd krachtig uitgedrukt in zowel atriale als ventriculaire cardiale myocytenculturen (figuur 3A). Daarentegen werden atriale natriuretische peptide (Nppa, die meestal uitsluitend wordt uitgedrukt in volwassen atriale cardiale myocyten onder fysiologische omstandigheden) en myosinelichtketen 2 (Myl2, een ventriculaire myocytenspecifiek gen) robuust en specifiek uitgedrukt in respectievelijk atriale en ventriculaire cardiale myocytenculturen (figuur 3B,C).
Fibroblastmarkers, transcriptiefactor 21 (Tcf21), van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor A (Pdgfra) en monocyten-afgeleide celmarkercluster van differentiatie 68 (Cd68) werden uitsluitend uitgedrukt in niet-myocytenculturen geïsoleerd uit zowel atriale als ventriculaire kamers (figuur 3D−F). Geschat wordt dat niet-myocyten ~ 65% van alle hartcellen in gevaar brengen en dat een meerderheid hiervan afkomstig is van een fibroblast of monocyten afgeleide afstamming18,19,23,24. Zo werden markers voor deze twee afstammingen gekozen om representatief te zijn, gezien de interesse in deze cellulaire populaties in studies van verschillende modellen en etiologieën van cardiale pathologie.
Immunostainring van AMAMs en AMVM's voor de t-tubulusmarker dihydropyridine (DHPR, een spanningsafhankelijk (L)-type calciumkanaal) en de ryanodinereceptor (RYR2) toonden intacte t-tubuli aan gedurende isolatie en langetermijncultuur (figuur 4A,B). De overvloed aan DHPR en lokalisatie die kenmerkend en uniek was voor atriale en ventriculaire myocyten wees op de aanwezigheid van t-tubuli. Bovendien was colocalisatie van DHPR met RYR2-immunostainring een indicator van intacte diadstructuren. Immunostainring voor het sarcomerische eiwit alfa-actine in atriale en ventriculaire cardiale myocyten resulteerde in het verwachte sarcomerische striatiepatroon. Het sarcomerische striatiepatroon werd gebruikt om de zuiverheid en levensvatbaarheid van geïsoleerde cardiale myocyten te beoordelen in combinatie met staafvormige morfologische vorm en nucleaire kleuring met TOPRO-3(figuur 4C,D; paars en rood). Zoals verwacht waren ventriculaire cardiale myocyten groot, met een gemiddelde lengte van ~ 150 mm, terwijl atriale cardiale myocyten gemiddeld ~ 75 mm bedroegen. Bovendien vertoonden atriale cardiale myocyten (maar geen ventriculaire cardiale myocyten) bij immunostaininganalyse een robuuste expressie van atriale natriuretische peptide (ANP) in een kleurpatroon dat kenmerkend was voor lokalisatie naar het endoplasmatische reticulum en secretoire korrels (figuur 4C,D; groen).
Een kenmerk dat uniek is voor atriale cardiale myocyten is de classificatie als een endocriene cel naast contractiele cel. Terwijl atriale myocyten ANP afscheiden onder basale omstandigheden, neemt de secretie toe als reactie op secretagogues (d.w.z. de alfa-adrenerge agonist, fenylephrine [PE]). Bovendien scheiden atriale cardiale myocyten ANP af en verwerken ze een deel van het hormoon co-secretioneel van de voorlopertoestand (Pro-ANP, 15 kD) tot het productpeptide (ANP 3kD)16,17. Dit secretoire vermogen kan worden gekwantificeerd via immunoblotdetectie van ANP in de media van geïsoleerde atriale cardiale myocyten als reactie op acute PE-behandeling (figuur 4E). Dit secretoire en verwerkingsvermogen van de atriale cardiale myöcyt bleek gevoelig te zijn voor cultiverende omstandigheden. Het is dus absoluut noodzakelijk dat het atriale myocytenplateermedium wordt aangevuld met dexamethason, insuline, transferrine en selenium.
Figuur 1: Schematisch overzicht van retrograde hartperfusie, spijsvertering en celisolatie. Getoond zijn de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij celisolatie van zowel atriale als ventriculaire kamers tegelijkertijd vanuit een enkel muizenhart. (A) Een enkel muishart wordt snel geconfuleerd via de oplopende aorta en retrograde geperforeerd. (B) Het hart wordt gescheiden in atriale en ventriculaire weefsels voor verdere spijsvertering en fysieke scheiding. (C) Na een adequate vergisting worden de cellen via zwaartekrachtfiltratie gescheiden in in totaal vier cellulaire fracties die worden gekweekt voor latere experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologische analyse van geïsoleerde atriale en ventriculaire cardiale myocyten en niet-myocyten in de cultuur. (A) Geïsoleerde volwassen muisatriale myocyten (AMAMs), (B) volwassen muisatriale niet-myocyten (AMANMs), (C) volwassen muisventrikel myocyten (AMVMs), of (D) volwassen muisventrikel niet-myocyten (AMVNMs) werden geplateerd op 5 x 105 cellen/kamer op vierkamer (1,7 cm2) glazen dia's in respectievelijk geplateerde media. Fasebeelden werden verkregen op aangegeven dagen in de cultuur met behulp van een 10x objectief onder een epifluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve qRT-PCR analyse van geïsoleerde celculturen. RNA werd geëxtraheerd uit vers geïsoleerde cardiale myocyten en niet-myocyten, en mRNA-niveaus voor celspecifieke genmarkers werden bepaald door qRT-PCR4. (A) Tnnt2, hartspier troponine T (cardiale myocyten marker); (B) Nppa, atriale natriuretische peptide (atriale myocytenmarker); (C) Myl2, myosinelichtketen 2 (ventriculaire myocytenmarker); (D) Tcf21, transcriptiefactor 21 (fibroblastmarker); (E) Pdgfra, van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor A (fibroblastmarker); (F) Cd68, cluster van differentiatie 68 (monocyt-afgeleide celmarker). De gegevens vertegenwoordigen een gemiddelde ± SEM (*p ≤ 0,05 die verschilt van alle andere waarden, zoals bepaald door ANOVA, gevolgd door de post-hocanalyse van Newman Keul). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve morfologische en functionele analyse van geïsoleerde atriale en ventriculaire cardiale myoycten. (A) AMAMs of (B) AMVMs werden geplateerd op 5 x 105 cellen/kamer op vierkamer (1,7 cm2) glazen dia's in respectievelijke beplatingsmedia gedurende 1 uur om hechting mogelijk te maken. Dit werd gevolgd door ofwel het opnieuw voeren van atriale myocyten plating media of overschakelen naar ventriculaire myocyten handhaven media aangevuld met blebbistatine voor een extra 16 uur. Culturen werden vervolgens gefixeerd op RYR2 (paars), DHPR (groen) en nucleaire vlek TOPRO-3 (rood). (C) AMAMs of (D) AMVMs werden geïsoleerd en verguld, waarna immunostained voor a-actinine (paars), ANP (groen) en TOPRO-3 (rood). Getoond zijn twee representatieve afbeeldingen voor elk celtype. (E) AMAMs werden geplateerd op 5 x 105 cellen/put op een 12 goed kweekschaal gedurende 16 uur in atriale myocyten plating media. AMAMs werden vervolgens gedurende 0,5 uur behandeld met een voertuig of de ANP-secretagogue (fenylephrine, 50 mM) voordat media werden verzameld en onderworpen aan immunoblotanalyse voor ANP. Voorafgaand aan immunoblotanalyse werden mediamonsters gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 500 x g om cellulair puin te verwijderen en ervoor te zorgen dat het waargenomen ANP het resultaat was van actieve afscheiding van AMAMs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De kwaliteit van de cellen geïsoleerd met behulp van de hier beschreven procedure, zoals bepaald door de celopbrengst en de algehele gezondheid van de cellen in cultuur, hangt af van tal van controleerbare factoren. Te beginnen met de muis zelf, is gedocumenteerd dat stress die aan het dier wordt opgelegd de celopbrengst en levensvatbaarheid in de cultuur negatief kan beïnvloeden, vermoedelijk als gevolg van overmatig systemisch cortisol, catecholamines en de hypercontractiele toestand van hartweefsel2,5,7. Om deze redenen moeten maatregelen worden genomen om te voorkomen dat het dier wordt gealarmeerd voordat het wordt geofferd. Dergelijke maatregelen omvatten het bedekken van de kooi van het dier en het beperken van de tijd buiten vivarium voorafgaand aan het offeren. Heparine en veel barbituraten die vaak worden gebruikt voor euthanasie kunnen signaleringsroutes beïnvloeden; daarom moet de optimale methode van euthanasie dienovereenkomstig worden aangepast. De leeftijd van het dier heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit en levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen, waarschijnlijk als gevolg van progressieve accumulatie van interstitiële fibrose die gelijktijdig met het verouderingsproces optreedt, wat de weefselvertering kan beïnvloeden25. In gegevens die hier niet worden gepresenteerd, terwijl de hierboven beschreven methode werkt bij muizen tot 78 weken oud, was de kwaliteit van de cellen lager bij deze oudere dieren.
De meest kritieke stap in het beschreven isolatieproces, evenals andere protocollen met een Langendorff-apparaat voor retrograde perfusie, is de cannulatie en initiële perfusie van het hart. Voor een optimaal resultaat mag de tijd van hartexplantatie tot cannulatie van de opstijgende aorta en het starten van perfusie niet meer dan 90 s in beslag nemen. Naast tijd zijn twee andere belangrijke factoren de diepte van canule en de mogelijkheid om lucht emboli uit het perfusieapparaat te introduceren. Dienovereenkomstig moet de canule in de opklimmende aorta worden geplaatst om de aortawortel niet te betreden en de aortaklep te belemmeren, wat de doorbloeding van de kransslagaders zou aantasten.
Tijdens het spijsverteringsproces is het belangrijk om regelmatig de stijfheid van het hart te testen om langdurige blootstelling aan het spijsverteringsenzym collagenase te voorkomen, wat de calciumtolerantie voor hartcyten vermindert. Het hierboven beschreven protocol voor calciumherintroductie in de geïsoleerde ventriculaire myocytenculturen is ontworpen om de hart-myocytensterfte te beperken via ongepaste calciuminstroom via opgeslagen calciumkanalen. Opgemerkt moet worden dat de stapsgewijze herintroductie van calcium niet mag worden uitgevoerd voor geïsoleerde atriale myocytenculturen, omdat dit celdood tijdens de korte- en langetermijncultuur zal bevorderen12. Voor verdere voorzorgsmaatregelen omvatten de hier gebruikte perfusie- en spijsverteringsbuffers de hartspiercontractieremmer butanedione monoxime (BDM) om hypercontractie van geïsoleerde myocyten te voorkomen, evenals de calciumparadox, die beide van invloed zijn op de levensvatbaarheid van myocyten26. De overgang van BDM naar blebbistatine moet echter worden opgemerkt, omdat het het favoriete anticontractiele middel is bij het onderhouden van media voor geïsoleerde cardiale myocyten. In niet-getoonde gegevens geeft blebbistatine een grotere levensvatbaarheid voor de langetermijncultuur van geïsoleerde cardiale myocyten.
Onmiddellijk na isolatie is het belangrijk om rekening te houden met de vertakkingen van de langetermijncultuur van hartcellen, vooral myocyten. Het hier beschreven protocol voor cardiale niet-myocytenisolatie en culturing is gebaseerd op gemeenschappelijke methoden die profiteren van de verschillende dichtheden en kleefeigenschappen van verschillende hartcellen. Het voordeel van niet-myocyten is hun hoge expansiepotentieel in cultuur; dus, in tegenstelling tot cardiale myocyten, zijn ze vatbaar voor passivering voor bestendiging. Het is echter bekend dat cultiverende aandoeningen, waaronder medium suppletie met FBS, de cardiale myocytenfunctionaliteit kunnen beïnvloeden27. De hier beschreven cultuurmedia zijn ontworpen om de levensvatbaarheid te optimaliseren en functionele ontregeling te beperken, vooral voor de geïsoleerde atriale myocyten. Hoewel er geen openlijk verminderd contractiel vermogen werd waargenomen in geïsoleerde cardiale myocyten na kweek bij afwezigheid van blebbistatin-suppletie, moeten studies die zich richten op elektrofysiologie, contractiliteit en andere eencellige in vivo-gebaseerde moleculaire signalering snel na isolatie worden uitgevoerd, wanneer de sarcomerische structuur en moleculaire handtekening nog steeds die van het intacte hart nabootsen.
Een kenmerk van de atriale myöcyt is het vermogen om maanlicht als een endocriene cel met immense secretoire capaciteit, naast hun contractiele functie. Onder fysiologische omstandigheden produceren atriale myocyten grote hoeveelheden ANP, die worden opgeslagen in het endoplasmatisch reticulum en in grote dichte-kern secretoire korrels die klaar zijn voor gereguleerde exocytose bij het ontvangen van een stimulus16,17. Terwijl veel geïsoleerde atriale myocytenstudies zich richten op hun unieke elektrofysiologische eigenschappen, is dit de eerste studie die een cultuurmedia ontwerpt. Dit zorgt voor levensvatbaarheid op lange termijn en bevordering van de gehandhaafde functies van endocriene en contractiele eigenschappen van atriale myocyten. Deze nieuwe methode voor cultivering, evenals gelijktijdige isolatie van alle celtypen uit atriale en ventriculaire kamers uit één muishart, zal nuttig en effectief zijn voor studies naar de fysiologische en pathofysiologische eigenschappen van zowel atriale als ventriculaire myocyten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
E.A.B. werd ondersteund door de National Institutes of Health (1F31HL140850), de ARCS Foundation, Inc., San Diego Chapter, en is een Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, M.D. Scholar van het SDSU Heart Institute. E.A.B. en A.S.B. werden ondersteund door de Inamori Foundation. CCG door (NIH) subsidies R01 HL135893, R01 HL141463 en HL149931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| 1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
| Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
| Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
| Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
| Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
| Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
| Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
| Spring Scissors - 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |
References
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jin, J. K., et al. ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart. Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (114), e54012 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Yao, C., et al. Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle. Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).
- Issa, O., et al. Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction. Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).
- de Bold, A. J. Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. Science. 230 (4727), 767-770 (1985).
- McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. The endocrine function of the heart. Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).
- Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. Cardiovascular phenotyping in mice. Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).
- Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse. American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108, 1395-1403 (2003).
- Omatsu-Kanbe, M., et al. Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death. Scientific Reports. , 7 (2017).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).
