Summary

Culture des péricytes capillaires cérébraux pour les mesures cytosoliques du calcium et les études d’imagerie calcique

Published: May 27, 2020
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Summary

Les péricytes capillaires cérébraux sont des acteurs essentiels dans la régulation des propriétés de la barrière céphalo-cérébrale et du flux sanguin. Ce protocole décrit comment les péricytes capillaires cérébraux peuvent être isolés, cultivés, caractérisés en ce qui concerne le type de cellule et appliqués pour des investigations de signalisation intracellulaire de calcium avec des sondes fluorescentes.

Abstract

Les péricytes sont associés aux cellules endothéliales et à l’endfeet astrocytique dans une structure connue sous le nom d’unité neurovasculaire (NVU). La fonction capillaire de pericyte de cerveau n’est pas entièrement connue. Des péricytes ont été suggérés pour être impliqués dans le développement capillaire, la régulation de l’étanchéité endothéliale de barrière et de l’activité de trancytosis, la régulation du tonus capillaire et pour jouer des rôles cruciaux dans certaines pathologies de cerveau.

Les péricytes sont difficiles à étudier dans le cerveau intact en raison des difficultés à visualiser les processus dans le parenchyme cérébral, ainsi que la proximité avec les autres cellules de l’INN. Le présent protocole décrit une méthode d’isolement et de culture des péricytes capillaires capillaires primaires du cerveau bovin et leur utilisation suivante dans les études d’imagerie calcique, où les effets des agonistes impliqués dans la signalisation cérébrale et les pathologies peuvent être étudiés. Les fragments capillaires corticals sont autorisés à s’attacher au fond des flacons de culture et, après 6 jours, les cellules endothéliales et les péricytes sont sortis des fragments capillaires. Les cellules endothéliales sont enlevées par trypsinisation douce et les péricytes sont cultivés pendant 5 jours supplémentaires avant de passer.

Les péricytes isolés sont ensemencés dans des plaques de culture de 96 puits et chargés du colorant indicateur de calcium (Fura-2 acéoxyméthyle (AM)) pour permettre des mesures des niveaux intracellulaires de calcium dans une configuration de lecteur de plaque. Alternativement, les péricytes sont ensemencés sur des coverslips et montés dans des chambres cellulaires. Après chargement avec l’indicateur de calcium (Cal-520 AM), la formation image vivante de calcium peut être exécutée utilisant la microscopie confocale à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et la longueur d’onde d’émission de 510-520 nm.

La méthode décrite ici a été utilisée pour obtenir les premières mesures intracellulaires de calcium à partir de péricytes capillaires cérébraux primaires, démontrant que les péricytes sont stimulés par ATP et sont capables de se contracter in vitro.

Introduction

Les péricytes capillaires cérébraux, ainsi que les cellules endothéliales et les astrocytes, constituent le NVU1,2,3. Les cellules endothéliales, qui forment la base structurelle des capillaires, forment de longs tubes cylindriques d’un diamètre de 5 à 8 μm. Les cellules endothéliales sont sporadiquement couvertes de péricytes et entourées de saillies d’astrocytes; l’endfeet d’astrocyte.

La barrière céphalo-encéphalique (BBB), située aux capillaires cérébraux, est le principal site d’échange de nutriments, de gaz et de déchets entre le cerveau et le sang. Le BBB protège également le cerveau contre les neurotoxines endogènes et exogènes et sert de barrière pour la livraison d’un grand nombre de composés médicamenteux. La fonction barrière est un domaine d’intérêt, ainsi qu’un obstacle, pour les compagnies pharmaceutiques qui développent des médicaments du système nerveux central (SNC). Cela a suscité un grand intérêt dans l’étude des cellules de l’OND dans la culture4. Les astrocytes cérébraux et les cellules endothéliales ont été cultivés et caractérisés dans un certain nombre d’études, tandis que les études et les protocoles pour la culture péricyte sont clairsemés.

Les protocoles précédemment édités ont décrit la génération des cultures capillaires de péricyte capillaire de cerveau dans une certaine mesure, utilisant une gamme de différentes approches telles que l’immunopannage5,les médias à haut et à faible glucose6,le tri cellulairefluorescent-activé 7,centrifugation de gradient dedensité 8,etc. Bien que ces méthodes semblent suffisantes pour obtenir des cultures de péricytes, certaines prennent beaucoup de temps, coûtent cher et les péricytes obtenus pourraient ne pas être idéales en raison du nombre de passages de culture qui peuvent différencier les péricytes9. En outre, le potentiel des péricytes cultivés dans les études de signalisation in vitro a été assez inexploré jusqu’à présent.

Les travaux actuels portent sur la génération de cultures péricyte à partir de capillaires cérébraux bovins isolés et sur la configuration subséquente pour les mesures et les études d’imagerie des changements dans le calcium intracellulaire, un deuxième messager intracellulaire important. Nous décrivons brièvement l’isolement des capillaires de la matière grise corticale (pour plus de détails voir Helms et coll.10)et l’isolement et la culture des péricytes en monoculture pure sans contamination par des cellules endothéliales ou gliales. Nous fournissons ensuite un protocole pour l’ensemencement des péricytes dans des plaques de 96 puits et des protocoles de chargement pour la sonde de calcium Fura-2 AM. Enfin, nous montrons comment les péricytes peuvent être utilisés en imagerie confocale en temps réel dans les chambres de culture au microscope et décrivons les protocoles pour cela.

Protocol

1. Préparation de tampons et de solutions pour la culture cellulaire Préparer la solution de stock de collagène en dissolvant 5 mg de collagène IV du placenta humain dans 50 mL de PBS pendant la nuit à 4 °C. Aliquot la solution de stock en portions de 5 mL et stocker à -20 °C. Préparer la solution de stock de fibronectine en dissolvant 5 mg de fibronectine dans 5 mL d’eau stérile pendant la nuit. Conserver les stocks de fibronectine en aliquots de 500 μL à -20 °C. Lors du dégel, ajou…

Representative Results

Les capillaires du cerveau bovin ont été isolés du tissu cérébral frais et la figure 1 présente l’ensemencement capillaire et l’excroissance cellulaire pendant des jours et la purification subséquente des péricytes. Les capillaires sont entièrement fixés au flacon au jour 1 et le jour 2, la germination endothéliale est devenue visible (figure 1, jour 2). Après 4 jours, l’excroissance cellulaire est très distinc…

Discussion

Dans cette étude, nous avons présenté une méthode pour isoler les péricytes primaires des cerveaux bovins. Le protocole décrit permet la culture de ce type de cellule autrement plutôt inaccessible. La culture cellulaire obtenue par la suite était une population presque homogène de péricytes, avec peu ou pas de contamination avec des cellules endothéliales et des cellules gliales basées sur la morphologie cellulaire et l’expression protéique12. En outre, nous avons démontré une mé…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent souligner le financement de l’initiative de recherche de la Fondation Lundbeck sur les barrières cérébrales et la livraison de médicaments (RIBBDD) et de la Fondation de la famille Simon Hougners.

Materials

ATP Tocris 3245
Cal-520 AM AAT Bioquest 21130
Cell incubator Thermo Fisher
Centrifuge Thermo Fisher Heraeus Multifuge 3SR+ Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss Zeiss LSM 510 Inverted microscope
Counting chamber FastRead 102
Coverslip cell chamber Airekacells SC15022
Cremophor EL Sigma Aldrich C5135 Formerly known as Kolliphor EL
DMSO Sigma Aldrich 471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium Sigma Aldrich D0819
Fetal bovine serum (FBS) PAA/GE Healthcare A15-101
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Fura-2 AM Thermo Fisher F1201
Glass coverslips 22×22 mm VWR International 631-0123
HBSS Gibco 14065-049
Heparin Sigma Aldrich H3149
HEPES AppliChem Panreac A1069
Light microscope Olympus Olympus CK2 Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids Sigma Aldrich M7145
Microplate Reader BMG LabTech NOVOstar
PBS Sigma Aldrich D8537 Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate Sigma Aldrich P0781
Pluronic F127 Sigma Aldrich P2443
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4299
T-75 flask Sigma Aldrich CLS3972
96-well plate Corning incorporated 3603

References

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Cite This Article
Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).

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