Hjernekapillære pericytes er essensielle aktører i reguleringen av blod-hjerne barriere egenskaper og blodstrøm. Denne protokollen beskriver hvordan hjernekapillære pericytes kan isoleres, kultiveres, karakteriseres med hensyn til celletype og brukes til undersøkelser av intracellulær kalsiumsignalering med fluorescerende sonder.
Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytisk endfeet i en struktur kjent som den nevrovaskulære enheten (NVU). Hjernekapillær perikyttfunksjon er ikke fullt kjent. Pericytes har blitt foreslått å være involvert i kapillær utvikling, regulering av endotelbarriere tetthet og trancytose aktivitet, regulering av kapillær tone og å spille avgjørende roller i visse hjernepatologier.
Pericytes er utfordrende å undersøke i den intakte hjernen på grunn av vanskelighetene med å visualisere prosesser i hjernen parenchyma, samt nærhet til de andre cellene i NVU. Den nåværende protokollen beskriver en metode for isolasjon og kultur av primære storfe hjernekapillær pericytes og deres følgende bruk i kalsiumavbildningsstudier, hvor effekter av agonister involvert i hjernesignalering og patologier kan undersøkes. Kortikale kapillære fragmenter får lov til å feste seg til bunnen av kulturflasker, og etter 6 dager har endotelceller og pericytes vokst ut fra kapillære fragmenter. Endotelcellene fjernes ved mild trypsinisering og pericytter dyrkes i 5 ekstra dager før passaging.
Isolerte pericytter er seeded i 96-brønns kulturplater og lastet med kalsiumindikatorfargestoff (Fura-2 acetoksymetyl (AM)) for å tillate målinger av intracellulære kalsiumnivåer i et plateleseroppsett. Alternativt er pericytes seeded på dekkglass og montert i cellekamre. Etter lasting med kalsiumindikatoren (Cal-520 AM), kan kalsium live-imaging utføres ved hjelp av konfokal mikroskopi ved en eksitasjon bølgelengde på 488 nm og utslipp bølgelengde på 510-520 nm.
Metoden som er beskrevet her har blitt brukt til å oppnå de første intracellulære kalsiummålingene fra primære hjernekapillære perikytter, som viser at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til å trekke in vitro sammen.
Hjernekapillære pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, utgjør NVU1,2,3. Endotelcellene, som danner det strukturelle grunnlaget for kapillærene, danner lange sylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellene er sporadisk dekket med pericytter og omgitt av fremspring fra astrocytter; astrocyttendehennetten.
Blod-hjernebarrieren (BBB), som ligger ved hjernens kapillærer, er hovedstedet for utveksling av næringsstoffer, gasser og avfallsprodukter mellom hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mot endogene og eksogene nevrotoksiner og fungerer som en barriere for levering av et stort antall legemiddelforbindelser. Barrierefunksjonen er et fokusområde, samt et hinder, for legemiddelselskaper som utvikler sentralnervesystemet (CNS) medisiner. Dette har ansporet en stor interesse i å undersøke cellene i NVU i kultur4. Hjerneastrocytter og endotelceller har blitt dyrket og karakterisert i en rekke studier, mens studier og protokoller for perikyttkultur er sparsomme.
Tidligere publiserte protokoller har beskrevet generering av hjernekapillærpericyte kulturer til en viss grad, ved hjelp av en rekke forskjellige tilnærminger som immunopanning5,høy- og lav-glukose media6, fluorescerende-aktivert celle sortering7, tetthet gradient sentrifugering8, etc. Selv om disse metodene synes tilstrekkelig til å oppnå kulturer av pericytes, noen er tidkrevende, koster dyrt og pericytes oppnådd kan ikke være ideelt på grunn av antall kulturpassasjer som kan de-differensiere pericytes9. Videre har potensialet for kultiverte pericytter i in vitro signalstudier vært ganske uutforsket til nå.
Det nåværende arbeidet fokuserer på generering av pericytekulturer fra isolerte storfe hjernekapillærer og det påfølgende oppsettet for målinger og bildestudier av endringer i intracellulær kalsium, en viktig intracellulær andre budbringer. Vi beskriver kort isolasjonen av kapillærer fra kortikal grå materie (for detaljer se Helms et al.10) og isolasjon og kultur av pericytes i ren monokultur uten forurensning med endotel- eller glialceller. Vi gir deretter en protokoll for såing av pericytes i 96-brønnsplater og lasteprotokoller for kalsiumsonden Fura-2 AM. Til slutt viser vi hvordan pericytes kan brukes i sanntid confocal imaging i mikroskop kulturkamre og beskrive protokollene for dette.
I denne studien har vi presentert en metode for å isolere primære pericytter fra storfehjerner. Den beskrevne protokollen tillater kultur av denne ellers ganske utilgjengelig celletype. Den senere oppnådde cellekulturen var en nesten homogen populasjon av pericytter, med liten eller ingen forurensning med endotelceller og glialceller basert på cellemorfologi og proteinuttrykk12. Videre demonstrerte vi en enkel og grei metode for å laste pericytene med kalsiumfargestoffer for Ca2 +-…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne finansiering fra Lundbeck Foundation Research-initiativet on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) og Simon Hougners Family Foundation.
ATP | Tocris | 3245 | |
Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
Cell incubator | Thermo Fisher | ||
Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
Counting chamber | FastRead | 102 | |
Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
HBSS | Gibco | 14065-049 | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
96-well plate | Corning incorporated | 3603 |