Summary

Kultur af Brain Kapillære Pericytes for cytosolic calcium målinger og calcium Imaging Undersøgelser

Published: May 27, 2020
doi:

Summary

Hjernen kapillær pericytter er væsentlige aktører i reguleringen af blod – hjerne barrieren egenskaber og blodgennemstrømning. Denne protokol beskriver, hvordan hjernen kapillær pericytter kan isoleres, kulturperler, karakteriseret med hensyn til celletype og anvendes til undersøgelser af intracellulære calcium signalering med fluorescerende sonder.

Abstract

Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytiske endfeet i en struktur kendt som neurovaskulær enhed (NVU). Hjernen kapillær pericyte funktion er ikke fuldt kendt. Pericytter er blevet foreslået at være involveret i kapillær udvikling, regulering af endotel barriere tæthed og trancytose aktivitet, regulering af kapillær tone og til at spille afgørende roller i visse hjernen patologier.

Pericytes er udfordrende at undersøge i den intakte hjerne på grund af vanskelighederne med at visualisere processer i hjernen parenkym, samt tæt på de andre celler i NVU. Denne protokol beskriver en metode til isolering og kultur af primære kvæg hjerne kapillær pericytter og deres følgende brug i calcium billeddannelse undersøgelser, hvor virkningerne af agonister involveret i hjernen signalering og patologier kan undersøges. Kortikale kapillærfragmenter får lov til at binde sig til bunden af kulturkolber, og efter 6 dage er endotelceller og pericytter vokset ud af kapillærfragmenterne. Endotelcellerne fjernes ved blid trypsinisering, og pericytter dyrkes i yderligere 5 dage, før de passerer.

Isolerede pericytter er seedet i 96-brønd kultur plader og fyldt med calcium indikator farvestof (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) for at give mulighed for målinger af intracellulære calcium niveauer i en pladelæser setup. Alternativt er pericytter sået på coverslips og monteret i cellekamre. Efter belastning med calciumindikatoren (Cal-520 AM) kan calcium levende billeddannelse udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi ved en excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 510-520 nm.

Den metode, der er beskrevet her, er blevet anvendt til at opnå de første intracellulære calciummålinger fra primære hjernekapillære pericytter, hvilket viser, at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til at indgå kontrakter in vitro.

Introduction

Hjerne kapillær pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, udgør NVU1,2,3. Endotelcellerne, som udgør det strukturelle grundlag for kapillærerne, danner lange cylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellerne er sporadisk dækket med pericytter og omgivet af fremspring fra astrocytter; den astrocyte endfeet.

Blod- og hjernebarrieren (BBB), der ligger ved hjernekapillærerne, er det vigtigste sted for udveksling af næringsstoffer, gasser og affaldsprodukter mellem hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mod endogene og udefrakommende neurotoksiner og fungerer som en barriere for levering af et stort antal narkotikaforbindelser. Barrierefunktionen er et fokusområde, samt en hindring for medicinalfirmaer, der udvikler lægemidler fra centralnervesystemet (CNS). Dette har ansporet en stor interesse i at undersøge cellerne i NVU i kultur4. Hjernen astrocytter og endotelceller er blevet dyrket og karakteriseret i en række undersøgelser, mens undersøgelser og protokoller for pericyte kultur er sparsomme.

Tidligere offentliggjorte protokoller har beskrevet generation af hjernen kapillær pericyte kulturer til en vis grad, ved hjælp af en række forskellige tilgange såsom immunopanning5,høj- og lavglose medier6, fluorescerende-aktiveret celle sortering7, tæthed gradient centrifugering8, osv. Selv om disse metoder synes tilstrækkelige til at opnå kulturer af pericytes, nogle er tidskrævende, omkostninger dyre og pericytes opnået måske ikke være ideel på grund af antallet af kultur passager, der kan de-differentiere pericytes9. Desuden har potentialet i dyrkede pericytes in vitro signalering undersøgelser været temmelig uudforsket indtil nu.

Det nuværende arbejde fokuserer på generation af pericytkulturer fra isolerede kvæghjernens kapillærer og den efterfølgende opsætning til målinger og billeddannelsesundersøgelser af ændringer i intracellulært calcium, en vigtig intracellulær anden budbringer. Vi beskriver kort isoleringen af kapillærer fra kortikale grå materie (se Helms et al.10) og pericytes isolation og kultur i ren monokultur uden forurening med endotel- eller gliaceller. Vi giver derefter en protokol for såning af pericytter i 96-brønd plader og lastning protokoller for calcium sonden Fura-2 AM. Endelig viser vi, hvordan pericytter kan bruges i realtid konfokal billeddannelse i mikroskop kultur kamre og beskrive protokollerne for dette.

Protocol

1. Udarbejdelse af buffere og opløsninger til celledyrkning Forbered kollagen stock opløsning ved at opløse 5 mg kollagen IV fra human placenta i 50 ml PBS natten over ved 4 °C. Forstænker lageropløsningen i 5 ml portioner og opbevares ved -20 °C. Forbered fibronectin stock opløsning ved at opløse 5 mg fibronectin i 5 ml sterilt vand natten over. Fibronectinlagrene opbevares i aliquots på 500 μL ved -20 °C. Ved optøning tilsættes PBS til et slutvolumen på 50 ml for at klargøre arbejd…

Representative Results

Kvæghjernens kapillærer blev isoleret fra frisk hjernevæv, og figur 1 præsenterer kapillær såning og cellulær udvækst over dage og efterfølgende rensning af pericytter. Kapillærerne er fuldt fastgjort til kolben på dag 1, og på dag 2 er endotelspirering blevet synlig(figur 1,dag 2). Efter 4 dage, den cellulære udvækst er meget karakteristisk(Figur 1, dag 4a) og endotelceller fjernes ved…

Discussion

I denne undersøgelse har vi præsenteret en metode til at isolere primære pericytter fra kvæghjerner. Den beskrevne protokol tillader kultur af denne ellers temmelig utilgængelige celletype. Den efterfølgende opnåede cellekultur var en næsten homogen population af pericytter med ringe eller ingen kontaminering med endotelceller og gliaceller baseret på cellemorfologi og proteinudtryk12. Desuden viste vi en enkel og enkel metode til at indlæse pericytter med calciumfarvestoffer til Ca

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker at anerkende finansiering fra Lundbeckfondens forskningsinitiativ om hjernebarrierer og lægemiddellevering (RIBBDD) og Simon Hougners Family Foundation.

Materials

ATP Tocris 3245
Cal-520 AM AAT Bioquest 21130
Cell incubator Thermo Fisher
Centrifuge Thermo Fisher Heraeus Multifuge 3SR+ Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss Zeiss LSM 510 Inverted microscope
Counting chamber FastRead 102
Coverslip cell chamber Airekacells SC15022
Cremophor EL Sigma Aldrich C5135 Formerly known as Kolliphor EL
DMSO Sigma Aldrich 471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium Sigma Aldrich D0819
Fetal bovine serum (FBS) PAA/GE Healthcare A15-101
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Fura-2 AM Thermo Fisher F1201
Glass coverslips 22×22 mm VWR International 631-0123
HBSS Gibco 14065-049
Heparin Sigma Aldrich H3149
HEPES AppliChem Panreac A1069
Light microscope Olympus Olympus CK2 Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids Sigma Aldrich M7145
Microplate Reader BMG LabTech NOVOstar
PBS Sigma Aldrich D8537 Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate Sigma Aldrich P0781
Pluronic F127 Sigma Aldrich P2443
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4299
T-75 flask Sigma Aldrich CLS3972
96-well plate Corning incorporated 3603

References

  1. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  4. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  5. Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
  6. Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
  7. Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
  8. Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
  9. Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
  10. Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
  11. Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
  12. Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
  13. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  14. Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
  15. Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
  16. Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
  17. Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
  18. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  19. Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
  20. Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).

Play Video

Cite This Article
Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).

View Video