Kultur af Brain Kapillære Pericytes for cytosolic calcium målinger og calcium Imaging Undersøgelser

Summary

Hjernen kapillær pericytter er væsentlige aktører i reguleringen af blod – hjerne barrieren egenskaber og blodgennemstrømning. Denne protokol beskriver, hvordan hjernen kapillær pericytter kan isoleres, kulturperler, karakteriseret med hensyn til celletype og anvendes til undersøgelser af intracellulære calcium signalering med fluorescerende sonder.

Abstract

Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytiske endfeet i en struktur kendt som neurovaskulær enhed (NVU). Hjernen kapillær pericyte funktion er ikke fuldt kendt. Pericytter er blevet foreslået at være involveret i kapillær udvikling, regulering af endotel barriere tæthed og trancytose aktivitet, regulering af kapillær tone og til at spille afgørende roller i visse hjernen patologier.

Pericytes er udfordrende at undersøge i den intakte hjerne på grund af vanskelighederne med at visualisere processer i hjernen parenkym, samt tæt på de andre celler i NVU. Denne protokol beskriver en metode til isolering og kultur af primære kvæg hjerne kapillær pericytter og deres følgende brug i calcium billeddannelse undersøgelser, hvor virkningerne af agonister involveret i hjernen signalering og patologier kan undersøges. Kortikale kapillærfragmenter får lov til at binde sig til bunden af kulturkolber, og efter 6 dage er endotelceller og pericytter vokset ud af kapillærfragmenterne. Endotelcellerne fjernes ved blid trypsinisering, og pericytter dyrkes i yderligere 5 dage, før de passerer.

Isolerede pericytter er seedet i 96-brønd kultur plader og fyldt med calcium indikator farvestof (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) for at give mulighed for målinger af intracellulære calcium niveauer i en pladelæser setup. Alternativt er pericytter sået på coverslips og monteret i cellekamre. Efter belastning med calciumindikatoren (Cal-520 AM) kan calcium levende billeddannelse udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi ved en excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 510-520 nm.

Den metode, der er beskrevet her, er blevet anvendt til at opnå de første intracellulære calciummålinger fra primære hjernekapillære pericytter, hvilket viser, at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til at indgå kontrakter in vitro.

Introduction

Hjerne kapillær pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, udgør NVU^1,2,3. Endotelcellerne, som udgør det strukturelle grundlag for kapillærerne, danner lange cylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellerne er sporadisk dækket med pericytter og omgivet af fremspring fra astrocytter; den astrocyte endfeet.

Blod- og hjernebarrieren (BBB), der ligger ved hjernekapillærerne, er det vigtigste sted for udveksling af næringsstoffer, gasser og affaldsprodukter mellem hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mod endogene og udefrakommende neurotoksiner og fungerer som en barriere for levering af et stort antal narkotikaforbindelser. Barrierefunktionen er et fokusområde, samt en hindring for medicinalfirmaer, der udvikler lægemidler fra centralnervesystemet (CNS). Dette har ansporet en stor interesse i at undersøge cellerne i NVU i kultur⁴. Hjernen astrocytter og endotelceller er blevet dyrket og karakteriseret i en række undersøgelser, mens undersøgelser og protokoller for pericyte kultur er sparsomme.

Tidligere offentliggjorte protokoller har beskrevet generation af hjernen kapillær pericyte kulturer til en vis grad, ved hjælp af en række forskellige tilgange såsom immunopanning^5,høj- og lavglose medier⁶, fluorescerende-aktiveret celle sortering⁷, tæthed gradient centrifugering⁸, osv. Selv om disse metoder synes tilstrækkelige til at opnå kulturer af pericytes, nogle er tidskrævende, omkostninger dyre og pericytes opnået måske ikke være ideel på grund af antallet af kultur passager, der kan de-differentiere pericytes⁹. Desuden har potentialet i dyrkede pericytes in vitro signalering undersøgelser været temmelig uudforsket indtil nu.

Det nuværende arbejde fokuserer på generation af pericytkulturer fra isolerede kvæghjernens kapillærer og den efterfølgende opsætning til målinger og billeddannelsesundersøgelser af ændringer i intracellulært calcium, en vigtig intracellulær anden budbringer. Vi beskriver kort isoleringen af kapillærer fra kortikale grå materie (se Helms et al.¹⁰) og pericytes isolation og kultur i ren monokultur uden forurening med endotel- eller gliaceller. Vi giver derefter en protokol for såning af pericytter i 96-brønd plader og lastning protokoller for calcium sonden Fura-2 AM. Endelig viser vi, hvordan pericytter kan bruges i realtid konfokal billeddannelse i mikroskop kultur kamre og beskrive protokollerne for dette.

Protocol

1. Udarbejdelse af buffere og opløsninger til celledyrkning Forbered kollagen stock opløsning ved at opløse 5 mg kollagen IV fra human placenta i 50 ml PBS natten over ved 4 °C. Forstænker lageropløsningen i 5 ml portioner og opbevares ved -20 °C. Forbered fibronectin stock opløsning ved at opløse 5 mg fibronectin i 5 ml sterilt vand natten over. Fibronectinlagrene opbevares i aliquots på 500 μL ved -20 °C. Ved optøning tilsættes PBS til et slutvolumen på 50 ml for at klargøre arbejd…

Representative Results

Kvæghjernens kapillærer blev isoleret fra frisk hjernevæv, og figur 1 præsenterer kapillær såning og cellulær udvækst over dage og efterfølgende rensning af pericytter. Kapillærerne er fuldt fastgjort til kolben på dag 1, og på dag 2 er endotelspirering blevet synlig(figur 1,dag 2). Efter 4 dage, den cellulære udvækst er meget karakteristisk(Figur 1, dag 4a) og endotelceller fjernes ved…

Discussion

I denne undersøgelse har vi præsenteret en metode til at isolere primære pericytter fra kvæghjerner. Den beskrevne protokol tillader kultur af denne ellers temmelig utilgængelige celletype. Den efterfølgende opnåede cellekultur var en næsten homogen population af pericytter med ringe eller ingen kontaminering med endotelceller og gliaceller baseret på cellemorfologi og proteinudtryk¹². Desuden viste vi en enkel og enkel metode til at indlæse pericytter med calciumfarvestoffer til Ca^…

Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603