Kultur av hjärnan kapillär pericyter för cytosoliska kalcium mätningar och kalcium Imaging Studier

Summary

Hjärnan kapillär pericytes är viktiga aktörer i regleringen av blod – hjärnbarriären egenskaper och blodflödet. Detta protokoll beskriver hur hjärnan kapillär pericytes kan isoleras, odlade, karakteriseras med avseende på celltyp och tillämpas för undersökningar av intracellulära kalcium signalering med fluorescerande sonder.

Abstract

Pericyter är associerade med endotelceller och astrocytiskt endfeet i en struktur som kallas neurovaskulära enheten (NVU). Hjärnan kapillär pericyte funktion är inte helt känd. Pericytes har föreslagits vara inblandade i kapillär utveckling, reglering av endotel barriär täthet och trancytosis verksamhet, reglering av kapillär tonen och att spela avgörande roller i vissa hjärnan patologier.

Pericyter är utmanande att undersöka i intakt hjärnan på grund av svårigheterna att visualisera processer i hjärnan parenkym, liksom närheten till de andra cellerna i NVU. Föreliggande protokoll beskriver en metod för isolering och kultur av primära bovint hjärnan kapillär pericytes och deras följande användning i kalcium imaging studier, där effekterna av agonister som deltar i hjärnan signalering och patologier kan undersökas. Kortikal kapillärfragment tillåts fästa på botten av odlingskolvar och efter 6 dagar har endotelceller och pericyter växt ut från kapillärfragmenten. Endotelcellerna avlägsnas genom mild trypsinization och pericyter odlas i 5 ytterligare dagar före passaging.

Isolerade pericyter är seedade i 96-brunnskulturplattor och laddade med kalciumindikatorfärgen (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) för att möjliggöra mätningar av intracellulära kalciumnivåer i en plattläsaruppställning. Alternativt sås pericyter på täcken och monteras i cellkammare. Efter lastning med kalciumindikatorn (Cal-520 AM), kalcium live-imaging kan utföras med hjälp av confocal mikroskopi vid en magnetisering våglängd av 488 nm och utsläpp våglängd av 510-520 nm.

Den metod som beskrivs här har använts för att erhålla de första intracellulära kalciummätningarna från primära hjärnan kapillär pericytes, visar att pericytes stimuleras via ATP och har möjlighet att kontrakt in vitro.

Introduction

Hjärnan kapillär pericyter, tillsammans med endotelceller och astrocyter, utgör NVU^1,2,3. De endotelceller, som utgör den strukturella grunden för kapillärerna, bildar långa cylindriska rör med en diameter på 5-8 μm. De endotelceller är sporadiskt täckt med pericyter och omgiven av utsprång från astrocyter; astrocyten endfeet.

Blod- hjärnbarriären (BBB), som ligger vid hjärnkaxillärerna, är den huvudsakliga platsen för utbyte av näringsämnen, gaser och avfallsprodukter mellan hjärnan och blodet. BBB skyddar också hjärnan från endogena och exogena neurotoxiner och fungerar som en barriär för leverans av ett stort antal läkemedelsföreningar. Barriärfunktionen är ett fokusområde, samt ett hinder, för läkemedelsföretagen som utvecklar läkemedel från centrala nervsystemet (CNS). Detta har sporrat ett stort intresse för att undersöka cellerna i NVU i kultur⁴. Hjärnans astrocyter och endotelceller har odlats och karakteriserats i ett antal studier, medan studierna och protokollen för pericytkulturen är glesa.

Tidigare publicerade protokoll har beskrivit generering av hjärnan kapillär pericyte kulturer till viss del, med hjälp av en rad olika metoder såsom immunopanning⁵, hög- och lågglukosmedia⁶, fluorescerande-aktiverad cellsortering⁷, densitet gradient centrifugering⁸, etc. Även om dessa metoder verkar tillräckligt för att erhålla kulturer av pericyter, vissa är tidskrävande, kostar dyrt och pericyter som erhållits kanske inte är idealisk på grund av antalet kultur passager som kan de-differentiera pericytes⁹. Dessutom har potentialen hos odlade pericyter i in vitro-signalstudier hittills varit ganska outforskad.

Det föreliggande arbetet fokuserar på generering av pericytekulturer från isolerade kapillärer från nötkreatur och den efterföljande uppställningen för mätningar och bildframställningsstudier av förändringar i intracellulärt kalcium, en viktig intracellulär andra budbärare. Vi beskriver kort isolering av kapillärer från när grå substans (för detaljer se Helms et al.¹⁰) och isolering och kultur av pericytes i ren monokultur utan kontaminering med endotel eller gliaceller. Vi tillhandahåller sedan ett protokoll för sådd av pericyter i 96-brunns plattor och lastning protokoll för kalcium sonden Fura-2 AM. Slutligen visar vi hur pericyter kan användas i realtid konfokal avbildning i mikroskop kulturkammare och beskriva protokollen för detta.

Protocol

1. Beredning av buffertar och lösningar för cellkulturing Bered lösning av kollagenlager genom att lösa upp 5 mg kollagen IV från moderkakan för människor i 50 mL PBS över natten vid 4 °C. Alikvotens stamlösning i 5 mL-portioner och förvara vid -20 °C. Förbered fibronectin stamlösning genom att lösa upp 5 mg fibronectin i 5 mL sterilt vatten över natten. Förvara bestånden av fibronectin i alikvoter på 500 μL vid -20 °C. Vid upptining, tillsätt PBS till en slutlig volym på 50 m…

Representative Results

Nötkreatur hjärnan kapillärerna var isolerade från färska hjärnan vävnad och figur 1 presenterar kapillär sådd och cellulära utväxt under dagar och efterföljande rening av pericytes. Kapillärerna är helt fästa vid kolven vid dag 1 och dag 2 har endotelsspirandet spirande blivit synligt (figur 1, dag 2). Efter 4 dagar är cellulär utväxten mycket distinkt (Figur 1, dag 4a) och endotel…

Discussion

I denna studie har vi lagt fram en metod för att isolera primära pericyter från bovin hjärnor. Det beskrivna protokollet tillåter kultur av denna annars ganska otillgängliga celltyp. Den därefter erhållna cellkulturen var en nästan homogen population av pericyter, med liten eller ingen kontaminering med endotelceller och gliaceller baserade på cellmorfologi och proteinuttryck¹². Vidare visade vi en enkel och okomplicerad metod för att ladda pericyterna med kalciumfärgämnen för Ca<sup…

Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603