脑毛细管中培养细胞细胞钙测量和钙成像研究

Summary

脑毛细管性信号是调节血脑屏障特性和血流的基本参与者。该协议描述了如何分离、培养脑毛细管腹膜，在细胞类型方面进行特征分析，并应用于用荧光探针研究细胞内钙信号。

Abstract

在称为神经血管单元（NVU）的结构中，佩里西特与内皮细胞和星形末脚相关。脑毛细管性周丽素功能不完全知道。已建议参与毛细管发育、内皮屏障紧绷和转膜活动调节、毛细管音的调节，并在某些大脑病理中发挥关键作用。

由于在脑筋障碍中难以可视化过程，以及接近 NVU 的其他细胞，因此在完整大脑中对研究是具有挑战性的。本协议描述了一种主要牛脑毛细管性胸毛的分离和培养方法及其在钙成像研究中的以下用法，其中可以研究参与大脑信号和病理学的激动剂的影响。皮质毛细管碎片可以附着在培养瓶的底部，6天后，内皮细胞和心状物从毛细管碎片中生长出来。内皮细胞通过温和的三分血化去除，在通过前再培养5天。

分离的腹膜在96孔培养板中播种，并装有钙指示器染料（Fura-2醋氧甲基（AM），用于测量板读卡器设置中的细胞内钙水平。或者，在盖玻片上播种，并安装在细胞室中。在用钙指示器（Cal-520 AM）加载后，可以使用共物显微镜在488纳米和发射波长为510-520 nm时进行钙活成像。

此处描述的方法已用于从原发性脑毛细管腹膜获得第一个细胞内钙测量，表明环状细胞通过 ATP 受到刺激，并且能够在体外收缩。

Introduction

脑毛细管内皮，连同内皮细胞和星形细胞，构成^{NVU1，2，3。}内皮细胞构成毛细血管的结构基础，形成直径为5-8μm的长圆柱管。内皮细胞零星被围皮覆盖，周围是星形细胞的突起;星细胞末脚。

血脑屏障（BBB）位于脑毛细血管，是大脑和血液之间交换营养物质、气体和废物的主要地点。BBB还保护大脑免受内源和外源性神经毒素的污染，并充当大量药物化合物的传递屏障。屏障功能是制药公司开发中枢神经系统（CNS）药物的重点领域，也是障碍。这激起了对调查NVU在培养中细胞的很大^兴趣。脑星形细胞和内皮细胞在一些研究中被培养和描述，而对周来细胞培养的研究和协议是稀疏的。

此前公布的协议在一定程度上描述了脑毛细管的生成，使用一系列不同的方法，如免疫平移^5、高和低血糖介质^6、荧光激活细胞分^选7、密度梯度离^心8等。虽然这些方法似乎足以获得过长的区域性，但有些是耗时的，成本昂贵，获得可能不理想，因为文化通道的数量，可以去区分的^周分。此外，培养的周利未得到体外信号研究的潜力，直到现在还相当未被探索。

本工作的重点是从孤立的牛脑毛细血管中生成腹膜培养物，以及随后对细胞内钙（一个重要的细胞内第二信使）变化的测量和成像研究进行的后续设置。我们简要地描述了毛细血管与皮质灰质的分离（详情见Helms等人^{10），以及}纯单培养中胸腺的分离和培养，而不受到内皮或胶质细胞的污染。然后，我们提供一个协议，用于在96孔板中播种性，并为钙探针Fura-2 AM提供加载协议。最后，我们介绍了在显微镜培养室中如何将过色物用于实时共合成像，并描述了其方案。

Protocol

1. 为细胞培养准备缓冲液和溶液 在4°C下，在50 mL的PBS中溶解5毫克胶原蛋白IV，准备胶原蛋白库存溶液。 将库存溶液分成5 mL部分，储存在-20°C。 在5mL的无菌水中溶解5毫克纤维素，准备纤维素库存溶液。将纤维素储存在 -20 °C 下以 500 μL 的等分。 解冻时，将 PBS 添加到 50 mL 的最终体积中，以准备工作解决方案并将其储存在 4°C。 准备Dulbecco的改性鹰介质（DMEM）完整的介质，?…

Representative Results

牛脑毛细管从新鲜脑组织分离 出来，图1 呈现了毛细管播种和细胞生长在几天内，随后的胸腺细胞纯化。毛细管在第1天完全附着在烧瓶上，第2天内皮发芽变得可见（图1，第2天）。4天后，细胞外生长高度独特（图1，第4a天），内皮细胞根据所述协议通过温和的三辛化被去除。毛细管的残余物在试鸣后可?…

Discussion

在这项研究中，我们提出了一种将原发性胸椎动物与牛脑分离的方法。所述协议允许培养这种本来相当不可接近的单元类型。随后获得的细胞培养物是近同质的性年期，以细胞形态和蛋白质表达¹²为基础，内皮细胞和胶质细胞几乎没有污染。此外，我们演示了一种简单明了的方法，使用两种不同的方法，根据预期结果，用钙染料为 Ca²⁺成像加载过白剂。

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Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603