Summary

Культура перицитов мозга для цитозолических измерений кальция и исследований по визуализации кальция

Published: May 27, 2020
doi:

Summary

Мозг капиллярных перицитов являются важными игроками в регуляции гемово-мозгового барьера свойства и кровотока. Этот протокол описывает, как перициты мозга могут быть изолированы, культурны, характеризуются по отношению к типу клеток и применяются для исследований внутриклеточного кальция сигнализации с флуоресцентными зондами.

Abstract

Перициты связаны с эндотелиальными клетками и астроцитическим эндфитом в структуре, известной как нервно-сосудистый блок (NVU). Функция перицита мозга капилляра не до конца известна. Перициты были предложены для участия в развитии капилляров, регулирование эндотелиальной герметичности барьера и трансцитоза деятельности, регулирование капиллярного тона и играть решающую роль в некоторых патологий мозга.

Перициты являются сложными для исследования в нетронутой мозга из-за трудностей в визуализации процессов в мозге parenchyma, а также близость к другим клеткам NVU. Настоящий протокол описывает метод изоляции и культуры первичных капиллярных перицитов мозга крупного рогатого скота и их следующее использование в исследованиях визуализации кальция, где могут быть исследованы эффекты агонистов, участвующих в сигнализации мозга и патологиях. Корковые капиллярные фрагменты могут прикрепляться к нижней части культуры колбы и, после 6 дней, эндотелиальные клетки и перициты выросли из капиллярных фрагментов. Эндотелиальные клетки удаляются нежной трипсинизацией и перициты культурируются в течение 5 дополнительных дней до прохода.

Изолированные перициты посеяны в 96-колодец культуры пластин и загружены с красителем индикатор кальция (Fura-2 ацетоксиметил (AM)), чтобы для измерения внутриклеточного уровня кальция в установке считыватель пластин. Кроме того, перициты сеяются на крышках и устанавливаются в клеточных камерах. После загрузки с индикатором кальция (Cal-520 AM), кальций живой визуализации может быть выполнена с помощью конфокаляновой микроскопии на возбуждение длины волны 488 нм и выбросов длины волны 510-520 нм.

Метод, описанный здесь, был использован для получения первых внутриклеточных измерений кальция от первичных перицитов капилляров мозга, демонстрируя, что перициты стимулируются через АТФ и способны заключить контракт в пробирке.

Introduction

Мозг капиллярных перицитов, вместе с эндотелиальными клетками и астроцитами, составляют NVU1,2,3. Эндотелиальные клетки, которые составляют структурную основу капилляров, образуют длинные цилиндрические трубки диаметром 5-8 мкм. Эндотелиальные клетки время от времени покрываются перицитами и окружены выступами астроцитов; эндфит астроцитов.

Гемово-мозговой барьер (BBB), расположенный в капиллярах мозга, является основным местом для обмена питательными веществами, газами и отходами между мозгом и кровью. BBB также защищает мозг от эндогенных и экзогенных нейротоксинов и служит барьером для доставки большого количества лекарственных соединений. Барьерная функция является областью фокусировки, а также препятствием для фармацевтических компаний, разрабатывая лекарства центральной нервной системы (ЦНС). Это вызвало большой интерес к расследованию клеток NVU в культуре4. Астроциты мозга и эндотелиальные клетки были культурны и охарактеризованы в ряде исследований, в то время как исследования и протоколы перицитной культуры являются редкими.

Ранее опубликованные протоколы описали генерации мозга капиллярных перицитных культур в некоторой степени, используя целый ряд различных подходов, таких какиммунопаннинг 5, высокой и низкой глюкозы СМИ 6 , флуоресцентно-активированнойклетки сортировки 7, плотность градиент центрифугации8и т.д. Хотя эти методы кажутся достаточными для получения культур перицитов, некоторые из них относят много времени, стоят дорого и перициты, полученные не может быть идеальным из-за числа культуры проходы, которые могутде-дифференцироватьpericytes 9 . Кроме того, потенциал культурных перицитов в исследованиях в области сигнализации in vitro до сих пор довольно не изучен.

Нынешняя работа посвящена генерации перицитовых культур из изолированных капилляров мозга крупного рогатого скота и последующей установке для измерений и исследований изображений изменений внутриклеточного кальция, важного внутриклеточного второго посланника. Мы кратко описываем изоляцию капилляров от коркового серого вещества (для деталей см. Helms et al.10)и изоляцию и культуру перицитов в чистой монокультуре без загрязнения эндотелиальными или глиальными клетками. Затем мы предоставляем протокол для посева перицитов в 96-хорошо пластин и протоколы загрузки для кальция зонд Fura-2 AM. Наконец, мы показываем, как перициты могут быть использованы в конфокальных изображений в режиме реального времени в камерах микроскопной культуры и описываем протоколы для этого.

Protocol

1. Подготовка буферов и решений для культивирования клеток Приготовьте раствор коллагенового бульона, растворив 5 мг коллагена IV из человеческой плаценты в 50 мл PBS на ночь при 4 градусах Цельсия. Aliquot фондовый раствор в 5 мл порций и хранить при -20 градусов по Цельсию. Приготовьт…

Representative Results

Капилляры мозга крупного рогатого скота были выделены из свежей ткани мозга и рисунок 1 представляет капиллярного посева и клеточного роста в течение нескольких дней и последующей очистки перицитов. Капилляры полностью прикреплены к колбе на 1 день и ?…

Discussion

В этом исследовании мы представили метод изоляции первичных перицитов от крупного рогатого скота. Описанный протокол позволяет культуре этого иначе довольно недоступный тип ячейки. Впоследствии полученная культура клеток была почти однородной популяцией перицитов, практически без ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы отметить финансирование из Лундбек Фонд исследовательской инициативы по мозга барьеров и доставки наркотиков (RIBBDD) и Саймон Hougners семьи фонда.

Materials

ATP Tocris 3245
Cal-520 AM AAT Bioquest 21130
Cell incubator Thermo Fisher
Centrifuge Thermo Fisher Heraeus Multifuge 3SR+ Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss Zeiss LSM 510 Inverted microscope
Counting chamber FastRead 102
Coverslip cell chamber Airekacells SC15022
Cremophor EL Sigma Aldrich C5135 Formerly known as Kolliphor EL
DMSO Sigma Aldrich 471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium Sigma Aldrich D0819
Fetal bovine serum (FBS) PAA/GE Healthcare A15-101
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Fura-2 AM Thermo Fisher F1201
Glass coverslips 22×22 mm VWR International 631-0123
HBSS Gibco 14065-049
Heparin Sigma Aldrich H3149
HEPES AppliChem Panreac A1069
Light microscope Olympus Olympus CK2 Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids Sigma Aldrich M7145
Microplate Reader BMG LabTech NOVOstar
PBS Sigma Aldrich D8537 Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate Sigma Aldrich P0781
Pluronic F127 Sigma Aldrich P2443
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4299
T-75 flask Sigma Aldrich CLS3972
96-well plate Corning incorporated 3603

References

  1. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  4. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  5. Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
  6. Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
  7. Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
  8. Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
  9. Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
  10. Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
  11. Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
  12. Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
  13. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  14. Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
  15. Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
  16. Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
  17. Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
  18. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  19. Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
  20. Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).

Play Video

Cite This Article
Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).

View Video