Hjärnan kapillär pericytes är viktiga aktörer i regleringen av blod – hjärnbarriären egenskaper och blodflödet. Detta protokoll beskriver hur hjärnan kapillär pericytes kan isoleras, odlade, karakteriseras med avseende på celltyp och tillämpas för undersökningar av intracellulära kalcium signalering med fluorescerande sonder.
Pericyter är associerade med endotelceller och astrocytiskt endfeet i en struktur som kallas neurovaskulära enheten (NVU). Hjärnan kapillär pericyte funktion är inte helt känd. Pericytes har föreslagits vara inblandade i kapillär utveckling, reglering av endotel barriär täthet och trancytosis verksamhet, reglering av kapillär tonen och att spela avgörande roller i vissa hjärnan patologier.
Pericyter är utmanande att undersöka i intakt hjärnan på grund av svårigheterna att visualisera processer i hjärnan parenkym, liksom närheten till de andra cellerna i NVU. Föreliggande protokoll beskriver en metod för isolering och kultur av primära bovint hjärnan kapillär pericytes och deras följande användning i kalcium imaging studier, där effekterna av agonister som deltar i hjärnan signalering och patologier kan undersökas. Kortikal kapillärfragment tillåts fästa på botten av odlingskolvar och efter 6 dagar har endotelceller och pericyter växt ut från kapillärfragmenten. Endotelcellerna avlägsnas genom mild trypsinization och pericyter odlas i 5 ytterligare dagar före passaging.
Isolerade pericyter är seedade i 96-brunnskulturplattor och laddade med kalciumindikatorfärgen (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) för att möjliggöra mätningar av intracellulära kalciumnivåer i en plattläsaruppställning. Alternativt sås pericyter på täcken och monteras i cellkammare. Efter lastning med kalciumindikatorn (Cal-520 AM), kalcium live-imaging kan utföras med hjälp av confocal mikroskopi vid en magnetisering våglängd av 488 nm och utsläpp våglängd av 510-520 nm.
Den metod som beskrivs här har använts för att erhålla de första intracellulära kalciummätningarna från primära hjärnan kapillär pericytes, visar att pericytes stimuleras via ATP och har möjlighet att kontrakt in vitro.
Hjärnan kapillär pericyter, tillsammans med endotelceller och astrocyter, utgör NVU1,2,3. De endotelceller, som utgör den strukturella grunden för kapillärerna, bildar långa cylindriska rör med en diameter på 5-8 μm. De endotelceller är sporadiskt täckt med pericyter och omgiven av utsprång från astrocyter; astrocyten endfeet.
Blod- hjärnbarriären (BBB), som ligger vid hjärnkaxillärerna, är den huvudsakliga platsen för utbyte av näringsämnen, gaser och avfallsprodukter mellan hjärnan och blodet. BBB skyddar också hjärnan från endogena och exogena neurotoxiner och fungerar som en barriär för leverans av ett stort antal läkemedelsföreningar. Barriärfunktionen är ett fokusområde, samt ett hinder, för läkemedelsföretagen som utvecklar läkemedel från centrala nervsystemet (CNS). Detta har sporrat ett stort intresse för att undersöka cellerna i NVU i kultur4. Hjärnans astrocyter och endotelceller har odlats och karakteriserats i ett antal studier, medan studierna och protokollen för pericytkulturen är glesa.
Tidigare publicerade protokoll har beskrivit generering av hjärnan kapillär pericyte kulturer till viss del, med hjälp av en rad olika metoder såsom immunopanning5, hög- och lågglukosmedia6, fluorescerande-aktiverad cellsortering7, densitet gradient centrifugering8, etc. Även om dessa metoder verkar tillräckligt för att erhålla kulturer av pericyter, vissa är tidskrävande, kostar dyrt och pericyter som erhållits kanske inte är idealisk på grund av antalet kultur passager som kan de-differentiera pericytes9. Dessutom har potentialen hos odlade pericyter i in vitro-signalstudier hittills varit ganska outforskad.
Det föreliggande arbetet fokuserar på generering av pericytekulturer från isolerade kapillärer från nötkreatur och den efterföljande uppställningen för mätningar och bildframställningsstudier av förändringar i intracellulärt kalcium, en viktig intracellulär andra budbärare. Vi beskriver kort isolering av kapillärer från när grå substans (för detaljer se Helms et al.10) och isolering och kultur av pericytes i ren monokultur utan kontaminering med endotel eller gliaceller. Vi tillhandahåller sedan ett protokoll för sådd av pericyter i 96-brunns plattor och lastning protokoll för kalcium sonden Fura-2 AM. Slutligen visar vi hur pericyter kan användas i realtid konfokal avbildning i mikroskop kulturkammare och beskriva protokollen för detta.
I denna studie har vi lagt fram en metod för att isolera primära pericyter från bovin hjärnor. Det beskrivna protokollet tillåter kultur av denna annars ganska otillgängliga celltyp. Den därefter erhållna cellkulturen var en nästan homogen population av pericyter, med liten eller ingen kontaminering med endotelceller och gliaceller baserade på cellmorfologi och proteinuttryck12. Vidare visade vi en enkel och okomplicerad metod för att ladda pericyterna med kalciumfärgämnen för Ca<sup…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill uppmärksamma finansiering från Lundbecks stiftelse Research initiative on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) och Simon Hougners Family Foundation.
ATP | Tocris | 3245 | |
Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
Cell incubator | Thermo Fisher | ||
Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
Counting chamber | FastRead | 102 | |
Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
HBSS | Gibco | 14065-049 | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
96-well plate | Corning incorporated | 3603 |