Oikopleura dioica é um organismo modelo tunicate em vários campos da biologia. Descrevemos métodos de amostragem, identificação de espécies, configuração de cultivo e protocolos de cultivo para os animais e alimentação de algas. Destacamos fatores-chave que ajudaram a fortalecer o sistema cultural e discutir os possíveis problemas e resoluções.
Oikopleura dioica é um chordate plantônico com excepcional capacidade de alimentação de filtros, tempo de geração rápida, desenvolvimento precoce conservado e um genoma compacto. Por essas razões, é considerado um organismo modelo útil para estudos ecológicos marinhos, biologia evolutiva do desenvolvimento e genômica. Como a pesquisa muitas vezes requer um fornecimento constante de recursos animais, é útil estabelecer um sistema de cultura confiável e de baixa manutenção. Aqui descrevemos um método passo-a-passo para estabelecer uma cultura O. dioica. Descrevemos como selecionar potenciais locais de amostragem, métodos de coleta, identificação de animais de destino e a configuração do sistema de cultivo. Fornecemos conselhos de solução de problemas com base em nossas próprias experiências. Também destacamos fatores críticos que ajudam a sustentar um sistema de cultura robusto. Embora o protocolo cultural aqui fornecido seja otimizado para O. dioica,esperamos que nossa técnica de amostragem e configuração cultural inspirem novas ideias para a manutenção de outros invertebrados frágeis pelagicos.
Organismos modelo têm sido fundamentais para abordar muitas questões biológicas, incluindo aquelas relacionadas ao desenvolvimento, genética e fisiologia. Além disso, organismos de modelos adicionais facilitam novas descobertas e, portanto, são cruciais para alcançar uma maior compreensão da natureza1,2. Zooplâncton marinho são diversos grupos de organismos que desempenham um papel importante nos ecossistemas oceânicos3,,4,,5,6. Apesar de sua abundância e importância ecológica, organismos gelatinosos como tunicatos planctônicos são frequentemente sub-representados em estudos de biodiversidade de plâncton, pois sua transparência e fragilidade tornam a coleta e identificação de campodesafiadoras 7,,8. Técnicas de amostragem adaptadas e cultivo laboratorial permitem uma observação mais aprofundada dos animais in vitro, o que tem aprofundado o conhecimento na biologia dos tunicatos planctônicos9,,10,,11,12.
Larvaceans (Appendicularians) são uma classe de tunicatos marinhos de natação livre que compreende cerca de 70 espécies descritas em todo o mundo8,13. Como eles são um dos grupos mais abundantes dentro das comunidades zooplânctons14,,15,,16,17, larvaceans representam uma fonte primária de alimento para organismos plantônicos maiores, como larvas de peixe18,,19. Ao contrário dos ascidianos- os tunicates-larvaceanos sessile mantêm uma morfologia semelhante a um girino e permanecem plantônicos ao longo de suas vidas20. Cada animal vive dentro de uma estrutura auto-construída e intrincada de alimentação de filtros conhecida como casa. Eles acumulam partículas em suas casas criando correntes de água através do movimento ondulante de suas caudas21. Casas entupidas são descartadas ao longo do dia, algumas das quais formam agregados de carbono e eventualmente afundam no fundo do mar22; assim, as larvas desempenham um papel importante no fluxo global de carbono23. A maioria das espécies é relatada para viver na zona pelagica dentro dos 100 m superiores da coluna de água13; no entanto, o gigante larvacean Bathochordaeus é conhecido por habitar as profundezas de 300 m24. Um estudo sobre Bathochordaeus na Baía de Monterey, Califórnia, revelou que os animais também servem como vetor biológico de microplásticos, sugerindo uma potencial importância na compreensão do papel dos appendiculares no transporte vertical e distribuição de microplásticos nos oceanos25.
Oikopleura dioica, uma espécie de larvacean, tem atraído atenção nos últimos anos como um organismo modelo devido a várias características notáveis. É comumente relatado em todos os oceanos do mundo. É especialmente abundante em águas costeiras26,o que permite uma amostragem fácil da costa. A cultura estável e de longo prazo é possível com água do mar natural e artificial27,,28,,29. Os tempos de geração dependentes da temperatura são tão curtos quanto 4-9 dias em condições laboratoriais. Tem alta fecundidade com cada fêmea capaz de produzir >300 ovos ao longo do ano. Como tunicate, ocupa uma importante posição filogenética para a compreensão da evolução do chordate30,31. Com 70 Mb, O. dioica tem o menor genoma identificado entre todos os acordes32. Entre larvas, O. dioica é a única espécie não hermafroditica descrita até agora33.
A primeira cultura o. dioica bem sucedida com microalgae cultivada em laboratório foi relatada por Paffenhöfer34. O protocolo de cultura original utilizando motores e pás síncronos foi desenvolvido pela Fenaux e Gorsky35 e posteriormente adotado por vários laboratórios. Mais recentemente, Fujii et al.36 relataram o. dioica culminando em água do mar artificial, um sistema de cultura robusto e coleta de campo foram descritos por Bouquet et al.27 e um protocolo otimizado para um sistema simplificado e acessível foi relatado por Marti-Solans et al.29. Além do sistema tradicional de cultura Oikopleura, um design recém-relatado com um tanque de criação de tubo duplo também tem o potencial de cultivar Oikopleura sp. 37.
Apresentamos um protocolo detalhado para o início de uma monocultura O. dioica baseada em uma combinação de protocolos desenvolvidos por grandes grupos de pesquisa de Oikopleura no Centro Internacional de Biologia Molecular Marinha27, a Universidade de Barcelona29, Universidade de Osaka28, e nossas próprias observações. Em protocolos culturais publicados anteriormente, informações detalhadas sobre a composição de meios de comunicação algas, técnicas de amostragem em terra e identificação de Oikopleura foram apenas descritas aproximadamente, deixando muita ambiguidade. Aqui, com o auxílio de informações visuais no protocolo de vídeo, reunimos todas as informações críticas necessárias para configurar uma cultura O. dioica do zero de forma simples e passo a passo. Descrevemos como distinguir O. dioica de outra espécie comumente relatada, O. longicauda,que é um dos passos mais desafiadores. Embora os sistemas culturais existentes sejam aplicáveis para o cultivo de O. dioica em todo o mundo, destacamos a importância do ajuste de protocolos com base nas condições ambientais locais. As informações apresentadas combinam dados amplamente publicados, bem como conhecimento adquirido através da experiência. O protocolo atual é ideal para pesquisadores interessados em estabelecer uma cultura do zero.
Para facilitar a flexibilidade no estabelecimento da cultura O. dioica, é importante entender o habitat natural dos animais. Os dados sazonais fornecem informações sobre as faixas de parâmetros físicos, que podem ser usados para orientar as condições de cultivo de laboratório. Também ajuda a entender as flutuações sazonais na abundância de animais. Em Okinawa, O. dioica é mais confiável de junho a outubro. No entanto, na baía de Tóquio, as populações atingem o pico em fevereiro e41de outubro . Embora a cultura de O. dioica seja frequentemente relatada a 20 °C ou inferior27,28,29, Okinawan O. dioica mostra melhor sobrevivência em temperaturas acima de 20 °C; isso pode ser explicado pelo fato de que a temperatura mínima da água do mar em Okinawa é de ~20 °C(Figura 6). A abundância de O. dioica também pode ser influenciada pelas flores fitoplâncton42 e pela abundância de predadores43,44. Independentemente de onde O. dioica seja coletado, compreender a sazonalidade das populações locais maximiza a chance de amostragem e cultivo do sucesso.
Dada a estação e localização apropriadas, a amostragem líquida é uma maneira eficaz de coletar um grande número de Oikopleura com o mínimo esforço. Redes de plâncton com tamanho de malha menor (60-70 μm) também podem ser usadas para coletar todas as etapas dos animais. Animais totalmente maduros raramente são encontrados na rede, talvez devido à sua fragilidade no final do ciclo de vida. Portanto, a identificação das espécies seguidas pela amostragem é obtida pela observação microscópica das células subcorrdais. Indivíduos maduros geralmente aparecem um ou dois dias após a amostragem à medida que os animais continuam a crescer em laboratório. Embora a amostragem líquida seja eficiente, métodos alternativos de amostragem podem ser necessários em diferentes circunstâncias. Por exemplo, a amostragem líquida perto de áreas urbanas pode coletar um grande número de fitoplâncton, dificultando o isolamento de Oikopleura. Nesses casos, recomenda-se uma amostragem simples de baldes para coletar amostras de águas do mar ou barcos de áreas além do porto. Os resultados mostraram que a mudança gradual na salinidade devido aos dias consecutivos de chuva não afetou a abundância de O. dioica; no entanto, a amostragem da costa imediatamente após eventos climáticos extremos, como ciclones tropicais, deve ser evitada. Esses eventos causam mudanças biogeoquímicas repentinas e drásticas em um corpo de água abrigado45,46. O escoamento das águas pluviais pode transportar poluentes, sedimentos e nutrientes em excesso, que aumentam a turbidez e reduzem a qualidade da água47. O plâncton de alimentação por filtros, como o Oikopleura,pode ser especialmente suscetível a essas mudanças devido ao seu modo de alimentação e mobilidade limitada. Em tal circunstância, recomendamos adiar a amostragem por alguns dias até que as condições locais voltem ao normal.
A introdução de um sistema de filtro de várias etapas é essencial para manter pequenos organismos de alimentação de filtros, como o O. dioica. Usando água do mar mal filtrada (por exemplo, uma malha de 25 μm no sistema cultural anterior), a cultura era muitas vezes instável especialmente durante o verão, potencialmente devido à maior abundância de fitoplâncton. Embora alguns fitoplâncton sejam benéficos para o crescimento de O. dioica, outros produzem biotoxinas que podem causar desenvolvimento anormal de embriões O. dioica 48. Além disso, uma alta concentração de diatomás como chaetoceros spp. são potencialmente prejudiciais ao crescimento de O. dioica, pois podem possuir setae longo que pode entupir a casa e evitar alimentação eficiente49. Observamos frequentemente casas de pequenos animais sendo entupidos por C. calcitrans setae; portanto, agora alimentamos C. calcitrans apenas para animais no dia 2 ou mais(Tabela 3).
Embora não tenha sido um problema aqui, a cultura de O. dioica em larga escala pode sofrer quedas bruscas no tamanho da população devido a um gargalo genético; nesses casos, Martí-Solans et al.29 recomendam adicionar novos indivíduos selvagens à cultura a cada 20 gerações.
O sistema cultural Oikopleura é flexível. Uma cultura estável pode ser estabelecida dentro de uma semana. A cultura de longo prazo de O. dioica é possível em um orçamento modesto com equipamentos não especializados. O esforço diário necessário para a manutenção de 5-10 béquers de Oikopleura é geralmente menos de 2 horas com 2 pessoas. O. dioica também pode ser mantido em água do mar artificial, o que é benéfico para aqueles sem acesso à água do mar natural28. O armazenamento a longo prazo de alimentos algas é possível usando cultura sólida e criopreservação29. Além disso, o esperma de O. dioica pode ser criopreservado, e permanecer viável por mais de um ano50. Todos esses fatores significam que as culturas podem ser facilmente restabelecedas. Finalmente, experiência passada com cultivo acidental de Pleurobrachia sp. pode sugerir que o sistema de cultivo desenvolvido para Oikopleura poderia potencialmente ser estendido a uma comunidade mais ampla de frágeis organismos pelagicos.
O. dioica continua a fornecer informações poderosas sobre vários campos biológicos. Uma compreensão da sazonalidade local, um sistema de cultura meticuloso e alguns indivíduos dedicados permitem que a cultura eficaz seja estabelecida com pouco esforço. O sistema cultural Oikopleura fornece os recursos básicos para investigar uma ampla gama de campos biológicos relacionados à ecologia, desenvolvimento, genômica e evolução deste único chordate marinho.
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos a Garth Ilsley por seu apoio no estabelecimento do sistema cultural. Reconhecemos as contribuições de Ritsuko Suyama e Sylvain Guillot para os esforços de amostragem precoce e identificação de espécies. Agradecimentos especiais são devidos a Hiroki Nishida, Takeshi Onuma e Tatsuya Omotezako por seu generoso apoio e orientação durante todo o processo, incluindo o estabelecimento inicial do sistema local de cultivo e o compartilhamento de animais e cultura microalgal. Agradecemos também a Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro e Alfonso Ferrández-Roldán por compartilharem seus conhecimentos em amostragem e cultivo. Jai Denton, Charles Plessy e Jeffrey Jolly forneceram um feedback inestimável sobre o manuscrito. Charlotte West formulou uma equação generalizada para o cálculo de algas. Finalmente, agradecemos à OIST pelo financiamento, Mary Collins e o Comitê de Segurança de Trabalho de Campo da OIST por conselhos sobre procedimentos de amostragem segura, a equipe da loja de máquinas OIST para a construção de equipamentos de cultivo e amostragem, e Koichi Toda por fornecer água do mar.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
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Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |