Oikopleura dioica er en sækdyr model organisme i forskellige områder af biologi. Vi beskriver prøvetagningsmetoder, artsidentifikation, dyrkningsopsætning og dyrkningsprotokoller for dyrene og algefoder. Vi fremhæver nøglefaktorer, der har bidraget til at styrke kultursystemet og drøfte de mulige problemer og beslutninger.
Oikopleura dioica er et planktonakkorat med exceptionel filter-fodring evne, hurtig generation tid, bevaret tidlig udvikling, og en kompakt genom. Af disse grunde betragtes det som en nyttig model organisme for marine økologiske undersøgelser, evolutionære udviklingsmæssige biologi, og genomik. Da forskning ofte kræver en stabil forsyning af dyreressourcer, er det nyttigt at etablere et pålideligt kultursystem med lav vedligeholdelse. Her beskriver vi en trinvis metode til etablering af en O. dioica kultur. Vi beskriver, hvordan du vælger potentielle prøvetagningssteder, indsamlingsmetoder, identifikation af dyr og opsætningen af dyrkningssystemet. Vi yder fejlfindingsrådgivning baseret på vores egne erfaringer. Vi fremhæver også kritiske faktorer, der hjælper med at opretholde et robust kultursystem. Selv om kulturprotokollen her er optimeret til O. dioica,håber vi, at vores prøveteknik og kulturopsætning vil inspirere til nye ideer til at vedligeholde andre skrøbelige pelagiske hvirvelløse dyr.
Model organismer har været medvirkende til at løse mange biologiske spørgsmål, herunder dem, der vedrører udvikling, genetik, og fysiologi. Desuden fremmer yderligere modelorganismer nye opdagelser og er derfor afgørende for at opnå en større forståelse af naturen1,2. Marine zooplankton er forskellige grupper af organismer , der spiller en vigtig rolle i havets økosystemer3,4,5,6. På trods af deres overflod og økologiske betydning er gelatinøse organismer såsom planktonsækdyr ofte underrepræsenteret i planktonbiodiversitetsundersøgelser, fordi deres gennemsigtighed og skrøbelighed gør indsamling og identifikation udfordrende7,8. Tilpassede prøveudtagningsteknikker og laboratoriekultation muliggør en nærmere observation af dyrene in vitro, hvilket har fremmet kendskabet til planktonsækdyrs biologi9,10,11og12.
Larvaceans (Appendicularians) er en klasse af frisvømning marine sækdyr bestående af omkring 70 beskrevne arter på verdensplan8,13. Da de er en af de mest udbredte grupper i zooplanktonsamfund14,15,16,17, larvaceans udgør en primær fødekilde for større planktonismer såsom fiskelarver18,19. I modsætning til ascidians-the sessile sækikater-larvaceans bevare en haletudse-lignende morfologi og forblive planktonisk hele deres liv20. Hvert dyr bor inde i en selvbygget, indviklede filter-fodring struktur kendt som et hus. De ophobes partikler i deres huse ved at skabe vandstrømme gennem bølgende bevægelse af deres haler21. Tilstoppede huse kasseres hele dagen, hvoraf nogle danner kulstofaggregater og i sidste ende synker til havbunden22; larvaceans spiller således en stor rolle i den globale kulstofflux23. De fleste arter er rapporteret at leve i pelagisk zone inden for de øverste 100 m afvandsøjlen 13; men den gigantiske larvacean Bathochordaeus er kendt for at bebo dybder på 300 m24. En undersøgelse af Bathochordaeus i Monterey Bay, Californien viste, at dyrene også tjener som en biologisk vektor af mikroplast, hvilket tyder på en potentiel betydning for at forstå den rolle, appendicularians i den vertikale transport og distribution af mikroplast i havene25.
Oikopleura dioica, en art af larvacean, har tiltrukket sig opmærksomhed i de seneste år som en model organisme på grund af flere bemærkelsesværdige egenskaber. Det er almindeligt rapporteret i hele verdenshavene. Det er især rigelige i kystnære farvande26,som giver nem prøveudtagning fra kysten. Langsigtet, stabil dyrkning er mulig med både naturligt og kunstigt havvand27,28,29. Temperaturafhængige generationstider er så korte som 4-9 dage i laboratorieforhold. Det har høj frugtbarhed med hver hun i stand til at producere >300 æg hele året. Som en sækikat, det indtager en vigtig fylogenetisk position for at forstå chordate evolution30,31. På 70 Mb, O. dioica har den mindste identificerede genom blandt alle chordates32. Blandt larvaceans, O. dioica er den eneste beskrevne ikke-hermafroditiske arter hidtil33.
Den første succesfulde O. dioica-kultur med laboratoriedyrkede mikroalger blev rapporteret af Paffenhöfer34. Den oprindelige kultur protokol ved hjælp af synkrone motorer og padler blev udviklet af Fenaux og Gorsky35 og senere vedtaget af flere laboratorier. For nylig, Fujii et al.36 rapporterede O. dioica dyrkning i kunstigt havvand, en robust kultur system og felt indsamling blev beskrevet af Bouquet et al.27 og en optimeret protokol for en forenklet, overkommelig system blev rapporteret af Marti-Solans et al.29. Bortset fra den traditionelle Oikopleura kultursystem, en nyligt rapporteret design med en dobbelt rør opdræt tank har også potentiale til kultur Oikopleura sp. kr.
Vi præsenterer en detaljeret protokol for at indlede en O. dioica monokultur baseret på en kombination af protokoller udviklet af store Oikopleura forskningsgrupper på Sars International Centre for Marine Molecular Biology27, Universitetet i Barcelona29, Osaka University28, og vores egne observationer. I tidligere offentliggjorte kultur protokoller, detaljerede oplysninger om sammensætningen af alge medier, shore prøvetagning teknikker, og Oikopleura identifikation blev kun groft beskrevet, hvilket efterlader en masse tvetydighed. Her, ved hjælp af visuel information i video-protokollen, har vi samlet alle de kritiske oplysninger, der er nødvendige for at oprette en O. dioica kultur fra bunden i en enkel, trin-for-trin måde. Vi beskriver, hvordan man skelner O. dioica fra en anden almindeligt rapporteret arter, O. longicauda, som er en af de mest udfordrende trin. Selv om de eksisterende kultursystemer kan anvendes til dyrkning af O. dioica på verdensplan, fremhæver vi betydningen af protokoljustering baseret på lokale miljøforhold. De præsenterede oplysninger kombinerer bredt offentliggjorte data samt viden opnået gennem erfaring. Den nuværende protokol er velegnet til forskere, der er interesseret i at etablere en kultur fra bunden.
For at fremme fleksibiliteten i etableringen af O. dioica kultur, er det vigtigt at forstå dyrenes naturlige habitat. Sæsondata giver oplysninger om de forskellige fysiske parametre, som kan bruges til at styre laboratoriedyrkningsforhold. Det hjælper også med at forstå sæsonmæssige udsving i overflod af dyr. I Okinawa, O. dioica er mest pålideligt fundet fra juni til oktober. Men i Tokyo bay, befolkninger peak i februar og oktober41. Selv om dyrkning af O. dioica ofte rapporteres ved 20 °C eller lavere27,28,29, viser Okinawan O. dioica bedre overlevelse ved temperaturer over 20 °C; dette kan forklares ved, at mindstetemperaturen for havvand i okinawa er ~20 °C (figur 6). Overfloden af O. dioica kan også være påvirket af fytoplanktonblomstring42 og rovdyr overflod43,44. Uanset hvor O. dioica er indsamlet, forstår sæsonudsving af lokalbefolkningen maksimerer chancen for prøveudtagning og dyrkning succes.
I betragtning af den passende sæson og placering, netto prøveudtagning er en effektiv måde at indsamle et stort antal Oikopleura med minimal indsats. Planktonnet med mindre maskestørrelse (60-70 μm) kan også anvendes til opsamling af alle dyrenes faser. Fuldt modne dyr findes sjældent i nettet, måske på grund af deres skrøbelighed ved slutningen af livscyklussen. Derfor opnås artsidentifikation efterfulgt af prøveudtagning ved mikroskopisk observation af subvælgske celler. Modne individer vises normalt en eller to dage efter prøveudtagningen, efterhånden som dyrene fortsætter med at vokse i laboratoriet. Selv om nettoprøvetagning er effektiv, kan alternative prøveudtagningsmetoder være nødvendige under forskellige omstændigheder. For eksempel kan nettoprøvetagning nær byområder indsamle et stort antal fytoplankton, hvilket gør det vanskeligt at isolere Oikopleura. I sådanne tilfælde anbefales det at udtage en simpel skovlprøve til optagning af overfladehavvand eller bådudtagning fra områder uden for havnen. Resultaterne viste, at den gradvise ændring i saltholdigheden som følge af på hinanden følgende dage med regn ikke påvirkede overfloden af O. dioica; det bør dog undgås, at der udtages prøver på land umiddelbart efter ekstreme vejrforhold såsom tropiske cykloner. Disse begivenheder forårsager pludselige og drastiske biogeokemiske ændringer i et beskyttet vandområde45,46. Regnvandsafstrømningen kan medføre forurenende stoffer, sedimenter og overskydende næringsstoffer, hvilket øger uklarheden og lavere vandkvalitet47. Filter-fodring plankton, såsom Oikopleura, kan være særligt modtagelige for disse ændringer på grund af deres form for fodring og begrænset mobilitet. I sådanne tilfælde anbefaler vi at udsætte prøveudtagningen i et par dage, indtil de lokale forhold vender tilbage til normal.
Indførelsen af et flertrinsfiltersystem er afgørende for at opretholde små, filterfodringsorganismer som O. dioica. Ved hjælp af dårligt filtreret havvand (f.eks. et 25 μm mesh i det tidligere kultursystem) var kulturen ofte ustabil især om sommeren, potentielt på grund af den højere forekomst af fytoplankton. Selv om nogle fytoplankton er til gavn for O. dioica vækst, andre producerer biotoksiner, der kan forårsage unormal udvikling af O. dioica embryoner48. Hertil kommer, en høj koncentration af diatomer såsom Chaetoceros spp. er potentielt skadelige for O. dioica vækst, da de kan besidde lange setae, som kan tilstoppe huset og forhindre effektiv fodring49. Vi observerede ofte huse af små dyr, der tilstoppes af C. calcitrans setae; Derfor fodrer vi nu kun C. calcitrans til dyr på dag 2 og ældre(tabel 3).
Selv om det ikke var et problem her, kan små langsigtede dyrkning af O. dioica opleve pludselige fald i befolkningens størrelse på grund af en genetisk flaskehals; I sådanne tilfælde anbefaler Martí-Solans et al.29 at tilføje nye vilde individer til kulturen hver 20.
Oikopleura kultursystemet er fleksibelt. En stabil kultur kan etableres inden for en uge. Langsigtet dyrkning af O. dioica er mulig på et beskedent budget med ikke-specialudstyr. Den daglige indsats, der kræves for vedligeholdelse af 5-10 bægerglas af Oikopleura er generelt mindre end 2 timer med 2 personer. O. dioica kan også opretholdes i kunstigt havvand, hvilket er til gavn for dem uden adgang til naturligt havvand28. Langtidsopbevaring af algefødevarer er mulig ved hjælp af fast kultur og kryopræservering29. Desuden kan O. dioica sædceller kryopræpareres, og forblive levedygtige i mere end et år50. Alle disse faktorer betyder, at kulturer let kan genetableres. Endelig tidligere erfaringer med utilsigtet dyrkning af Pleurobrachia sp. kan tyde på, at det dyrkningssystem, der er udviklet til Oikopleura, potentielt kan udvides til at omfatte et bredere fællesskab af skrøbelige pelagiske organismer.
O. dioica fortsætter med at give stærk indsigt i forskellige biologiske områder. En forståelse af lokal sæsonudsving, en omhyggelig kultur system, og et par dedikerede personer tillader effektiv kultur, der skal etableres med lille indsats. Oikopleura kultursystem giver baseline ressourcer til at undersøge en bred vifte af biologiske områder vedrørende økologi, udvikling, genomik, og udviklingen af denne unikke marine chordate.
The authors have nothing to disclose.
Vi er Garth Ilsley taknemmelige for hans støtte til etableringen af kultursystemet. Vi anerkender Ritsuko Suyamas og Sylvain Guillots bidrag til tidlig prøveudtagning og vurdering af artsidentifikation. Særlig tak skyldes Hiroki Nishida, Takeshi Onuma og Tatsuya Omotezako for deres generøse støtte og vejledning hele vejen igennem, herunder indledende etablering af det lokale dyrkningssystem og deling af dyr og mikroalgekultur. Vi takker også Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro og Alfonso Ferrández-Roldán for at dele deres ekspertise inden for prøveudtagning og dyrkning. Jai Denton, Charles Plessy og Jeffrey Jolly gav uvurderlig feedback på manuskriptet. Charlotte West formulerede en generaliseret ligning for algeberegning. Endelig takker vi OIST for finansieringen, Mary Collins og OIST Fieldwork Safety Committee for rådgivning om sikre prøveudtagningsprocedurer, personalet i OIST maskinværksted for opførelse af dyrknings- og prøveudstyr og Koichi Toda til levering af havvand.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |