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Cancer Research

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Abstract

Avanços significativos foram feitos no tratamento do câncer com imunoterapia, embora um grande número de cânceres permaneça resistente ao tratamento. Um número limitado de ensaios permite o monitoramento direto e insights mecanicistas sobre as interações entre tumor e células imunes, entre as quais, as células T desempenham um papel significativo na execução da resposta citotóxica do sistema imunológico adaptativo às células cancerosas. A maioria dos ensaios são baseados na co-cultura bidimensional (2D) das células devido à relativa facilidade de uso, mas com representação limitada do fenótipo de crescimento invasivo, uma das marcas das células cancerosas. Os sistemas de cocultura tridimensionais atuais (3D) exigem equipamentos especiais ou monitoramento separado para invasão de células cancerígenas co-cultivadas e células T interativas.

Aqui descrevemos uma abordagem para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo em 3D de esferoides de células cancerosas e citotoxicidade de células T na co-cultura. A formação esferoide é impulsionada por interações células-células aprimoradas em moldes de microwell agarose livres de andaimes com fundos em forma de U. Tanto a co-cultura das células T quanto a invasão de células cancerígenas na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro das microwells dos moldes de agarose sem a necessidade de transferir as células, mantendo assim um sistema de cocultura 3D intacto durante todo o ensaio. A matriz de colágeno pode ser separada do molde de agarose, permitindo a coloração da imunofluorescência (IF) e para imagens confocal das células. Além disso, as células podem ser isoladas para maior crescimento ou submetidas a análises como para expressão genética ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS). Finalmente, a cocultura 3D pode ser analisada pela imunohistoquímica (IHC) após a incorporação e secção. As possíveis modificações do ensaio incluem composições alteradas da matriz extracelular (ECM), bem como a inclusão de diferentes células estromais ou imunes com as células cancerosas.

Introduction

Apesar de melhorias significativas na imunoterapia contra o câncer na última década, nossa compreensão mecanicista da sensibilidade e resistência aos tratamentos ainda é bastante pobre1. Está bem estabelecido que os tumores apresentam heterogeneidade substancial, e que as interações dinâmicas das células tumorais com seu microambiente, bem como com as células imunes, impactam a morte celular tumoral, comportamento invasivo e resposta a tratamentos que incluem imunoterapia1,,2,3. Como um braço do sistema imunológico adaptativo, as células T executam citotoxicidade específica das células. A análise do reconhecimento de células T e a resposta às células cancerosas fornecem insights mecanicistas sobre resistência e sensibilidade aos tratamentos modulatórios imunológicos.

A modelagem in vitro e o monitoramento das interações entre câncer e células T em um ambiente apropriado tem sido desafiador e, até agora, resultou em insights mecanicistas limitados. A maioria dos ensaios baseados em células dependem de um ambiente bidimensional (2D), que carece de características-chave que são fundamentais para recapitular a fisiologia tridimensional (3D) in vivo4,5,6, ou seja, interações células espaciais, contato com a matriz extracelular (ECM)7, demanda metabólica dinâmica, aumento da hipóxia devido ao crescimento de massa8, e efeitos do microambiente tumoral (TME)9. Por outro lado, ainda há uma série de deficiências com os sistemas de cocultura tridimensional (3D) atualmente utilizados (3D): (1) a natureza demorada da geração e colheita esferoides5,,10, (2) a falta de controle sobre o tamanho do esferoide, forma e densidade celular11,12, (3) ensaios do tipo de baixo rendimento, (4) a exigência de equipamento especial13,,14, (5) a necessidade de transferir a cocultura para ambientes distintos para diferentes ensaios15,,16,,17. Em particular, a transferência de um ensaio de co-cultura muitas vezes leva à interrupção dos esferoides e à perda da integridade da co-cultura. Isso se aplica especialmente a esferoides "soltos" com menor adesão celular. Por exemplo, a maioria dos ensaios de invasão 3D exigem que os esferoides sejam colhidos após sua formação inicial e, em seguida, resuspendidos em ECM14,15,16. Esta etapa de resuspensão resulta em uma perda de controle sobre a distância entre os esferoides. Uma vez que a distância entre os esferoides tumorais impacta seu comportamento invasivo, essa perda de controle introduz alta variância entre ensaios e reduz a reprodutibilidade. Além disso, a aplicação de ensaios de fracionamento celular por etapas de centrifugação consecutivas para avaliação das células imunes periféricas e tumorais infiltradas é limitada a populações de células tumorais que geram esferoides mais estáveis17.

Conceito e abordagem

Nossa abordagem aborda as deficiências acima mencionadas usando um modelo de cocultura spheroid 3D "All-in-One" — que não requer a transferência de esferoides para ensaios subsequentes. Adaptamos um dispositivo de formação de esferoides (ver Tabela de Materiais) para gerar um ensaio para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo das células cancerosas e a citotoxicidade das células T co-cultivadas. Este método é fácil de usar, barato e permite um manuseio rápido e fácil em uma configuração 3D relativamente de alto rendimento. Dependendo do tipo de dispositivo utilizado, até 81 esferoides de grande porte uniforme podem ser gerados em uma única etapa de pipetação com controle sobre o tamanho esferoide individual modificando o número de células semeadas. A formação esferoide é forçada por interações células-células aprimoradas em elencos multi-poços livres de andaimes com fundos em forma de U. Adaptamos este sistema 3D para estudos funcionais baseados em células dinâmicas, bem como ensaios moleculares e bioquímicos que incluem fluorescência ativada de classificação celular (FACS), imunofluorescência (IF) ou imunohistoquímica (IHC), bem como análise de expressão genética da cocultura 3D intacta.

Para estudos funcionais,a incorporação de esferoides no colágeno tipo I dentro das castas agarose resulta na invasão de células cancerígenas de equidistantes e permite monitorar características essenciais da linha celular, como migração celular única vs. células coletivas18,,19. Além disso, a matriz de colágeno é facilmente separada do molde de agarose, resultando em um patch de 1\u20122 mm de espessura contendo vários esferoides, que podem ser processados para coloração de IF e imagens por microscopia confocal. Isso pode revelar distintas interações de invasão celular e matriz celular em uma triagem de alto rendimento. Além disso, as células da matriz de colágeno podem ser isoladas após a digestão do colágeno e dissociação de células únicas para posterior cultivo ou análise celular.

Para a análise de IHC de esferoides,após fixação e secção do molde de agarose, proteínas ou outras moléculas de interesse são detectáveis mantendo as posições geográficas dos esferoides. Na abordagem descrita aqui, os esferoides estão diretamente incorporados no gel de processamento de hidroxietila agarose dentro do molde de agarose e o gel serve como uma "tampa" para reter os esferoides na parte inferior dos microwells. Após a incorporação da parafina do elenco20,a seção horizontal serial é realizada com a parte inferior do elenco servindo como ponto de partida.

Essa abordagem contrasta com a secção convencional de Spheroids que requer a colheita de células antes de incorporar em gel de processamento de hidroxietilaagarose 21 e corre o risco de interrupção de esferoides, perdendo assim o arranjo espacial das células. Além disso, o fracionamento celular por centrifugação para avaliar se as células imunes infiltraram ou permaneceram periféricas aos esferoides tumorais17 é evitada pela incorporação direta.

Além disso, a cocultura 3D pode ser realizada por tumores admixantes, células estrômicas ou imunes, e, assim, estudar o crosstalk de células tumorais ou recapitular diferentes microambientes tumorais para analisar interações células-células, incluindo co-culturas com células endoteliais16.

Esta configuração de cocultura esféide 3D pode ser usada para realizar a co-cultura de diferentes tipos de células presentes no microambiente tumoral e para avaliar os efeitos dos elementos ECM alterados. Além do colágeno tipo I, outros componentes do ECM (por exemplo, matrigel, misturas de matrigel/colágeno, fibronectina), podem ser usados uma vez que a invasão de células tumorais é impactada pela abundância de diferentes substratos22. Além disso, as microiádeas do elenco de agarose são adequadas para a formação esferoide de linhas celulares primárias e para células com baixa adesão celular.

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Protocol

Uma lista e explicação de algumas palavras usadas com frequência ao longo do protocolo podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 1.

1. Geração de esferoides

  1. Prepare e autoclave 2% agarose em 1x PBS (por exemplo, 1 g agarose em 50 mL de 1x PBS) e autoclave 35- e 81-microwell moldes de borracha.
    ATENÇÃO: Evite usar agarose de baixo derretimento para gerar os moldes de agarose para processamento de IHC.
  2. Preparem elencos de agarose
    NOTA: Os moldes de 35 microwells são usados para ensaios de invasão, imunofluorescência (IF) e isolamento celular. Moldes de 81 microwells são usados para citotoxicidade, imunohistoquímica (IHC), isolamento celular e ensaios de extração de RNA.
    1. Depois que a agarose foi autoclavada, deixe agarose derretida esfriar para cerca de 60\u201270 °C. Em uma capa de cultura celular, use técnica asséptica e pipeta 500 μL de agarose derretida em um molde de borracha de 81 microwell por poço ou 330 μL em um molde de borracha de 35 microwell por poço.
      ATENÇÃO: Evite criar bolhas durante a mistura ou pipetação. Remova as bolhas por pipetação suave.
    2. Depois que a agarose for solidificada, flexione cuidadosamente o molde de borracha para remover a ágarose lançada dele. Por este lado, coloque as mãos acima da placa de poço apropriada e deixe o elenco agarose cair em um poço do bem-prato.
      NOTA: Flexione o molde de borracha em diferentes posições, a fim de evitar a flexão excessiva. Pode ser útil flexionar o molde de borracha e empurrar suavemente de baixo ao mesmo tempo.
    3. Para equilibrar os moldes de agarose, adicione meio de cultura celular, consistindo de DMEM suplementado com soro bovino fetal de 10% (2,5 mL/bem para placa de 12 poços e 1 mL/bem para placa de 24 poços). Coloque o bem-prato em uma incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2) e incubar por 1h.
  3. Enquanto isso, prepare a cultura celular para semeadura.
    NOTA: O número total de semeadura de células por elenco de agarose deve ser decidido pelo investigador. Para linhas de células cancerígenas pancreáticas primárias murinas, 35.000 células/35-microwell fundidas e 81.000 células/81-microwell fundidos (em média 1000 células/esferoides) são semeadas para todos os ensaios seguintes. O diâmetro médio de um esferoide é de cerca de 150\u2012200 μm após 48 h.
  4. Remova o meio de cultura celular em torno do molde de agarose com uma pipeta P1000 primeiro, inclinando a placa de poço. Em seguida, remova cuidadosamente o meio na câmara de semeadura.
  5. Cuidadosamente semeada a suspensão de células tumorais preparadas em termos de queda na câmara de semeadura celular. Coloque cuidadosamente a placa de volta na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2) por 15 min.
    NOTA: Durante esta etapa, as células se estabelecerão nas micro-poços do elenco agarose.
  6. Adicione meio adicional ao exterior do elenco agarose (2,5 mL/bem para placa de 12 poços e 1 mL/bem para placa de 24 poços).
  7. Coloque o bem-prato de volta na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2) por 48 h.
    NOTA: Normalmente leva até algumas horas para as células formarem esferoides nos microwells. Em geral, os esferoides de células tumorais sólidas são formados após 24 h e estão estáveis após 48 h. No entanto, isso pode variar entre diferentes linhas celulares. Se necessário, altere o meio de cultura celular inclinando cuidadosamente a placa com os moldes de agarose e removendo o meio de cultura celular circundante com uma pipeta P1000. Em seguida, adicione cuidadosamente o meio fresco, pipetando-o ao longo da parede do poço. Normalmente não é necessário mudar a mídia dentro dos moldes devido ao seu pequeno volume e ao risco de remover os esferoides.

2. Co-cultura com células T

  1. Resuspend o número necessário de células T em 75 μL (35-microwell cast) ou em 190 μL (81-microwell cast) do meio de cultura t-cell apropriado (RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina).
  2. Remova o meio de cultura celular ao redor do molde de agarose com uma pipeta P1000 primeiro, inclinando a placa de poço. Em seguida, remova lentamente e cuidadosamente o meio dentro do elenco, mirando suavemente um canto da câmara de semeadura com uma pipeta P200, mantendo a placa bem inclinada com a outra mão.
  3. (Etapa crítica 1) Como há o risco de remover esferoides, controle para perda de esferoides comparando o número de esferoides dentro dos micróbios antes e depois de remover o meio visualizando sob o microscópio a 10x de ampliação.
  4. Cuidadosamente semeou a suspensão da célula T em termos de queda na câmara de semeadura do elenco de agarose, segurando a pipeta P200 cerca de 0,5 cm acima do gesso.
  5. (Passo crítico 2) Há o risco de eliminar os esferoides enquanto adiciona as células T. Portanto, é fundamental adicionar as células T muito lentamente e cerca de 0,5 cm acima da câmara de semeadura.
    NOTA: Uma possibilidade de diminuir o número de esferoides lavados é apontando a pipeta para um canto da câmara de semeadura enquanto adiciona as células T, arriscando assim apenas os esferoides neste canto a serem liberados.
  6. Coloque cuidadosamente a placa de volta na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2) por 15 min.
  7. Retire o bem-prato da incubadora e adicione meio de cultura celular fresca (RPMI suplementado com soro bovino fetal de 10% e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina) ao redor da agarose lançada por lentamente tubos ao longo da parede do poço.
  8. Coloque o bem-prato de volta na incubadora de cultura celular por 48 h.

3. Incorporação da cocultura 3D na matriz de colágeno tipo I

  1. Prepare o colágeno tipo I neutralizado
    1. Diluir o colágeno de estoque com meio de base livre de soro (RPMI) para uma concentração final de trabalho de 3 mg/mL. Para cada 100 μL de colágeno diluído, adicione 11 μL de PBS 10x e 1,2 μL 1 M de hidróxido de sódio (NaOH).
    2. Mantenha o gelo e incubar (neutralizar) por 1h.
  2. Remova o meio de cultura celular ao redor do molde de agarose com uma pipeta P1000 primeiro, inclinando a placa de poço. Em seguida, remova lentamente e cuidadosamente o meio dentro do molde, mirando suavemente um canto da câmara de semeadura com uma pipeta P200, mantendo a placa bem inclinada com a outra mão.
    NOTA: Aqui, é fundamental remover completamente o meio de cultura celular em torno do molde agarose.
  3. Pipeta cuidadosamente o colágeno neutralizado eu misturo gota-wise na câmara de semeadura da agarose lançada segurando a pipeta P200 cerca de 0,5 cm acima do elenco.
  4. Coloque o bem-prato imediatamente na incubadora de cultura celular por 4 min (35-microwell cast) ou 5 min (81-microwell cast).
    ATENÇÃO: (Passo crítico 3) É fundamental manter estritamente o tempo de incubação dado. Caso contrário, o comportamento invasivo pode não ser reprodutível.
  5. Inverta o prato de poço e deixe-o virado na incubadora por 1h.
    NOTA: Os moldes permanecerão presos à parte inferior da placa devido à tensão superficial. No caso de uso de cultura celular especial com alta concentração de soro (por exemplo, rpmi suplementado com soro bovino fetal de 20%) é usado, uma etapa de lavagem adicional com 1x PBS depois de remover o meio no poço pode ser necessário para aumentar a tensão superficial.
  6. Tire o prato do poço da incubadora e inverta-o de volta. Adicione meio de cultura celular fresco (RPMI suplementado com soro bovino fetal de 10% e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina) ao redor da agarose lançada, canalizando-o lentamente ao longo da parede do poço.
  7. Coloque o prato de volta na incubadora de cultura celular por 48 h.

4. Ensaio de citotoxicidade

  1. Prepare 3 mL de 1x PBS com soro bovino fetal de 2% por agarose.
  2. Após a co-cultura por 4 d, remova o meio de cultura celular em torno do elenco agarose com uma pipeta P1000 inclinando ligeiramente a placa de poço com a outra mão.
    NOTA: O período total de cocultura deve ser decidido pelo investigador.
  3. Distribua 1 mL de 1x PBS + 2% FBS com uma pipeta P1000 na câmara de semeadura para desalojar os esferoides dos microwells.
  4. Repita o passo 4.3 duas vezes com o volume no poço e transfira-o para um tubo de 15 mL.
  5. Centrifugar o tubo a 300 x g para 10 s em temperatura ambiente (RT).
  6. Remova cuidadosamente o supernatante com uma pipeta P1000.
  7. Lave as células adicionando 1 mL de 1x PBS com 2% de FBS e centrífuga a 300 x g por 1 min no RT.
  8. Repita a etapa de lavagem (passo 4.7).
  9. Remova o supernatante e adicione 1 mL de solução de enzimas de dissociação celular (ver Tabela de Materiais).
  10. Use uma pipeta P200 e pipeta para cima e para baixo para quebrar os aglomerados celulares.
  11. Incubar as células por 20 min na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2).
  12. Repita o passo 4.10.
    NOTA: Tire ~10 μL e sementes em um prato de cultura celular para observar (sob o microscópio a 10x de ampliação) o quão bem os esferoides se dissociaram em células únicas. Se necessário, adicione 5 minutos de incubação adicional.
  13. Adicione 4 mL de meio de cultura celular completa (RPMI suplementado com soro bovino fetal de 10% e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina) e misture invertendo o tubo 3\u20124 vezes.
  14. Centrifugar a 400 x g por 4 min no RT.
  15. Remova o supernascer e resuspense as células no tampão FACS para coloração anexa v de células apoptóticas.
    NOTA: A partir daqui em diante, qualquer coloração FACS e análise celular podem ser realizadas.

5. Gel de processamento de hidroxietila agarose incorporando gel para secção IHC

NOTA: Aqui é fundamental evitar o uso de agarose de baixo derretimento para gerar os moldes de agarose.

  1. No final da co-cultura, remova o meio de cultura celular em torno do elenco agarose com uma pipeta P1000 primeiro inclinando a placa de poço. Em seguida, remova lentamente e cuidadosamente o meio dentro do elenco, mirando suavemente um canto da câmara de semeadura com uma pipeta P200, mantendo a placa bem inclinada com a outra mão.
  2. Pipeta lentamente 10% formalina primeiro na câmara de semeadura, mirando suavemente um canto da câmara de semeadura com uma pipeta P200. Em seguida, adicione 10% de formalina ao lado de fora do elenco agarose até que esteja completamente coberto. Corrija o elenco de agarose em 10% de formalina para 1 d.
  3. Remova a formalina no dia seguinte.
  4. Cuidadosamente pipeta 210 μL (81-microwell cast) ou 100 μL (35-microwell cast) de gel de processamento de hidroxietila pré-aquecido e liquefeito (ver Tabela de Materiais) cair-em-direção na câmara de semeadura da ágarose lançada segurando a pipeta P200 cerca de 0,5 cm acima do elenco.
  5. Deixe o gel de processamento de hidroxietila agarose solidificar por 10 minutos na RT.
  6. Transfira o elenco agarose para 1x PBS.
    NOTA: Para um armazenamento mais longo, incorpore o gesso em 70% de etanol para evitar contaminação.
  7. Desidratar os setores de gel através de uma série de etanol (1h cada: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol [3x muda cada]). Em seguida, limpe em uma solução de compensação 3x por 1 h cada (por exemplo, hidrocarbonetos alifáticos [por exemplo, Clearite], ou xileno), e infiltrar-se com parafina derretida (3x por 1 h cada), manualmente ou em um processador de tecidos. Incorpore o gesso em cera de parafina para secção subsequente a 5 μm por seção.
  8. Remova a cera colocando lâminas em xileno, 3x por 3 min cada, depois refira seções de tecido por meio de uma série de álcool classificado: 100% etanol por 2 min, 95% etanol por 1 min, 80% etanol para 30 s e 70% etanol para 30 s, depois coloque na água.
  9. Realize a recuperação de epítope induzida pelo calor em um vapor vegetal a 100 °C por 20 min, seguido por 20 min de resfriamento em uma solução de citrato de sódio de 10 mM pH 6.0 e bloco peroxidases endógenas com H2O2.
  10. Bloqueie as seções com soro de gol normal e exponha-as a anticorpos anti-CD8 (diluição 1/25) durante a noite.
  11. Aplique anticorpos secundários conjugados anti-coelho-HRP (ver Tabela de Materiais) e desenvolva a coloração usando cromagen de diaminobenzidina de 3,3'-Diaminobenzidina (DAB). Núcleos de contra-mancha com uma solução de hematoxilina Harris de 11% (ver Tabela de Materiais).

6. Monitorando e analisando a invasão de spheróides na co-cultura

NOTA: O ponto de tempo da invasão esferoide de imagem na matriz de colágeno I deve ser decidido pelo investigador. Adquira imagens de cultura celular usando um microscópio invertido com ampliação de 10x. O ponto de tempo ideal depende da linha celular que está sendo testada, bem como do componente ECM. Linhas celulares mais invasivas começarão a se espalhar para o colágeno dentro de poucas horas após a adição do colágeno. Uma vez que as células T na co-cultura podem impedir uma visão completa sobre a saída dos eferóides em pontos de tempo muito precoces, geralmente as imagens são tiradas a 0h (como referência), 24 h e 48 h após a adição do colágeno.

  1. Quantita a invasividade contando manualmente o número de "picos" provenientes do esferoide e/ou usando software de análise de imagem, por exemplo, Imagem J.
    1. Analise a invasão como o número de "picos" do esferoide contando manualmente o número de "picos" de um esferoide.
      NOTA: É para ser decidido pelo investigador quais saliências dos esferoides são consideradas como "picos". Um critério de decisão pode ser o comprimento do "pico" medido a partir da borda do esferoide.
    2. Analise a invasão como a área de invasão em relação ao tamanho do esferoide.
      1. Use a Ferramenta de Desenho à Mão Livre (Imagem J) para rastrear a borda da área total (invasão + área esferoide).
      2. Clique em Analisar no menu superior e, em seguida, clique em Medir para exibir a medição da área.
      3. Rastreie a fronteira da área total de esferoides.
      4. Clique em Analisar no menu superior e, em seguida, clique em Medir para exibir a medição da área.
      5. Copie a lista de resultados medidos em uma planilha e calcule a invasão total/esferoide usando a fórmula: invasão total = área total/área esferoide.

7. Mancha de imunofluorescência

  1. Prepare o seguinte.
    1. Prepare 5,4% de formalina (5 mL) utilizando 2,3 mL de PBS 1x e 2,7 mL de 10% de formalina.
    2. Prepare 0,5% Octoxynol (50 mL) utilizando 50 mL de 1x PBS e 2,5 mL de Octoxynol de 10% (loja na RT).
    3. Prepare o IF Buffer (200 mL) utilizando 200 mL de 1x PBS, 200 mg de albumina de soro bovino (BSA), 4 mL de 10% Octoxynol, 1 mL de 10% polisorbato 20 (aqueça-se com RT antes do uso; filtro e armazenar a 4 °C).
    4. Prepare a solução de bloqueio (5 mL) usando 5 mL IF Buffer e 500 μL de soro de cabra (aqueça-se ao RT antes de usar).
    5. Mantenha slides de câmara de 8 poços, tampas de vidro e mídia de montagem pronta.
  2. Dia 0
    1. Corrija todo o elenco de agarose, incluindo os esferoides, durante a noite em 5,4% de formalina na RT em uma câmara umidificada.
  3. Dia 1º
    1. Remova o meio de cultura celular ao redor do molde de agarose com uma pipeta P1000 inclinando a placa de poço.
    2. Transfira o patch de colágeno em um slide de câmara de 8 poços, agarrando um canto da matriz de colágeno dentro da câmara de sementes do elenco agarose com pinças pontiagudas elegantes e descascá-la do elenco agarose em um único movimento confiante.
      NOTA: O patch de colágeno deve ser facilmente separado do elenco agarose. Caso contrário, use uma pipeta P1000 para adicionar cuidadosamente o meio de cultura na área da câmara de semeadura ou inverter o molde de agarose e agitar suavemente a placa de bem para desalojar a matriz de colágeno.
    3. Adicione 250 μL de 0,5% Octoxynol (ver Tabela de Materiais) por poço. Incubar por 1 h na RT.
    4. Aspire o Octoxynol e adicione 250 μL de solução de bloqueio por poço. Bloqueie por 1h no RT.
    5. Enquanto isso, diluir o anticorpo primário (diluição para anti-queratina 8: 1/500; Faloidein 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) na solução de bloqueio, calculando para 250 μL por poço.
    6. Adicione o anticorpo primário na solução de bloqueio e coloque o deslizamento da câmara em uma câmara umidificada para incubação durante a noite na RT.
  4. Dia 2.
    1. Remova o anticorpo primário na solução de bloqueio aspirando.
    2. Lave 3 vezes adicionando 300 μL de IF Buffer e deixe-o sentado por 5 min no RT.
      NOTA: Deixe-o sentar, não há necessidade de colocá-lo em um shaker.
    3. Diluir o anticorpo secundário na solução de bloqueio (para anti-queratina 8: anti-rato, diluição 1/500).
    4. Adicione 250 μL de anticorpo secundário na solução de bloqueio a cada poço e incubar por 1h na RT. De agora em diante, proteja as amostras da luz.
    5. Remova o anticorpo secundário na solução de bloqueio aspirando.
    6. Lave 3 vezes com 300 μL de IF Buffer adicionando e deixe-o sentado por 5 min no RT.
    7. Enxágüe as amostras com 1x PBS e aspire-as.
    8. Remova cuidadosamente as paredes do deslizamento da câmara para que apenas o deslizamento de vidro na parte inferior permaneça.
    9. Adicione pelo menos 200 μL de mídia de montagem a uma mancha de vidro e solte lentamente a mancha de cobertura sobre a amostra.
      NOTA: Evite criar bolhas, pois isso afetará a qualidade da imagem. As bolhas podem ser evitadas colocando suavemente o deslizamento da tampa na borda longa do slide em um ângulo de 45° ou baixando lentamente o deslizamento da tampa no slide.
    10. Coloque as amostras montadas em um lugar escuro e seco e deixe-a sentar durante a noite. As imagens podem ser realizadas no dia seguinte.
      NOTA: O deslizamento de cobertura pode inicialmente mudar um pouco uma vez colocado sobre o patch de colágeno. Deixe o deslizamento de vidro sentar-se em uma área uniforme por alguns minutos. O deslizamento de cobertura irá achatar a amostra de modo que não restará nenhuma lacuna entre o deslizamento de vidro e o deslizamento de tampas ao longo do tempo.

8. Isolamento das células da matriz de colágeno

  1. Prepare o seguinte.
    1. Prepare 1 mg/mL colagenase 4 em meio de cultura celular contendo soro (armazene colagenase 4 diluições a -20 °C)
    2. Prepare 2,5% de BSA em PBS 1x e cubra todos os tubos e pontas de pipeta com ele (filtro solução BSA antes de usar).
    3. Pré-aquecimento da solução BSA e do meio de cultura celular antes do uso.
  2. Prepare 2 mL de solução de colagenase 4 (1 mg/mL) para digerir um máximo de três matrizes de colágeno de 35 moldes de agarose de 35 microwells.
  3. Transfira até três matrizes de colágeno de 75 μL de 35 microwell agarose lançadas em um tubo de 15 mL pré-revestido de BSA de 2,5%. Segure um canto da matriz de colágeno dentro da câmara de semeadura do elenco de agarose com pinças pontiagudas elegantes e retire-a do elenco agarose em um único movimento confiante.
  4. Bevel-cut a ponta de uma ponta P1000 com tesoura. Pré-cubra a ponta restante com 2,5% de BSA e quebre a matriz de colágeno o máximo possível, encanando para cima e para baixo. Incubar o tubo por 15 min a 37 °C.
  5. (Etapa crítica 4) A cada 5 minutos, verifique se a matriz de colágeno se dissolveu. Pipeta para cima e para baixo novamente antes de tirar 10 μL da amostra e semeá-la em um prato de cultura celular para observar sob o microscópio a 10x de ampliação. Adicione mais 5 min, se necessário.
  6. Encha o tubo com 10 mL de meio de cultura de células pré-armadas (DMEM suplementado com soro bovino fetal de 10%). Misture suavemente invertendo o tubo 3\u20124 vezes.
  7. Centrifugar o tubo a 400 x g por 4 min no RT.
  8. Remova cuidadosamente o supernaspe e deixe 2 mL de volume.
  9. (Etapa crítica 5) Deixe 2 mL após a primeira etapa de centrifugação, pois ainda pode haver colágeno não resolvido na parte inferior do tubo carregando células ao longo delas.
  10. Execute duas etapas de lavagem adicionando 10 mL de meio de cultura celular contendo soro a cada vez. Centrifugar cada vez a 400 x g por 4 min no RT.
  11. Após a última etapa de lavagem, retire o máximo possível do meio e deixe apenas a pelota da célula.
  12. Resuspensar a pelota celular em 1 mL de solução de enzimas de dissociação celular (ver Tabela de Materiais).
  13. Use uma pipeta P200 e pipeta para cima e para baixo para quebrar os aglomerados celulares.
  14. Incubar as células por 20 min na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2).
  15. Repita o passo 8.13.
    NOTA: Tire ~10 μL e semente em um prato de cultura celular para observar sob o microscópio a 10x de ampliação para ver o quão bem os esferoides se dissociaram em células únicas. Se necessário, adicione 5 minutos de incubação adicional.
  16. Adicione 4 mL de meio de cultura celular (DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal) e misture invertendo o tubo 3\u20124 vezes.
  17. Centrifugar a 400 x g por 4 min no RT.
  18. Remova o supernatante. A partir de agora, a coloração FACS ou a cultura celular podem ser realizadas.

9. Extração de RNA da matriz de colágeno

  1. Prepare o tiocianato guanidinium com fenol (ver Tabela de Materiais),100% clorofórmio, 70% etanol sem RNase, kit de extração de RNA (ver Tabela de Materiais),tubos de 1,5 mL livres de RNase, tubos de 15 mL sem RNase e ddH2O sem RNase.
  2. Transfira até doze matrizes de colágeno de 190 μL de 81 microwell agarose lançadas em um tubo de 15 mL. Segure um canto da matriz de colágeno dentro da câmara de semeadura do elenco de agarose com pinças pontiagudas elegantes e retire-a do elenco agarose em um único movimento confiante.
    NOTA: As matrizes também podem ser congeladas a -80 °C até estarem prontas para a extração do RNA.
  3. Adicione 1 mL de tiocianato de guanidinium com fenol (ver Tabela de Materiais) às matrizes de colágeno no tubo de 15 mL.
    NOTA: O tiocianato de guanidinium com fenol deve cobrir completamente as matrizes de colágeno.
  4. Vórtice dos tubos para 10\u201220 s.
  5. Homogeneize as matrizes com agulhas de 20 G e seringas de 5 mL até que sejam completamente dissolvidas.
  6. Deixe as matrizes sentarem por 5 minutos na RT.
  7. Adicione 200 μL de clorofórmio puro às matrizes e agite o tubo vigorosamente por 15 s.
  8. Transfira imediatamente a mistura para tubos de 1,5 mL.
  9. Deixe a mistura descansar por pelo menos 5 minutos no RT até que as fases sejam separadas.
  10. Centrifugar os tubos de 1,5 mL a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
  11. Encha um novo tubo de 1,5 mL com 500 μL de 70% de etanol.
    NOTA: Dependendo do volume da fase aquosa após a centrifugação (ver passo 9.12. pode não ser de 500 μL. A quantidade de 70% de etanol deve ser igual ao volume da fase aquosa.
  12. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior das amostras centrífugas para o tubo 70% cheio de etanol e misture bem por tubulação para cima e para baixo.
  13. (Etapa crítica 6) Tenha cuidado para não perturbar as camadas na parte inferior do tiocianato guanidinium com separação de fenol enquanto remove a fase superior, pois isso contaminará o RNA.
  14. Adicione a amostra a uma coluna de extração de RNA (incluída no kit de extração de RNA, ver Tabela de Materiais). A partir de agora, siga o protocolo do fabricante para purificação de RNA a partir de células.

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Representative Results

O modelo de cocultura 3D permite diferentes ensaios mostrados na Figura 1A, que podem ser combinados ou modificados conforme necessário. Em nossa configuração experimental estabelecida, tumores e células T são co-cultivados por 2 dias seguidos pelo início do ensaio de invasão para seleção de células tumorais invasivas e/ou resistentes(Figura 1B). No dia 4 é realizada a quantitação da invasão e as células "sobreviventes" são isoladas da matriz de colágeno ou processadas diretamente para extração de RNA23 ou DNA da matriz(Figura 1B). Incorporar a cultura 3D no colágeno tipo I dentro das microiágenas do molde agarose permite monitorar e analisar a invasão usando a Imagem J para primeiro demarcar a área total usando a ferramenta de desenho à mão livre do software e, em seguida, calcular a razão sobre a área desmarcada spheroid(Figura 2A), e/ou contando o número de "picos" deixando o spheroid. Utilizando-se duas linhas primárias de células cancerígenas pancreáticas murinas (linha celular 1 e linha celular 2), diferentes formas esferoides e comportamento invasivo foram observadas e quantificadas em conformidade(Figura 2B). A linha celular 1 mostra uma formação mais compacta e invasão "espetada", comparável à invasão de células únicas, enquanto a linha celular 2 forma mais esferoides soltos e mostra um padrão de invasão coletiva(Figura 2C). A cocultura foi realizada com duas diferentes linhas de células clonais tumorais semeadas ao mesmo tempo (Figura 3A\u2012E) para acompanhar suas interações durante ensaios subsequentes, e com células tumorais e células T na formação de esferoides tumorais(Figura 3F\u2012J). Para avaliação detalhada do comportamento invasivo, foi realizada a coloração imunofluorescente(Figura 4). Após a separação da matriz de colágeno do molde de agarose, se coloração e transferência para um slide de vidro (Figura 4A\u2012B), a imagem concórcal foi realizada de forma de alto rendimento(Figura 4C\u2012J). O tamanho e a consistência do molde agarose permitem a incorporação de todo o sistema de cultura 3D em parafina para seção serial e imunohistoquímica (IHC) para quantificar a relação espacial entre tumor e células T(Figura 5). As células T presentes na seção podem ser identificadas e ainda caracterizadas pela coloração do marcador de superfície celular exemplificada aqui para CD8 (Figura 5D,E). As células T que se infiltraram no esferoide tumoral podem ser contadas em relação às que permaneceram na periferia do esferoide. A Figura 5D,E mostra exemplos de infiltração distinta de células T em esferoides tumorais cultivados a partir da linha 1(D)e da linha celular 2 (E). A Tabela 1 mostra configurações experimentais típicas para os ensaios e o rendimento de amostras representativas e analisáveis no final do experimento para cada protocolo.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho, análises e cronograma de experimentos. (A) Um molde de borracha de 81 microwell e 35 microwells são preenchidos com 2% de agarose em 1x PBS para gerar uma ágarose moldada com múltiplas microwells. O diâmetro de um molde de borracha é de 3,5 cm. O tamanho do molde de 35 microwell agarose é de 13 mm x 8 mm, e do molde de 81-microwell é de 13 mm x 13 mm. Esferoides são formados sobre a semeadura celular nas câmaras da agarose lançadas em um único passo de pipetação. A co-cultura com células T é realizada dentro do mesmo elenco. O monitoramento funcional e os ensaios potenciais são mostrados. (B) Linha do tempo de experimentos. As células tumorais são co-cultivadas com células T autólogas por 2 dias, permitindo uma interação máxima entre ambos os tipos de células. O ensaio de invasão é iniciado após dois dias. As análises de ponto final são realizadas após mais dois dias para monitorar o fenótipo invasivo e de sobrevivência das células tumorais, bem como a proliferação e sobrevivência das células T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Quantificação da invasão. A invasão pode ser quantificada por análise de imagem, por exemplo, usando o software Image J e contando o número de "picos" por spheroid. (A) Cálculo da área de invasão total como uma razão da área total para a área esferoide. Barra de escala: 300 μm. (B) Exemplos de duas diferentes linhas primárias de células cancerígenas pancreáticas murinas (linha celular 1 e 2) na formação esferoide em diferentes ampliações e invasão no colágeno tipo I. (C) A análise da invasão é realizada contando o número de picos por esferoide (diagrama esquerdo; barras de erro: 2,63 para a linha celular 1, 1,47 para a linha celular 2) e calcular a área de invasão conforme descrito (diagrama direito; barras de erro: 0,36 para a linha celular 1, 1,28 para a linha celular 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Co-cultura com tumor rotulado por corante e células T. (A\u2012E) Mistura de duas linhas de células clonais de câncer pancreático murina primárias com rótulo diferente (verde e vermelho) e visão ampliada de uma microwell representativa(B\u2012E). (F\u2012J) Co-cultura de tumor pré-rotulado (verde) e células T (vermelho). (G\u2012J) A visão ampliada de um microwell representativo mostra uma co-cultura tumor-t-célula sobre a formação de esferoides tumorais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Mancha de imunofluorescência. A coloração da imunofluorescência (IF) foi realizada após a separação da matriz de colágeno do molde agarose. (A\u2012B) Após a coloração do IF, as manchas de colágeno são transferidas para um escorregador de vidro e cobertas com tampas de vidro. (C\u2012F) Exemplo de um patch de colágeno manchado de IF, incluindo esferoides tumorais com (C) Hoechst, (D) queratina 8, (E) fhalloidina e (F) sobreposição. Painéis (G\u2012J) Mostrar a respectiva visão ampliada de um único esferoide. Barra de escala = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Seção de imunohistoquímica. O elenco de agarose com a cultura 3D imerso em gel de processamento de hidroxietila agarose, foi incorporado em parafina, seccionado e processado para coloração imunohistoquímica (IHC). ( A ) Blocodeparafina usado para seção horizontal que começa a partir da parte inferior do elenco agarose para obter seções seriais de múltiplas co-culturas de células tumorais/células T dentro de um único gesso; barra de escala = 5 mm. (B) Seção manchada de hematoxilina e eosina de um molde de agarose contendo co-cultura 3D de tumores e células T. Barra de escala: 1 mm. (C) Visão ampliada de uma co-cultura manchada de H&E dentro do elenco agarose. Coloração CD8 de células T co-cultivadas com linha celular 1 (D) e linha celular 2 (E). Barras de escala em C\u2012E = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo configuração típica células semeadas (por gesso) rendimento típico
ensaio de citotoxicidade 2x 81-microwell moldes 81,000 100.000 células
Ensaio do IHC 1x 81-microwell elenco 81,000 40 esferoides
Ensaio de invasão 2x 35-microwell moldes 35,000 50 esferoides
Se ensaio 2x 35-microwell moldes 35,000 50 esferoides
Isolamento celular do colágeno I 2x 35-microwell moldes 35,000 50.000 células
Extração de RNA de colágeno I 12x 81-microwell moldes 243,000 400-600 ng/μl

Tabela 1: Configuração experimental típica e rendimento para os protocolos. A tabela mostra a configuração experimental típica para cada protocolo e o rendimento típico de amostras analisáveis (número de células, esferoides ou concentração de RNA) no final do experimento, respectivamente. IHC= imunohistoquímica; IF= imunofluorescência.

Arquivo complementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo. 

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Discussion

O método aqui apresentado descreve a geração de esferoides tumorais 3D, que permite a co-cultura com células T, ensaios funcionais e moleculares baseados em células, bem como uma variedade de possibilidades de monitoramento e análise usando um único dispositivo. A grande vantagem da nossa abordagem é que ela não requer a transferência da cultura 3D para um ensaio separado e mantém a integridade da cultura 3D ao longo dos ensaios.

O fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser modificado conforme necessário. Os tempos de incubação para formação de esferoides, cocultura de células T ou ensaio de citotoxicidade, podem precisar ser alterados para diferentes condições experimentais ou linhas celulares.

Existem alguns passos ao longo dos ensaios, que requerem uma adesão próxima ao protocolo. Estes são em geral: remover o meio de cultura celular antes de adicionar uma segunda linha celular para a cocultura, bem como incorporar a cultura 3D em ECM ou gel de processamento de hidroxietila agarose dentro dos moldes agarose. É absolutamente crítico remover lentamente e cuidadosamente o meio da câmara de semeadura inclinando a placa de poço e mirando um canto da câmara com uma micropipette. Enquanto as castas de agarose conterem células, recomendamos remover sempre qualquer meio no poço com uma micropipette, em vez de usar um pipettor. A adição de uma segunda linha celular e a incorporação em ECM ou gel de processamento de agarose hidroxitil precisa ser realizado lentamente e em termos de gota, a fim de evitar a descarga das células nos microwells. O passo mais crítico do ensaio de invasão de colágeno é o tempo de incubação antes de inverter os moldes no bem-prato com os poços. Reduzir o tempo pode fazer com que o colágeno desça do elenco, e exceder o tempo pode fazer com que a cultura seja pressionada até o fundo dos microwells, resultando em invasão esferoide distribuída de forma desigual. Inverter o gesso permite que as células dos microwells subam completamente no colágeno líquido antes que polimerize e solidifique. A tensão superficial entre o molde de ágarose e o fundo plástico da placa de poço, gera uma "queda de enforcamento"15,24 durante a invasão 3D spheroid.

É importante notar que o tempo de incubação antes de inverter os moldes foi estabelecido para incorporar no colágeno tipo I. Com outros componentes ECM, esta etapa deve ser ajustada em conformidade. Note-se que a remoção completa dos meios residuais não deve ser tentada para evitar uma perda inadvertida de células presentes nos microwells. Esta mídia residual resulta em uma leve diluição do ECM adicionado. Isso precisa ser levado em consideração para a análise e adaptação de outros sistemas de ensaio.

A co-cultura descrita aqui permite uma interação tumoral/t-célula máxima antes da invasão das células tumorais: Tumor e células T são co-cultivadas por 2 dias antes de incorporar em colágeno tipo I e, em seguida, identificar células tumorais sobreviventes e invasivas nos próximos dois dias(Figura 1B). Note-se que quando a co-cultura foi iniciada enquanto as células T eram resuspendidas em colágeno I, as células T não mostraram um impacto na invasão de células tumorais e citotoxicidade. Esse efeito pode ser devido às células T serem mais distribuídas em colágeno e, portanto, menos concentradas ao redor dos esferoides. Isso sugere que a interação direta entre tumor e células T durante os dois dias de co-cultura antes do ensaio de invasão é fundamental para a avaliação dos efeitos mediados das células T nas células tumorais.

No entanto, algumas das vantagens deste modelo 3D vêm com desvantagens. Esta configuração de alta produtividade permite a fácil e rápida semeadura de células na ágarose lançada em uma etapa pipetting, resultando na geração de uma multidão de esferoides de tamanho uniforme dentro de um molde. No entanto, uma vez que os esferoides estão todos localizados dentro do mesmo elenco, eles também podem ser facilmente removidos, por exemplo, durante a remoção do meio de cultura celular dentro da câmara de semeadura e enquanto adicionam células T para co-cultura. Portanto, a quantidade de rendimento para cada protocolo depende fortemente das habilidades técnicas e experiência do investigador, mas também do tipo de ensaio que está sendo realizado. Como sugere a Tabela 1, uma possível perda de esferoides de cerca de 50% no final de um experimento deve ser levada em consideração. Além disso, durante a etapa de semeadura, as células podem não distribuir igualmente sobre a área da câmara de semeadura, resultando em esferoides mais ou menos representativos dentro do elenco agarose. Pela nossa experiência, esse efeito aumenta com o tamanho do elenco agarose. Assim, as réplicas devem ser consideradas durante o planejamento do experimento.

A interação espostetemporal das células dentro do sistema 3D pode ser avaliada por imagem de lapso de tempo, o que apresenta outra opção de monitoramento neste modelo. Além disso, o pequeno diâmetro dos microwells e o único passo de pipetação para células de sementes, são adequados para a realização de clonagem de células únicas. Por fim, as amostras do paciente (por exemplo, de biópsias) podem ser analisadas no ensaio devido ao pequeno número de células necessárias para as micro-habitas e ao recurso de alta produtividade do sistema 3D. A inclusão de drogas estimulantes ou de bloqueio (por exemplo, anti-PD-1 ou anti-PD-L1) para sondar a interação célula tumoral/célula T é uma extensão lógica do ensaio.

Em conclusão, o modelo de cocultura 3D spheroid apresentado aqui fornece uma estrutura flexível para monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade das células T co-cultas em um ambiente biologicamente relevante. O crosstalk resultante pode ser visualizado mantendo a integridade da cultura 3D e, assim, fornecer insights mecanicistas sobre as interações células tumorais – T-cell.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos a Virginie Ory, PhD por discussões úteis e conselhos sobre a abordagem do modelo de cocultura 3D. Agradecemos também a Elizabeth Jones pela excelente assistência técnica com a secção IHC. Este estudo foi apoiado por subvenções do DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) para YL (LI 2547/4-1) e dos Institutos Nacionais de Saúde para AW (R01 CA231291), para ATR (R01 CA205632), para GWP (R01 CA218670) e a Bolsa Núcleo do Centro de Câncer (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

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References

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Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

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