Här presenterar vi ett protokoll för att mäta in vitro Ca2 + flussen i midbrain nervceller och deras nedströms effekter på caspase-3 med hjälp av primära mus midbrain kulturer. Denna modell kan användas för att studera pathophysiologic förändringar relaterade till onormal Ca2 + aktivitet i midbrain nervceller, och att skärmen nya therapeutics för anti-apoptotiska egenskaper.
Parkinsons sjukdom (PD) är en förödande neurodegenerativa störning som orsakas av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller. Överdriven Ca2 + tillströmningen på grund av onormal aktivering av glutamat receptorer resulterar i DA excitotoxicitet och har identifierats som en viktig mekanism för DA neuron förlust. I denna studie isolerar vi, separerar och odlar midbrain nervceller från musen ventrala mesencephalon (VM) av ED14 mus embryon. Vi infekterar sedan de långsiktiga primära mus midbrain kulturer med en adeno-associerade virus (AAV) uttrycker en genetiskt kodad kalcium indikator, GCaMP6f under kontroll av den mänskliga neuron-specifika synapsin promotorn, hSyn. Använda levande confocal imaging, vi visar att odlade mus midbrain nervceller visa spontana Ca2 + fluxes upptäckts av AAV-hSyn-GCaMP6f. Bad tillämpning av glutamat till midbrain kulturer orsakar onormala höjder i intracellulära Ca2 + inom nervceller och detta åtföljs av kaspas-3 aktivering i DA nervceller, vilket framgår av immunfärgning. De tekniker för att identifiera glutamat-medierad apoptos i primär mus DA nervceller har viktiga tillämpningar för hög halt screening av läkemedel som bevarar DA neuron hälsa.
Parkinsons sjukdom (PD) är den näst vanligaste neurodegenerativa sjukdomen i världen, utan kända botemedel. Uppskattningar tyder på att PD prevalensen kommer att fortsätta att öka och beräknas överträffa 1 miljon diagnoser till år 2030 i USA ensam1. Med få effektiva behandlingar som för närvarande finns tillgängliga för att bekämpa PD, det finns ett trängande behov av att utveckla effektivare terapier. PD kännetecknas av en snabb och progressiv förlust av midbrain dopamin (DA) nervceller2. De mekanismer som ligger bakom neurodegeneration i PD är dåligt förstådda. Bevis tyder på en trolig konvergens av flera mekanismer, såsom oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion, etc. som bidrar till inledandet av apoptotiska signalering kaskader och eventuell celldöd3.
En sådan konvergent mekanism, glutamat-medierad excitotoxicitet har varit inblandad i flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive PD4. Medan glutamat-medierad excitotoxicitet tros fungera främst genom stimulering av NMDA-receptorer via en överdriven ökning av intracellulära Ca2 + koncentration och eventuell initiering av apoptos, Ca2 +-permeabla AMPA receptorer har också varit inblandad i det excitotoxiska svaret5,6,7. Därför är det av intresse att bestämma bidraget av AMPA-receptorer till glutamat-medierad apoptos inom en PD-modell. Detta kan uppnås med hjälp av NBQX, en AMPA och kainate blockerare, som vid mikromolarkoncentrationer är selektiv för AMPA-receptorer8. Glutamat-medierad excitotoxicity och apoptotiska signalering kaskader är ett idealiskt nedströms mål att mäta omfattningen av celldöd, och en potentiell mål för terapeutisk intervention. Därför utveckla en hög innehållsmetod för att bedöma glutamat-medierad modulering av kalcium aktivitet och associerade nedströms signalering i primära ventrala mesencephalic (VM) nervceller skulle vara värdefullt för screening nya behandlingsmetoder på deras förmåga att bevara neuronal hälsa.
Här har vi utvecklat ett protokoll där vi uttrycker den genetiskt kodade kalciumindikatorn (GECI), GCaMP6f, med hjälp av AAV2/5 med human synapsin (hSyn) promotor för att mäta Ca2 + aktiviteten hos mus VM primära nervceller som svar på glutamat ansökan som kan mätas på den fysiologiska och molekylär nivå. Denna hög innehållsliga screening kan anpassas för att upptäcka läkemedel eller behandlingar som modulerar Ca2 + aktivitet för att bevara hälsan hos VM nervceller. Vi föreslår att denna primära kulturmodell är ett effektivt sätt att screena för nya PD-interventioner, baserat på deras förmåga att bevara hälsan hos VM nervceller och mildra utvecklingen av PD.
Vi beskriver en långsiktig primära ventrala mesencephalic (VM) cell kultur system för hög innehållsinnehåll analys av glutamat-medierad apoptos i nervceller. Studier har anställt primära midbrain dopaminerga kulturer att belysa excitotoxiska mekanismer i samband med PD-modeller11,12. I denna studie använder vi en kombinatorisk metod med hjälp av genetiskt kodade Kalcium indikatorer (GECIs) för att mäta Ca2 + aktivitet och ytterligare associera denna verksamhet med nedströms molekylära förändringar, såsom inledande av apoptotiska signalering kaskader4. Metoden har flera fördelar med andra liknande cellodlingssystem. Som vi har särskilt intresse för excitotoxicitet inom ramen för Parkinsons sjukdom, med hjälp av primära VM cellkulturer är idealisk. Genom att använda olika fält omlokalisering tekniker, såsom gridded coverslips eller en motoriserad XY mikroskop skede kombinerat med TH immunfärgning, kan vi direkt studera celltyp specifika effekter av glutamat-medierad apoptos i ventrala mellanhjärnan nervceller. Dessutom, den 3-veckors cellkultur modell gör det möjligt för nervceller att utveckla sin fulla, mogna molekylär profil, vilket återspeglar vuxna DA nervceller9. Tidigare metoder har främst fokuserat på molekylära förändringar efter glutamat-medierad excitotoxicitet13,14. Modellen är unik i sin förmåga att korrelera akuta förändringar i neuronal fysiologi med nedströms molekylära händelser i identifierade celltyper. En begränsning av den primära odlingsmodellen är att dissektionstekniken fångar hela ventrala mellanhjärnan, inklusive DA och GABAergic nervceller samt nervceller från SNc och VTA. Bevis tyder nu på att DA nervceller av SNc har selektiv sårbarhet för kalcium och eventuell celldöd jämfört med DA nervceller i angränsande VTA15. Tyvärr har differentiering SNc från VTA nervceller i embryonala kulturer visat sig svårt med få anatomiska landmärken att definiera dessa strukturer i den embryonala hjärnan.
Vi visar att den primära odlingstekniken möjliggör kvantifiering av heterogen spontan Ca2+ aktivitet (Figur 1). Därför är detta en idealisk cellkultur systemmodell för att studera tonically aktiva celler, såsom pacemaking dopaminerga nervceller i mellanhjärnan, neokortikala nervceller, och GABAergic nervceller av suprachiasmatic kärnan (SCN)16,17. I de flesta tillämpningar uppnår Ca2+ imaging inte samma temporala upplösning som elektrofysiologi. Därför är det troligt att en enda Ca2 + händelse är analog med en explosion av neuronala åtgärder potentialer. Detta kan tolkas som att Ca2 + imaging möjliggör relativt korrekta åtgärder av onormal sprängning verksamhet i pacemaking celler och är därför lämpligt för en hög halt skärm av Ca2 +-medierad excitotoxiska celldöd.
För att uppnå och upprätthålla spontan Ca2+-aktivitet är det viktigt att ta itu med två viktiga punkter i protokollet. Först är plätering densitet av cellerna efter dissektion. För primära VM nervceller, tidigare studier har använt runt 100.000 celler/cm29,10. Vi har anpassat protokollet till plattan en densitet av 200.000 celler/cm2, vilket skapar ett heterogent utbud av spontan aktivitet och ökar antalet dopaminerga VM nervceller som finns på varje täckplatta. Eftersom olika pacemaking nervceller har distinkta bränning egenskaper16, den plätering densitet måste anpassas till celltyp som studeras och optimeras för att uppnå idealiska nivåer av spontan aktivitet. Andra är inkubationstiden efter virusinfektion av AAV. Liksom plätering densitet, kommer detta att vara beroende av det specifika sammanhanget för forskningen fråga och typ av AAV som används. För de specifika AAV som används här, 5 dagar av inkubation efter virusinfektion är idealisk för att uppnå de önskade proteinuttryck nivåer, vilket möjliggör dynamiska förändringar i GCaMP fluorescens i syfte att registrera Ca2 + aktivitet. Många faktorer avgör hur snabbt och effektivt en AAV kommer att uttrycka sin last, varav mycket ligger utanför ramen för denna metod, men kortfattat, det är viktigt att överväga promotor aktivitet och den hastighet med vilken lastprotein mognar och veck.
En annan fördel med metoden är att den möjliggör avsevärd flexibilitet i format, uttrycksvektorer, användning av bildåtergivningsutrustning, och den rad vetenskapliga frågor som kan behandlas. Dessutom möjliggör metoden utredning av ett brett spektrum av specifika frågor som omger glutamat-medierad excitotoxicitet i PD, och andra modeller av nervsystemet dysfunktion. Till exempel, glutamat-medierad excitotoxicitet innebär flera receptorer och signalering kaskader5. Genom att använda metoden, och som visats med AMPAR-blockeraren, NBQX i figur 1, är det möjligt att dissekera ut specifika komponenter i det excitotoxiska glutamatsvaret på en fysiologisk och molekylär nivå. Möjligen, en liknande metod med hjälp av hämmare av andra budbärare system kan användas för att bestämma deras bidrag till excitotoxicity. Dessutom kan de AAV som används här anpassas för att uttrycka GECIs med cellspecifika initiativtagare eller AAV-uttryckta optogenetiska sensorer som kan användas för att mäta andra parametrar såsom signalsubstansfrigöring.
Bortsett från primära embryonala dissektioner och confocal bildbehandling, mycket av protokollet använder grundläggande laboratoriekunskaper som inte kräver specialiserad utbildning. Därför är begränsningarna för modellen inkluderar svårigheten av den embryonala dissekeringstekniken, den tidslängd cellerna måste odlas för att nå mognad, och tillgång till en konfokal mikroskop, eller liknande bildåtergivningsapparat. Metodens många fördelar och flexibilitet överväger dessa begränsningar, vilket gör detta till en idealisk modell för att studera rollen glutamat-medierad excitotoxicitet vid störningar i nervsystemet. Slutligen, denna modell kan vara ett effektivt verktyg för att skärmen nya föreningar för anti-apoptotiska effekter och deras förmåga att bevara DA neuron hälsa.
The authors have nothing to disclose.
Stöds av bidrag från American Parkinson Disease Association (APDA) och NIH R01NS115809-01 till RS. Vi tackar Texas A & M Institute for Genomic Medicine (TIGM) för att tillhandahålla tidsfördredande dräktiga möss för att generera primära dopaminerga kulturer.
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |