此协议描述了使用不对称流场流分数加上紫外线检测来确定未知金纳米粒子样本的大小。
粒子大小可以说是与纳米粒子概念相关的最重要的物理化学参数。准确了解纳米粒子的大小和大小分布对于各种应用至关重要。尺寸范围也很重要,因为它定义了纳米粒子剂量中最”活跃”的成分。
不对称流场流分馏 (AF4) 是一种强大的技术,用于在大约 1-1000 nm 的大小范围内对悬架中的粒子进行大小大小测定。有几种方法可以从 AF4 实验中获取大小信息。除了根据多角度光散射或动态光散射原理在线将 AF4 与大小敏感探测器耦合之外,还有可能使用成熟的理论方法(FFF 理论)或将其与定义明确的粒子大小标准(外部大小校准)的保留时间进行比较,将样品的大小与其保留时间相关联。
我们在这里描述开发和内部验证的标准操作程序 (SOP) 的大小未知的金纳米粒子样本由 AF4 加上紫外线 – 维斯检测使用外部大小校准与黄金纳米粒子标准在 20-100 nm 的大小范围内。该程序详细描述了已开发的工作流程,包括样品制备、AF4仪器设置和鉴定、AF4方法开发和未知金纳米粒子样品的分馏,以及所获得的结果与既定外部尺寸校准的相关性。此处描述的 SOP 最终在实验室间比较研究的框架中得到了成功验证,该研究强调了 AF4 在悬架中纳米粒子样品尺寸的卓越坚固性和可靠性。
以胶体金为形式的金纳米粒子(AuNP)早在人们了解纳米粒子是什么之前,在纳米粒子进入当代科学词汇之前,就已经是人类文化的一部分。由于对其纳米尺度外观有明显了解,悬挂的AuNP在公元前1世纪的V-VI世纪已经用于中国古代、阿拉伯和印度的医疗和其他目的,古罗马人还利用其红宝石红色在大英博物馆2号的莱库格斯杯展览中著名的陶器污渍。在西方世界,从中世纪到现代的几个世纪里,悬浮的AuNP主要用作玻璃和釉质(卡西乌斯的紫色)3的着色剂,以及治疗各种疾病(可饮用的黄金),特别是梅毒4。
然而,所有这些研究主要侧重于暂停的AuNP的应用,这是由迈克尔法拉第在1857年引入第一个理性的方法,以调查其形成,其性质,以及他们的属性5。虽然法拉第已经意识到,这些AuNP必须有非常微小的尺寸,直到电子显微镜的发展时,关于其大小分布的明确信息是可访问6,7,最终使大小和其他AuNP属性之间的相关性。
如今,由于其相当简单明了的合成,显着的光学特性(表面质子共振),良好的化学稳定性,因此毒性较小,以及其在可用尺寸和表面修饰方面的高多功能性,AuNP已经发现广泛应用领域,如纳米电子8,诊断9,癌症治疗10,或药物输送11。显然,对于这些应用,准确了解应用的 AuNP 的大小和大小分布是确保最佳功效12的基本先决条件,并且需要大量可靠和可靠的工具来确定这一关键的物理化学参数。今天,有大量的分析技术,能够大小AuNP悬架,包括, 例如,紫外线光谱(UV-vis)13、动态光散射(DLS)14或单粒子感应耦合等离子体质谱仪(spICP-MS)15,场流分馏(FFF)是该领域16、17、18、19、20的关键播放器。
FFF于1966年由J.卡尔文·吉丁斯21号首次概念化,它包括一系列基于精英的分馏技术,分离发生在一个薄薄的丝带状通道内,没有固定的第22、23阶段。在FF中,分离是由样品与外力场的相互作用引起的,外力场的作用垂直于层压通道流的方向,其中样品通常向下游输送到各自的内联探测器。在这些相关的FF技术中,不对称流场流分数(AF4),其中第二个流(交叉流)作为力场,已成为最广泛使用的亚型24。在 AF4 中,通道底部(堆积墙)配备了一个半透水超滤膜,能够保留样品,同时允许交叉流通过膜并通过额外的插座离开通道。通过这种方式,交叉流可以将样品推向堆积壁,从而抵消其扩散引起的通量(布朗运动)。在由此产生的场和扩散引起的通量平衡中:表现出较高扩散系数的较小样本成分更接近通道中心,而具有较低扩散系数的较大样本成分则位于靠近堆积壁的地方。由于通道内的抛物线流剖面,因此较小的样本成分在通道流的较快层压中运输,并在较大的样本成分之前进行椭然运输。使用FF保留参数和斯托克斯-爱因斯坦扩散系数方程,AF4样品的流出时间和分别流出体积可以直接转换为其水动力学大小22。这里描述的精英行为是指正常的精英模式,通常适用于AF4在粒子大小范围内约1-500纳米(有时高达2000纳米取决于粒子属性和分数参数),而石阶超层精英通常发生在这个大小阈值25以上。
通过 FFF 分离后,有三种常见方法可以获取大小信息。由于FF是一种模块化仪器,它可以结合下游多个探测器,如大小敏感光散射探测器基于多角度光散射(MALS)26,27,动态光散射(DLS)28,29,甚至两者的组合,以获得额外的形状信息30,31。但是,由于 FFF 通道中样品的保留行为通常受定义明确的物理力控制,因此大小也可以使用数学方法(FFF 理论)进行计算,其中简单的浓度探测器(例如 UV-vis 探测器)足以表示存在32、33个引出样本。
作为第三个选项,我们在这里报告应用外部大小校准34,35使用定义明确的 AuNP 标准在大小范围为 20-100 nm, 以大小未知的金纳米粒子样品悬架使用 AF4 加上紫外线- 维斯检测.这种简单的实验设置是故意选择的,目的是让尽可能多的实验室加入国际实验室间比较(ILC),该比较后来根据此处提出的议定书在欧洲联盟地平线2020项目ACEnano的框架下进行。
AF4 与紫外线-维斯探测器一起,使用定义明确的 AuNP 尺寸标准,准确评估了未知 AuNP 的水动力学尺寸,范围从 20 nm 到 100 nm 不等。开发的 AF4 方法使用恒定的横流轮廓进行优化,以便在测量的保留时间和 AuNP 大小之间建立线性关系,从而允许从线性回归分析中直接确定大小。特别注重实现足够高的恢复率,表明在分馏过程中没有显著的样本损失,并且开发的AF4方法,包括应用的精英和膜与所有分馏的AuNP样品非常匹配。
方法开发可以说是 AF4 中最关键的一步,必须考虑几个参数,包括通道尺寸、流量参数以及流体、膜、间隔高度,甚至样品属性,以便在给定的分流时间窗口内提高分数。本段的目的是引导读者完成优化的关键步骤,以成功确定此处讨论的未知 AuNP 样本的大小。为了更详细地描述如何一般开发AF4方法,读者将参考AF4部分的”ISO/TS21362:2018 – 纳米技术 – 纳米物体分析使用不对称流和离心场流分数“25。仔细观察表 3中的应用分数条件,第一个关键步骤是在 AF4 通道中引入和放松 AuNP 样本。此步骤受注水流、对焦流和交叉流的约束,其相互作用迫使样本定位在靠近膜表面的地方,并将其浓缩在靠近AF4通道喷射端口的窄带中,基本上定义了分馏的起点。必须充分放松样品,因为在此步骤中,不同大小的样本成分位于AF4通道的不同高度,从而为成功的尺寸分馏提供了基础。不完整的样品松弛通常由未实现的(即非放松)样本成分引起的空隙峰值区域增加可见。这种影响可以通过增加注射时间和/或应用的交叉流速来缓解。然而,这两个参数都需要仔细优化,特别是对于容易聚集和吸附到AF4膜上的样品,并且可以通过为不同的参数设置36,37获得的各自的恢复率进行监测。应用注射时间为 5 分钟,交叉流速为 1.0 mL ∙min-1,可显示所有 AuNP 样本的恢复率 +80%,以及表示接近最佳放松条件的可忽略不计的空隙峰值区域。在充分放松 AuNP 样本后,焦点流停止,沿 AF4 通道长度向相应的紫外线检测器传输样品,这是第二个关键步骤。为了在合理的分析时间确保足够高的分馏功率,应用了 1 . 0 mL ∙最小– 1代表 30 – 50 分钟(取决于相应的分馏 AuNP 大小标准),然后以 0 . 5 mL . min – 1 的探测器流速进行了10分钟的线叉流量衰变。使用所有 AuNP 大小标准分离的恒定交叉流剖面,揭示了 FFF-理论22之后保留时间与 AuNP 大小之间的线性关系,从而通过简单的线性回归分析实现未知 AuNP 样本的大小确定。然而,除了恒定的交叉流外,轮廓也被利用来大小纳米粒子,最终导致保留时间和粒子大小38,39之间的非线性关系。此外,使用定义明确的尺寸标准在AF4中确定尺寸不限于AuNP,还可以应用于具有其他尺寸和元素成分的纳米粒子(如银38、40或硅纳米粒子41、42)。此外,在处理稀释样品时,ICP-MS 是一种高度敏感的元素探测器,可与 AF4 配合,从而增加了这种分析方法的多功能性,用于在悬架中对多种纳米粒子进行尺寸调整。
尽管其应用广泛,但在 AF4 中使用定义明确的尺寸标准进行外部尺寸校准具有一些特殊性,在使用它精确大小未知样本时需要考虑这些特性。首先,在分馏各自的尺寸标准和实际样本时,它在很大程度上依赖于可比条件的应用。因此,在此处介绍的案例中,必须使用相同的 AF4 方法以及相同的流体和相同的膜对 AuNP 大小标准以及未知的 AuNP 样本进行分馏,使这种方法变得相当不灵活。此外,由于手头没有大小敏感探测器,例如光散射(MALS 和 DLS),因此很难确定使用尺寸标准的相应 AF4 方法是否工作得足够好。对于显示非常宽幅分布的未知样本尤其如此,目前尚不清楚所有样本成分是否遵循正常的分化模式:从较小的颗粒到较大的颗粒的分馏,或者较大的样本成分是否已经在超层模式下分离,从而有可能与较小的样本成分43、44共同分离。此外, 尽管FF理论强调AF4完全基于水动力学大小的差异而分离,粒子被认为是点质量,而与它们的环境没有任何相互作用,但现实却用粒子粒子和粒子膜讲述了一个不同的故事 相互作用(如静电吸引/排斥或范德瓦尔斯吸引)可能发挥相当大的作用,并可能引入一个可衡量的偏差到大小确定通过外部大小校准45,46。因此,建议使用与感兴趣的粒子的组成和表面特性(Zeta潜力)理想匹配的尺寸标准 40、42 或, 如果没有这些,至少使用具有良好特征的粒子大小标准(如聚苯乙烯乳胶颗粒),并仔细评估其可比性与感兴趣的粒子,特别是在其表面Zeta潜力在各自的环境中,其中分析应进行41,47。
AF4的多功能性通常被认为是它最大的优势,因为它提供了一个应用范围,超越了这个领域的大多数其他常见的大小技术22,48,49。同时,由于其相关的复杂性,它也可能被视为其最大的缺点,特别是对快速和表面上易于使用的大小技术,如DLS,纳米粒子跟踪分析,或单粒子ICP-MS。尽管如此,当将AF4与这些流行的尺寸技术结合在一起时,很明显,所有技术都有其优点和缺点,但所有这些技术都有助于更全面地了解纳米粒子的物理化学性质,因此应被视为互补的,而不是具有竞争力的。
此处介绍的标准操作程序 (SOP), 突出了AF4-UV-vis的出色适用性,外部尺寸校准用于悬架中未知的AuNP样本的大小,并最终被应用为国际实验室间比较(ILC)中对未知的AuNP样本进行AF4分析的推荐指南,该比较是在Horizan 2020项目ACEnano(本ILC的结果将成为未来出版物的主题)框架内进行的。因此,该议定书加在一起,鼓励和正在进行的国际努力,以验证和标准化AF4方法25,50,51,52强调AF4在纳米粒子定性领域的有希望的潜力。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢整个ACEEnano财团在编写本议定书的所有阶段进行了富有成果的讨论。作者还感谢欧盟地平线2020方案(H2020)根据ACEnano项目框架下的赠款协议no 720952提供的资金。
0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF – AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
AF4 Membrane – Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |