Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van Asymmetrische Flow Field-Flow Fractionation in combinatie met UV-vis detectie voor de bepaling van de grootte van een onbekend goud nanodeeltje monster.
Abstract
Deeltjesgrootte is misschien wel de belangrijkste fysisch-chemische parameter die geassocieerd wordt met het begrip nanodeeltje. Nauwkeurige kennis van de grootte en grootteverdeling van nanodeeltjes is van het grootste belang voor verschillende toepassingen. Het groottebereik is ook belangrijk, omdat het de meest "actieve" component van een nanodeeltjesdosis definieert.
Asymmetrische Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is een krachtige techniek voor het dimensioneren van deeltjes in suspensie in het groottebereik van ongeveer 1-1000 nm. Er zijn verschillende manieren om grootte-informatie af te leiden uit een AF4-experiment. Naast het online koppelen van AF4 met maatgevoelige detectoren op basis van de principes van Multi-Angle Light Scattering of Dynamic Light Scattering, is er ook de mogelijkheid om de grootte van een monster te correleren met de retentietijd met behulp van een gevestigde theoretische benadering (FFF-theorie) of door deze te vergelijken met de retentietijden van goed gedefinieerde deeltjesgroottenormen (externe groottekalibratie).
We beschrijven hier de ontwikkeling en interne validatie van een standaard operationele procedure (SOP) voor het dimensioneren van een onbekend gouden nanodeeltjesmonster door AF4 in combinatie met UV-visdetectie met behulp van externe groottekalibratie met gouden nanodeeltjesstandaarden in het groottebereik van 20-100 nm. Deze procedure biedt een gedetailleerde beschrijving van de ontwikkelde workflow, waaronder monstervoorbereiding, AF4-instrumentopstelling en -kwalificatie, AF4-methodeontwikkeling en fractionering van het onbekende goudnanodeeltjesmonster, evenals de correlatie van de verkregen resultaten met de vastgestelde kalibratie van de externe grootte. De hier beschreven SOP werd uiteindelijk met succes gevalideerd in het kader van een interlaboratory vergelijkingsstudie die de uitstekende robuustheid en betrouwbaarheid van AF4 benadrukte voor het dimensioneren van nanodeeltjesmonsters in suspensie.
Introduction
Gouden nanodeeltjes (AuNP) in de vorm van colloïdaal goud maakten al lang deel uit van de menselijke cultuur voordat er inzicht was in wat nanodeeltjes waren en voordat de term nanodeeltjes zijn weg had gevonden in de hedendaagse, wetenschappelijke woordenschat. Zonder duidelijke kennis van hun nanoschaal uiterlijk, geschorste AuNP was al gebruikt voor medische en andere doeleinden in het oude China, Arabië, en India in de V-VI eeuwen voor Christus1, en ook de oude Romeinen profiteerden van hun robijnrode kleur om beroemd vlekken op hun aardewerk in de Lycurgus Cup tentoonstelling in het British Museum2. In de westerse wereld, door de eeuwen heen, van de Middeleeuwen tot de Moderne Tijd, werden hangende AuNP voornamelijk gebruikt als kleurstoffen voor glas en glazuur (Paars van Cassius)3 en om een verscheidenheid aan ziekten te behandelen (Drinkbaar Goud), vooral syfilis4.
Al deze studies hadden zich echter voornamelijk gericht op de toepassing van opgeschorte AuNP en het was aan Michael Faraday in 1857 om de eerste rationele benadering in te voeren om hun vorming, hun aard en hun eigenschappen te onderzoeken5. Hoewel Faraday zich er al van bewust was dat deze AuNP zeer minieme dimensies moeten hebben, was het pas bij de ontwikkeling van elektronenmicroscopie toen expliciete informatie over hun grootteverdeling toegankelijk was6,7, waardoor uiteindelijk de correlatie tussen grootte en andere AuNP-eigenschappen mogelijk werd.
Tegenwoordig, dankzij hun vrij eenvoudige en eenvoudige synthese, opmerkelijke optische eigenschappen (oppervlakteplasmonresonantie), goede chemische stabiliteit en dus kleine toxiciteit, evenals hun hoge veelzijdigheid in termen van beschikbare maten en oppervlakteaanpassingen, heeft AuNP wijdverspreide toepassingen gevonden op gebieden zoals nano-elektronica8,diagnostiek 9,kankertherapie10of medicijnafgifte11. Uiteraard is voor deze toepassingen nauwkeurige kennis van de grootte en grootteverdeling van de toegepaste AuNP een fundamentele voorwaarde om een optimale werkzaamheid12 te garanderen en is er een aanzienlijke vraag naar robuuste en betrouwbare hulpmiddelen om deze cruciale fysisch-chemische parameter te bepalen. Tegenwoordig is er een overvloed aan analytische technieken die aunp in suspensie kunnen dimensioneren, waaronder, bijvoorbeeld UV-vis Specroscopie (UV-vis)13, Dynamic Light Scattering (DLS)14 of Single Particle Inductively-Coupled Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)15 met Field-Flow Fractionation (FFF) als sleutelspeler op dit gebied16,17,18,19,20.
FFF werd voor het eerst geconceptualiseerd in 1966 door J. Calvin Giddings21en omvat een familie van op elutie gebaseerde fractioneringstechnieken, waarbij scheiding plaatsvindt binnen een dun, lintachtig kanaal zonder stationaire fase22,23. In FFF wordt scheiding veroorzaakt door de interactie van een monster met een extern krachtveld dat loodrecht op de richting van een laminaire kanaalstroom werkt, waarbij het monster stroomafwaarts meestal naar de respectieve in-line detectoren wordt getransporteerd. Onder deze gerelateerde FFF-technieken is Asymmetrische Flow Field-Flow Fractionation (AF4), waarbij een tweede stroom (cross flow) fungeert als het krachtveld, het meest gebruikte subtype24geworden . In AF4 is de kanaalbodem (accumulatiewand) uitgerust met een semipermeabel ultrafiltratiemembraan dat het monster kan vasthouden terwijl tegelijkertijd de dwarsstroom door het membraan kan gaan en het kanaal via een extra uitlaat kan verlaten. Op deze manier kan de dwarsstroom het monster naar de accumulatiewand duwen en zo de diffusie-geïnduceerde flux (Browniaanse beweging) tegengaan. In een resulterend evenwicht van veld- en diffusie-geïnduceerde fluxen; kleinere monsterbestanddelen met hogere diffusiecoëfficiënten worden dichter bij het kanaalcentrum uitgelijnd, terwijl grotere monsteronderdelen met lagere diffusiecoëfficiënten dichter bij de accumulatiewand worden gevonden. Vanwege het parabolische stromingsprofiel in het kanaal worden daarom kleinere monsterbestanddelen getransporteerd in de snellere laminae van de kanaalstroom en elute vóór grotere monsterbestanddelen. Met behulp van FFF-retentieparameter en Stokes-Einstein diffusiecoëfficiëntvergelijkingen kunnen de elutietijd en respectievelijk het elutievolume van een monster in AF4 vervolgens rechtstreeks worden vertaald in zijn hydrodynamische grootte22. Hier verwijst het beschreven elutiegedrag naar de normale elutiemodus en is meestal geldig voor AF4 binnen een deeltjesgroottebereik tussen ongeveer 1-500 nm (soms tot 2000 nm afhankelijk van deeltjeseigenschappen en fractioneringsparameters), terwijl sterisch-hyperlayer-elutie meestal boven deze groottedrempelvoorkomt 25.
Er zijn drie veelvoorkomende manieren om grootte-informatie af te leiden na scheiding door FFF. Aangezien FFF een modulair instrument is, kan het stroomafwaarts worden gecombineerd met meerdere detectoren zoals maatgevoelige lichtverstrooiingsdetectoren op basis van het principe van Multi-Angle Light Scattering (MALS)26,27, Dynamic Light Scattering (DLS)28,29, of zelfs een combinatie van beide om aanvullende vorminformatie te verkrijgen30,31. Aangezien het retentiegedrag van een monster in een FFF-kanaal echter over het algemeen wordt bepaald door goed gedefinieerde fysische krachten, kan de grootte ook worden berekend met behulp van een wiskundige benadering (FFF-theorie), waarbij een eenvoudige concentratiedetector (bijvoorbeeld een UV-visdetector) voldoende is om de aanwezigheid van een elutingmonster aan te geven32,33.
Als derde optie rapporteren we hier de toepassing van een externe groottekalibratie34,35 met behulp van goed gedefinieerde AuNP-normen in het groottebereik van 20-100 nm voor het dimensioneren van een onbekend gouden nanodeeltjesmonster in suspensie met behulp van AF4 in combinatie met UV-visdetectie. Deze eenvoudige experimentele opzet werd met opzet gekozen om zoveel mogelijk laboratoria in staat te stellen deel te nemen aan een internationale interlaboratory comparison (ILC), die later werd uitgevoerd in het kader van het Horizon 2020-project ACEnano van de Europese Unie op basis van het hier gepresenteerde protocol.
Protocol
1. AF4 systeemopstelling
- Monteer de AF4-cartridge en sluit alle hardwarecomponenten van het AF4-systeem en de UV-visdetector(Materialentabel)aan volgens de instructies in de gebruikershandleiding.
- Installeer alle benodigde softwarepakketten voor controle, gegevensverwerving, verwerking en evaluatie volgens de instructies in de gebruikershandleiding.
- Zorg ervoor dat alle noodzakelijke signaalverbindingen tussen het AF4-systeem en de UV-visdetector tot stand zijn gebracht.
- Zorg ervoor dat de gevestigde AF4-UV-vis aansluitingen strak en zonder lekkages zijn door de opstelling gedurende 15 min door te spoelen met ultrapure water (UPW) (tipdebiet 1 mL∙min-1,scherpsteldebiet 1 mL∙min-1en kruisdebiet 1,5 mL∙min-1). Open hiervoor de AF4-besturingssoftware en voer de stroomsnelheden in de respectieve panelen aan de rechterkant van de bestemmingspagina in. Draai indien nodig de betreffende connectoren (fittingen) vast en herhaal de procedure totdat er geen lekkages waarneembaar zijn.
OPMERKING: De interne systeemdruk tijdens alle metingen moet worden bewaakt en moet binnen 4 tot 12 bar liggen. Als de druk hoger of lager is, moet de rugdrukslang worden aangepast. Bovendien moet de kanaaldruktrend gedurende de volledige meettijd constant zijn.
OPMERKING: Als er een kanaaloven beschikbaar is, stelt u de temperatuur in op 25 °C om vergelijkbare meetomstandigheden te garanderen tijdens alle AF4-experimenten.
2. Voorbereiding van oplossingen en suspensies voor AF4-UV-vis systeemkwalificatie en monsteranalyse
- Reinigingsoplossing
- Voeg 8 g vast natriumhydroxide (NaOH) en 2 g natrium dodecylsulfaat (SDS) toe aan 1 L UPW en roer de oplossing tot de totale ontbinding.
- Eluens
- Voeg 500 μL gefilterd oppervlakteactieve mengsel toe aan 2 L gefilterde en ontgaste UPW om het eluent (0,025% (v/v), pH rond 9,4) te verkrijgen.
OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving van de verbindingen van het oppervlakteactieve mengsel is opgenomen in tabel 1 (ook tabel met materialen).
- Voeg 500 μL gefilterd oppervlakteactieve mengsel toe aan 2 L gefilterde en ontgaste UPW om het eluent (0,025% (v/v), pH rond 9,4) te verkrijgen.
- Willekeurige AuNP-groottenorm voor massaherstelbepaling
- Vortex een willekeurige AuNP-maatnorm (50 mg∙L-1) gedurende 2 minuten en verdun deze 1:4 met UPW om een uiteindelijke massaconcentratie van 12,5 mg∙L-1te verkrijgen. Vortex gedurende nog eens 2 minuten na verdunning om de verkregen suspensie te homogeniseren.
LET OP: Noodzakelijke voorzorgsmaatregelen en geschikte beschermingsmiddelen zijn vereist bij het werken met chemicaliën, met name NaOH-pellets.
OPMERKING: Het wordt over het algemeen aanbevolen om alle noodzakelijke oplossingen (met uitzondering van de reinigingsoplossing) te ontgassen en te filteren met behulp van een membraanfilter van 0,1 μm (hydrofiele PVDF of iets dergelijks) om lage deeltjesachtergronden te garanderen tijdens AF4-UV-vis-experimenten. Dit kan worden vastgesteld door een speciale vacuümfiltratie-eenheid of met behulp van spuitfilters.
- Vortex een willekeurige AuNP-maatnorm (50 mg∙L-1) gedurende 2 minuten en verdun deze 1:4 met UPW om een uiteindelijke massaconcentratie van 12,5 mg∙L-1te verkrijgen. Vortex gedurende nog eens 2 minuten na verdunning om de verkregen suspensie te homogeniseren.
3. AF4-UV-vis systeemkwalificatie
- Gebruik de software-instellingen beschreven in stap 1.4 om het systeem gedurende 30 minuten door te spoelen met de reinigingsoplossing (Tipdebiet 1 mL∙min-1,Focusdebiet 1 mL∙min-1en Kruisdebiet 1,5 ml∙min-1).
- Verander de betreffende eluentfles en spoel het systeem met UPW gedurende 20 min (Tipdebiet 1 mL∙min-1,Focusdebiet 1 mL∙min-1, en Kruisdebiet 1,5 ml∙min-1).
- Vervang de betreffende inline pompfilters.
- Open de AF4-cartridge en vervang het AF4-membraan. Monteer de AF4-cartridge opnieuw en sluit deze opnieuw aan op het AF4-UV-vis-systeem.
- Spoel het gereinigde AF4-UV-vissysteem minstens 30 minuten met het eluent om het membraan in evenwicht te brengen en het systeem te stabiliseren (Tipdebiet 1 mL∙min-1,Focusdebiet 1 mL∙min-1en Kruisdebiet 1,5 mL∙min-1). Controleer nogmaals op mogelijke lekkages (zie stap 1.4).
- Kwalificeer het AF4-UV-vis-systeem door het massaherstel en de variatie van de retentietijd te bepalen met behulp van een willekeurige AuNP-groottestandaard.
- Voer een directe injectierun uit zonder een scheidingskracht toe te dienen.
- Maak een nieuw meetbestand door Bestand | te openen Nieuwe | Voer de AF4-besturingssoftware uit.
- Definieer de beschrijving van het monster en de meting, evenals het injectievolume en de naam van het monster op het tabblad Uitvoeren. De meetcondities worden weergegeven in tabel 2.
- Stel de meetparameters in op de FFF-methode op het tweede tabblad volgens tabel 2.
- Klik op de knop Uitvoeren om de meting te starten.
- Voer een fractioneringsrun uit met toepassing van een scheidingskracht (Cross flow).
- Definieer de fractioneringsmethode zoals beschreven in de vorige sectie met behulp van de fractioneringsvoorwaarden die zijn gespecificeerd in tabel 3.
- Klik op de knop Uitvoeren om de meting te starten.
- Voer de meting in viervoud uit.
OPMERKING: De eerste run is gericht op het conditioneren van het systeem (d.w.z. het AF4-membraan) en wordt uitgesloten van de eindevaluatie van de systeemkwalificatieresultaten.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om alle gegenereerde run-bestanden op te slaan door File | te openen Opslaan in de AF4-besturingssoftware. - Overweeg het AF4-UV-vis-systeem gekwalificeerd als een massaherstel van >80% en een variatie van retentietijd <2% wordt verkregen voor de willekeurige AuNP-maatnorm.
- Wanneer u een autosampler als injectiesysteem gebruikt, vult u de naaldwasreservoirfles van de autosampler met dezelfde oplossing die door het AF4-UV-vis-systeem wordt gepompt (bijv. reinigingsoplossing, UPW of respectieve eluent) om optimale werkingsomstandigheden te garanderen. Bij het veranderen van het eluent wordt over het algemeen aanbevolen om de her equilibratie van het AF4-systeem te volgen door het UV-vis-detectorsignaal te controleren totdat de uitgangswaarde op een constant niveau stabiel blijft.
- Voer een directe injectierun uit zonder een scheidingskracht toe te dienen.
4. AF4-UV-vis monsteranalyse
- Bereid alle AuNP-maatnormen voor externe groottekalibratie voor door de respectieve AuNP-suspensie (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, elk 50 mg) te vortexen. L-1) gedurende 2 minuten en verdun het 1:4 met UPW om een uiteindelijke massaconcentratie van 12,5 mg∙L-1te verkrijgen. Vortex gedurende nog eens 2 minuten na verdunning om de verkregen suspensies te homogeniseren.
- Bereid het onbekende AuNP-monster voor op analyse volgens dezelfde procedure als voor de kalibratienormen zoals beschreven in stap 4.1.
- Voer een directe injectiemeting uit van alle AuNP-maatnormen met behulp van de AF4-methode die wordt weergegeven in tabel 2.
- Voer hiervoor de respectieve waarden in tabel 2 in de software van de fabrikant in op de juiste posities om de scheidings- en steekproefparameters te definiëren en druk op de knop Uitvoeren om het experiment te starten.
- Fractioneer elke AuNP-maatstandaard afzonderlijk met behulp van de AF4-methode die in tabel 3 wordt weergegeven om de kalibratiefunctie van de externe grootte vast te stellen.
- Voer de respectieve waarden in tabel 3 in de software van de fabrikant op de juiste posities in. De fractioneringsmethode wordt gedefinieerd door een scherpstelstap, verschillende elutiestappen en een spoelstap. Nadat u de methode hebt ingesteld, drukt u op de knop Uitvoeren om het experiment te starten.
- Voer een directe injectiemeting uit van het onbekende AuNP-monster met behulp van de AF4-methode die wordt weergegeven in tabel 2.
- Voer de fractionering van het onbekende AuNP-monster uit door de in tabel 3genoemde AF4-methode uit te voeren .
- Alle in de sectie 3 en 4 genoemde metingen in drievoud uitvoeren, tenzij anders vermeld om zinvolle en statistisch relevante resultaten te garanderen.
- Bewaar 50 mg∙L-1 AuNP bouillonsuspensies bij 4–8 °C voor gebruik. Verdunde AuNP-suspensies worden idealiter binnen 30 minuten voor het aanbrengen bereid.
OPMERKING: Vortexing is meestal voldoende en er is geen ultrasone trilling van de suspensies nodig. - Om een correlatie van de bewaartijd van het onbekende AuNP-monster mogelijk te maken met de bewaartijden die zijn verkregen voor de AuNP-maatnormen, meet u alle monsters met dezelfde AF4-methode.
OPMERKING: Om constante en geldige scheidingsomstandigheden te garanderen, moet u de fractioneringsstap opnemen/herhalen die wordt beschreven in de sectie systeemkwalificatie (zie stap 3.6.2) na een bepaald aantal monstermetingen (bijv. 10 metingen). Bovendien, record systeemdruk en UV-vis detector baseline stabiliteit. Ze moeten stabiel en constant blijven tijdens een volledige AF4-UV-vis run.
OPMERKING: Vervang meestal het ultrafiltratiemembraan wanneer de UV-visdetector (of Multi Angle Light Scattering (MALS)-detector (indien beschikbaar) een verhoogd geluidsniveau of de gedefinieerde systeemkwalificatiecriteria zoals herstel, piekvorm van monsters of herhaalbaarheid mist (of het AF4-UV-vis-systeem is onderworpen aan een grondige reinigingsprocedure). Onder de hier beschreven omstandigheden is het gekwalificeerde AF4-UV-vissysteem meestal stabiel voor ten minste 50 metingen met hetzelfde membraan; het aantal mogelijke opeenvolgende metingen dat aan de gedefinieerde kwaliteitscriteria voldoet, kan echter aanzienlijk variëren, afhankelijk van de steekproef, de steekproefmatrix en de eluentsamenstelling.
- Bewaar 50 mg∙L-1 AuNP bouillonsuspensies bij 4–8 °C voor gebruik. Verdunde AuNP-suspensies worden idealiter binnen 30 minuten voor het aanbrengen bereid.
5. Gegevensevaluatie
- Voer de massaherstelberekening uit met behulp van gegevensevaluatiesoftware die door de fabrikant van het AF4-UV-vis-systeem wordt geleverd of spreadsheetanalyse na uitvoer van alle benodigde ruwe gegevens (d.w.z. UV-vis-piekgebied) uit de respectieve software voor gegevensverwerving volgens de instructies in de handleiding van de fabrikant.
- Bereken het AuNP-massaherstel door de gebieden onder de respectieve UV-vispieken van de fractioneringsmeting(A-fractionering)en de directe injectiemeting (eendirecte injectie)te vergelijken met behulp van de volgende vergelijking:
OPMERKING: Tijdens een directe injectiemeting wordt geen scheidingskracht uitgeoefend en daarom kunnen mogelijke interacties van een analytsoort met de accumulatiewand worden verwaarloosd. Het gebied onder een respectieve UV-vispiek kan rechtstreeks worden gecorreleerd met de AuNP-massa met behulp van de Beer-Lambert-wet, ervan uitgaande dat geen andere soorten in het monster absorberen op de respectieve golflengte en/of i) elutes bij een andere retentietijd onder fractioneringsomstandigheden ii) wordt verwijderd door het AF4-membraan. - Importeer de dat. bestanden verkregen uit zowel de directe injectie als de fractioneringsrun.
- Selecteer het traceringsspoor van de UV-visdetector op het tabblad Overzicht.
- Definieer een regio van belang (ROI) en een basislijn in de signaal- en basislijnweergave voor alle metingen.
- Plaats een directe injectiekalibratie via Insert.
- Selecteer alle directe injectieruns in de weergave Instellingen voor directe injectiekalibratie en voer een UV-extinctiecoëfficiënt in.
OPMERKING: Het is belangrijk om dezelfde UV-vis extinctiecoëfficiënt te gebruiken voor zowel de kalibratie als de fractioneringsmeting. - Stel de kalibratielijn vast met behulp van het gebied onder het UV-vis signaalspoor binnen de ROI en de geïnjecteerde hoeveelheid berekend op basis van de ingevoerde concentratie en het injectievolume. De verkregen kalibratie wordt weergegeven in het afzonderlijke venster Directe injectiekalibratiefunctie.
- Wijs de kalibratiefunctie toe aan de respectieve fractioneringsmetingen.
OPMERKING: Voor elke kalibratiegroottenorm en het onbekende AuNP-monster moet een afzonderlijke kalibratiefunctie worden ingesteld vanwege de grootteafhankelijke UV-visabsorptie van AuNP. Dit nadeel van de UV-vis detector kan worden omzeild met behulp van een massagevoelige detector zoals een ICP-MS. - Voer de analyses uit door een berekening van kwantitatieve resultaten in te voegen en de resultaten worden weergegeven in een tabel aan de rechterkant als concentratie- en geïnjecteerde hoeveelheidswaarden.
- Bereken het AuNP-massaherstel door de gebieden onder de respectieve UV-vispieken van de fractioneringsmeting(A-fractionering)en de directe injectiemeting (eendirecte injectie)te vergelijken met behulp van de volgende vergelijking:
- Bereken de variatie van de bewaartijd met behulp van data-evaluatiesoftware die door de AF4-systeemfabrikant wordt geleverd of spreadsheetanalyse na uitvoer van alle benodigde ruwe gegevens (d.w.z. bewaartijden van de AuNP-kalibratienormen op de respectieve UV-vispiek maxima en respectieve leegtetijden) van de respectieve software voor gegevensverwerving volgens de instructies in de gebruikershandleiding.
- Open het venster Overzicht om de respectieve UV-sporen weer te geven voor alle geïmporteerde metingen.
- De piekdetectie wordt automatisch uitgevoerd; pas de piekdetectieparameters in de toolbox voor signaalverwerking aan om de prestaties te optimaliseren. Haal de respectievelijke piekmaxima's eruit door alle meetbestanden door telopen.
- Bereken de relatieve standaarddeviatie voor alle metingen met behulp van de volgende vergelijking:
De berekening kan ook worden uitgevoerd met behulp van een respectieve spreadsheetsoftware.
- Voer de groottebepaling uit met behulp van gegevensevaluatiesoftware die door de fabrikant wordt geleverd of spreadsheetanalyse na uitvoer van alle benodigde onbewerkte gegevens (bewaartijd bij UV-vis piek maximum van analyt en respectieve leegtetijd) van de respectieve software voor gegevensverwerving volgens de instructies in de handleiding van de fabrikant. Een externe groottekalibratiefunctie kan worden vastgesteld door de nietige tijd gecorrigeerde retentietijden (netto retentietijden, zie tabel 5) van de AuNP-maatnormen (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) te plotten ten opzichte van hun hydrodynamische maten verkregen uit eerder uitgevoerde DLS-metingen (zie tabel 4).
OPMERKING: De DLS-metingen moeten idealiter op dezelfde dag worden uitgevoerd als de respectieve fractioneringsmetingen om vergelijkbare monstereigenschappen te garanderen.- Na het importeren van de .dat bestanden worden alle metingen weergegeven op het tabblad Overzicht. Selecteer het UV-vis detectorsignaal uit de detectorenlijst, die onder het overlayvenster wordt weergegeven. Definieer een ROI en basislijn voor elke meting, die kunnen worden aangepast in de weergave Signaal en basislijn. Gebruik de toolbox Signaalverwerking aan de rechterkant om lawaaierige signalen glad te strijken. Gebruik de functie Verwerkingsparameters toewijzen aan andere uitvoeringen om de parameters toe te wijzen aan andere metingen, respectievelijk signalen.
- Selecteer de deeltjesgroottekalibratie op het tabblad Invoegen.
- Selecteer alle kalibratieruns door op de betreffende meting te klikken in de tabel Referenties selecteren voor kalibratie rechtsboven. Alle geselecteerde metingen worden weergegeven in een onderstaande tabel. Voer de hydrodynamische straal in voor alle kalibratiemetingen die zijn gespecificeerd in tabel 4. De functie wordt weergegeven in het venster Deeltjesgrootte kalibratie – Functie en de vergelijking wordt ook weergegeven.
OPMERKING: De correlatiecoëfficiënt (R2) van de gevestigde kalibratiefunctie moet ≥0,990 zijn. - Wijs de kalibratiefunctie toe aan de metingen van het onbekende AuNP-monster door de respectieve fractionaties in de lijst Uitvoeringen selecteren voor toewijzing te selecteren.
- Geef de resultaten weer door een deeltjesgrootteverdelingsberekening te openen op het tabblad Invoegen. De eerder gemaakte deeltjesgroottekalibratie wordt vermeld als kalibratie voor de onbekende AuNP-monstermetingen, die in de rechtervensterinstellingenwordt weergegeven. De berekende grootte wordt weergegeven in het venster grootteverdeling dat is gelabeld met het piekmaximum. Schakel het selectievakje Gemiddelde signalen voor voorbeeld in om alle metingen van één monster te gemiddelden en vermeld het resultaat in het maximale pieklabel.
- Teken bovendien de kalibratielijn over het fractogram door het selectievakje Kalibratiecurve weergeven in te schakelen. Een cumulatieve grootteverdeling is beschikbaar door het selectievakje Cumulatieve distributie weergeven in te schakelen.
OPMERKING: Wanneer u software van de fabrikant gebruikt voor gegevensevaluatie, is het raadzaam om alle resultaten aan een rapport toe te voegen, die kunnen worden gegenereerd door op Rapport op het tabblad Invoegen te klikken. Met de knop Rapport worden alle resultaten, tabellen en diagrammen aan een document toegevoegd. Onder het tabblad Rapport kunnen de rapportinstellingen worden gewijzigd door Rapportinstellingen te openen in de sectie Document.
Representative Results
Ten eerste werden de AuNP-maatnormen gefractioneerd door AF4 en gedetecteerd door UV-vis die de absorptie van de AuNP meet bij een golflengte van 532 nm (oppervlakteplasmonresonantie van AuNP). Een overlay van de verkregen fractogrammen wordt weergegeven in figuur 1. De retentietijden van elke AuNP op het respectieve UV-vispiekmaximum verkregen uit driedubbele metingen zijn vermeld in tabel 5. De relatieve standaarddeviatie van alle retentietijden lag onder de 1,1% met een afnemende meetvariatie met toenemende grootte. Over het algemeen werd een uitstekende herhaalbaarheid bereikt. Een constante scheidingskracht werd toegepast, wat resulteerde in een lineaire relatie van elutietijd en hydrodynamische grootte. De kalibratielijn van de externe grootte werd vastgesteld door de opgegeven hydrodynamische straal te plotten tegen de gecorrigeerde elutietijd (nettoretentietijd). Een lineaire regressieanalyse resulteerde in een lineaire kalibratiefunctie met een interceptie a = -3.373 nm ± 1.716 nm en een helling b = 1.209 nm∙min-1 ± 0.055 nm∙min-1. Het lineaire gedrag van de elutie werd bevestigd met een kwadraat correlatiecoëfficiënt R2 van 0,9958. De betreffende kalibratiefunctie wordt visueel weergegeven in figuur 2.
Het tweede deel had betrekking op de analyse van de onbekende AuNP-steekproef. Drie aliquots van het monster werden bereid volgens de procedure beschreven in de protocolsectie (punt 4.2). Elk van de drie aliquots werd in drievoud onderzocht met behulp van dezelfde AF4-fractioneringsmethode die ook werd toegepast voor de AuNP-maatnormen. Alle negen AF4-UV-vis fractogrammen die van het onbekende AuNP-monster zijn verkregen , worden gepresenteerd in figuur 3 en hun respectieve evaluaties zijn samengevat in tabel 6. De relatieve standaardafwijking van de respectieve retentietijden was aanzienlijk laag en varieerde tussen 0,1% en 0,5%. Met behulp van de deeltjesgroottekalibratiefunctie die is verkregen uit de fractionering van de AuNP-maatnormen en deze correleert met de verkregen retentietijden van het onbekende AuNP-monster op het UV-vispiekmaximum, kan een totale gemiddelde hydrodynamische straal van 29,4 nm ± 0,2 nm worden berekend. Bovendien werd een redelijk massaherstel van 83,1% ± 1,2% verkregen, wat wijst op geen significante agglomeratie of ontbinding van het AuNP-monster of een aanzienlijke adsorptie van deeltjes op het membraanoppervlak. Figuur 4 toont de verkregen deeltjesgrootteverdeling met alle negen UV-vis signaalsporen die gemiddeld de uitstekende robuustheid van de toegepaste AF4-methode benadrukken.
Figuur 1: AF4-UV-vis fractogrammen verkregen uit drievoudige analyse van de vier individuele AuNP-maatkalibratienormen met genormaliseerde signaalintensiteiten en toegepast constant kruisdebiet (zwarte lijn). De leegte piek is gemarkeerd in grijs op ongeveer 5.9 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verkregen kalibratiefunctie van de externe grootte, met inbegrip van foutbalken die zijn afgeleid van de respectieve standaardafwijkingen van de DLS-metingen (tabel 4) en afwijkingen in de verkregen AF4-retentietijden (tabel 5), na het plotten van de gespecificeerde hydrodynamische straal ten opzichte van de retentietijd van elke afzonderlijke Kalibratienorm van de AuNP-grootte op het respectieve piekmaximum. Een lineaire kalibratiefunctie met standaardfouten in de vorm van y = a + bx met a = -3.373 nm ± 1.716 nm en b = 1.209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1 werd berekend op basis van een lineaire regressieanalyse. Een kwadraat correlatiecoëfficiënt met R2 = 0,9958 werd bepaald, wat wijst op een lineaire relatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: AF4-UV-vis fractogrammen van drievoudige metingen van drie aliquots die de onbekende AuNP weergeven. Het toegepaste constante dwarsdebiet gedurende de meettijd wordt geïllustreerd als een zwarte lijn. De leegte piek op ongeveer 5,9 min is gemarkeerd in grijs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Overlay van de verkregen gemiddelde deeltjesgrootteverdeling (rood) van het onbekende AuNP-monster en de toegepaste lineaire kalibratiefunctie (stippellijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Component | CAS-Nr | Gewicht (%) | |
| Water | 7732-18-5 | 88.8 | |
| 9-Octadecenoïnezuur (Z)-, verbinding met 2,2',2''-nitrilotris[ethanol](1:1) | 2717-15-9 | 3.8 | |
| Natriumcarbonaat | 497-19-8 | 2.7 | |
| Alcoholen, C12-14-secundair, ethoxylated | 84133-50-6 | 1.8 | |
| Tetrasodium EDTA | 64-02-8 | 1.4 | |
| Polyethyleenglycol | 25322-68-3 | 0.9 | |
| Natriumoleaat | 143-19-1 | 0.5 | |
| Natriumbicarbonaat | 144-55-8 | 0.1 | |
Tabel 1: Lijst van de bestanddelen van het oppervlakteactieve mengsel dat wordt gebruikt om het eluent te bereiden (zie ook Tabel met materialen).
| AF4-UV-vis parameters | Eenheid | Waarde |
| Spacer dikte | Μm | 350 |
| Detectordebiet | ml min-1 | 0.5 |
| Dwarsdebiet | ml min-1 | 0 (constant gedurende 8 minuten) |
| Focus debiet | ml min-1 | 0 |
| Vertragingstijd / stabilisatietijd | Min | 0 |
| Injectiedebiet | ml min-1 | 0.5 |
| Overgangstijd | Min | 0 |
| Injectietijd | Min | 0.1 |
| De stap van de elutie | Min | 8 |
| Staptijd spoelen | Min | 0.1 |
| Spoelstapdebiet | ml min-1 | 0.1 |
| Injectievolume | µl | 10 |
| Monsterconcentratie | mg L-1 | 12.5 |
| Membraantype | Geregenereerde cellulose | |
| Membraan moleculair gewichtsafsnul | kDa | 10 |
| Eluens | 0,025% (v/v) oppervlakteactieve mengsel | |
| UV-vis golflengte | Nm | 532 |
| UV-vis gevoeligheid | - | 0.001 |
Tabel 2: Samenvatting van de AF4-UV-vis fractioneringsmethodeparameters om de directe injectierun uit te voeren zonder toepassing van een scheidingskracht.
| AF4-UV-vis parameters | Eenheid | Waarde |
| Spacer dikte | Μm | 350 |
| Detectordebiet | ml min-1 | 0.5 |
| Dwarsdebiet | ml min-1 | 1 (60 min constant, 10 min lineair) |
| Focus debiet | ml min-1 | 1.3 |
| Vertragingstijd / stabilisatietijd | Min | 2 |
| Injectiedebiet | ml min-1 | 0.2 |
| Overgangstijd | Min | 0.2 |
| Injectietijd | Min | 5 |
| De stap van de elutie | Min | 70 (60 min constant, 10 min lineair) |
| Spoelstap | Min | 9 |
| Spoelstapdebiet | ml min-1 | 0.5 |
| Injectievolume | µl | 50 |
| Monsterconcentratie | mg L-1 | 12.5 |
| Membraantype | Geregenereerde cellulose | |
| Membraan moleculair gewichtsafsnul | kDa | 10 |
| Eluens | 0,025% (v/v) oppervlakteactieve mengsel | |
| UV-vis golflengte | Nm | 532 |
| UV-vis gevoeligheid | - | 0.001 |
Tabel 3: Samenvatting van de AF4-UV-vis fractioneringsmethodeparameters om de fractioneringsrun uit te voeren met toepassing van een dwarsstroom als scheidingskracht.
| Kalibratiestandaard | Aftoppingsagent | Gemiddelde grootte (TEM) (nm) | CV (gemiddelde grootte TEM) (%) | Zeta potentieel (mV) | SD (zetapotentieel) (mV) | Hydrodynamische radius (DLS) (nm) | SD (hydrodynamische radius) (nm) | Pdi | SD (PDI) |
| AuNP 20 nm | Citraat | 20.1 | ≤ 8 | -48.9 | 1.5 | 10.95 | 0.12 | 0.082 | 0.009 |
| AuNP 40 nm | Citraat | 40.8 | ≤ 8 | -30.4 | 1.0 | 20.30 | 0.13 | 0.127 | 0.006 |
| AuNP 80 nm | Citraat | 79.2 | ≤ 8 | -51.5 | 1.3 | 38.85 | 0.23 | 0.138 | 0.013 |
| AuNP 100 nm | Citraat | 102.2 | ≤ 8 | -50.9 | 0.9 | 52.30 | 0.37 | 0.078 | 0.009 |
Tabel 4: Samenvatting van de fysisch-chemische parameters van de toegepaste AuNP-kalibratienormen, met inbegrip van aftoppingsmiddel, TEM-gemiddelde grootte, Zeta-potentiaal bepaald in de native suspensie en DLS hydrodynamische radius, en polydispersiteitsindex (PDI) bepaald in het eluent.
| Kalibratiestandaard | Uitvoeren | Retentietijd op piekmaximum (min) | Netto retentietijd op piekmaximum (min) | Gemiddelde netto retentietijd (min) | SD (%) (netto retentietijd) | SD (min) (netto retentietijd) |
| AuNP 20 nm | 1 | 17.368 | 11.468 | 11.56 | 1.02 | 0.12 |
| 2 | 17.409 | 11.509 | ||||
| 3 | 17.589 | 11.689 | ||||
| AuNP 40 nm | 1 | 25.316 | 19.416 | 19.49 | 0.68 | 0.13 |
| 2 | 25.32 | 19.42 | ||||
| 3 | 25.548 | 19.648 | ||||
| AuNP 80 nm | 1 | 42.095 | 36.195 | 36.29 | 0.23 | 0.08 |
| 2 | 42.219 | 36.319 | ||||
| 3 | 42.257 | 36.357 | ||||
| AuNP 100 nm | 1 | 50.975 | 45.075 | 45.06 | 0.07 | 0.03 |
| 2 | 50.924 | 45.024 | ||||
| 3 | 50.986 | 45.086 |
Tabel 5: Retentietijden van de AuNP-kalibratienormen op het respectieve UV-Vis-piekmaximum afgeleid van de respectieve AF4-UV-vis fractogrammen volgens de in tabel 3beschreven methode .
| Aliquote | Uitvoeren | Retentietijd piek maximum (min) | Gemiddelde retentietijd op piekmaximum (min) | Netto retentietijd op piekmaximum (min) | SD (%) bewaartijd | Hydrodynamische straal (nm) | Herstel (%) |
| 1 | 1 | 32.689 | 32.70 | 26.789 | 0.07 | 29.03 | 85.34 |
| 2 | 32.687 | 26.787 | |||||
| 3 | 32.719 | 26.819 | |||||
| 2 | 1 | 32.989 | 33.08 | 27.089 | 0.37 | 29.49 | 81.73 |
| 2 | 33.073 | 27.173 | |||||
| 3 | 33.187 | 27.287 | |||||
| 3 | 1 | 33.053 | 33.14 | 27.153 | 0.49 | 29.56 | 82.14 |
| 2 | 33.071 | 27.171 | |||||
| 3 | 33.291 | 27.391 |
Tabel 6: Samenvatting van de retentietijden op het respectieve UV-Vis-piekmaximum, de hydrodynamische straal berekend op basis van de kalibratie van de externe grootte (figuur 2) en de terugwinningssnelheid van het onbekende AuNP-monster verkregen uit AF4-UV-vis-analyse.
Discussion
De hydrodynamische grootte van een onbekende AuNP werd nauwkeurig beoordeeld door AF4 in combinatie met een UV-visdetector met behulp van goed gedefinieerde AuNP-maatnormen variërend van 20 nm tot 100 nm. De ontwikkelde AF4-methode werd geoptimaliseerd met behulp van een constant kruisstroomprofiel om een lineaire relatie tot stand te brengen tussen de gemeten retentietijd en de AuNP-grootte, waardoor een eenvoudige groottebepaling van lineaire regressieanalyse mogelijk werd. Bijzondere aandacht ging ook uit naar het bereiken van voldoende hoge herstelpercentages, wat wijst op geen significant monsterverlies tijdens fractionering, en dat de ontwikkelde AF4-methode, met inbegrip van de toegepaste eluent en het membraan, goed overeenkwam met alle gefractioneerde AuNP-monsters.
Methodeontwikkeling is misschien wel de meest kritieke stap in AF4 en verschillende parameters, waaronder kanaalafmetingen, stroomparameters en eluent-, membraan-, afstandshoogte en zelfs monstereigenschappen moeten in aanmerking worden genomen om de fractionering binnen een bepaald elutietijdvenster te verbeteren. Het doel van deze paragraaf is om de lezer te begeleiden door de kritieke stappen die zijn geoptimaliseerd om met succes de grootte van de onbekende AuNP-steekproef te bepalen die hier wordt besproken. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van hoe een AF4-methode in het algemeen te ontwikkelen, wordt de lezer verwezen naar de AF4-sectie van 'ISO/TS21362:2018 - Nanotechnologies - Analysis of nano-objects using asymmetrical flow and centrifugal field-flow fractionation'25. Als we de toegepaste fractioneringsvoorwaarden in tabel 3nader bekijken, is de eerste kritieke stap de introductie en ontspanning van het AuNP-monster in het AF4-kanaal. Deze stap wordt bepaald door de injectiestroom, focusstroom en kruisstroom, waarvan het samenspel het monster dwingt om dicht bij het membraanoppervlak te lokaliseren en het te concentreren in een smalle band in de buurt van de injectiepoort van het AF4-kanaal en in feite het beginpunt van de fractionering definieert. Een voldoende versoepeling van het monster is verplicht, omdat tijdens deze stap monsteronderdelen van verschillende grootte zich in verschillende hoogten van het AF4-kanaal bevinden, waardoor de basis wordt geboden voor een succesvolle groottefractie. Onvolledige monsterontspanning is meestal zichtbaar door een verhoogd leegtepiekgebied als gevolg van niet-vastgehouden (d.w.z. niet-ontspannen) monsterbestanddelen. Dit effect kan worden verzacht door de injectietijd en/of het toegepaste kruisdebiet te verhogen. Beide parameters moeten echter zorgvuldig worden geoptimaliseerd, met name voor monsters die gevoelig zijn voor agglomeratie en adsorptie op het AF4-membraan, en kunnen worden bewaakt door de respectieve herstelsnelheden die zijn verkregen voor verschillende parameterinstellingen36,37. De toegepaste injectietijd van 5 min samen met een kruisdebiet van 1,0 ml∙min-1 onthulde herstelsnelheden >80% voor alle AuNP-monsters en een verwaarloosbaar leeg piekgebied dat bijna optimale ontspanningsomstandigheden aangeeft. Na voldoende ontspanning van het AuNP-monster werd de scherpstelstroom gestopt en werd monstertransport langs de AF4-kanaallengte naar de respectieve UV-visdetector geïnitieerd als vertegenwoordiger van de tweede kritieke stap. Om een voldoende hoog fractioneringsvermogen op redelijke analysemomenten te garanderen, werd een constant kruisdebiet van 1,0 mL∙min-1 gedurende 30-50 min (afhankelijk van de respectieve gefractioneerde AuNP-groottenorm) gevolgd door een lineair kruisstroombederf van 10 minuten bij een detectordebiet van 0,5 ml.min-1 toegepast. Het gebruik van een constant cross flow profiel over de scheiding van alle AuNP-groottenormen onthulde een lineaire relatie tussen retentietijd en AuNP-grootte volgens FFF-theorie22, waardoor groottebepaling van het onbekende AuNP-monster mogelijk werd door eenvoudige lineaire regressieanalyse. Andere profielen dan een constante dwarsstroom zijn echter ook gebruikt voor het dimensioneren van nanodeeltjes , wat uiteindelijk leidde tot een niet-lineaire relatie tussen retentietijd en deeltjesgrootte38,39. Bovendien is de groottebepaling in AF4 met behulp van goed gedefinieerde maatnormen niet beperkt tot AuNP, maar kan ook worden toegepast op nanodeeltjes met andere maten en elementaire samenstelling (bijv. zilver38,40 of silica nanodeeltjes41,42). Bovendien is ICP-MS bij het werken met verdunde monsters een zeer gevoelige elementaire detector, die kan worden gekoppeld aan AF4, wat bijdraagt aan de veelzijdigheid van deze analytische aanpak voor het dimensioneren van een grote verscheidenheid aan nanodeeltjes in suspensie.
Ondanks de wijdverspreide toepassing heeft externe groottekalibratie met behulp van goed gedefinieerde maatnormen in AF4 enkele eigenaardigheden waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik ervan voor het nauwkeurig dimensioneren van onbekende monsters. In de eerste plaats is zij sterk afhankelijk van de toepassing van vergelijkbare voorwaarden tijdens de fractionering van de respectieve groottenormen en de werkelijke steekproef. In het hier gepresenteerde geval is het daarom verplicht dat zowel de AuNP-maatnormen als het onbekende AuNP-monster worden gefractioneerd volgens dezelfde AF4-methode en dezelfde eluent en hetzelfde membraan waardoor deze aanpak vrij inflexibel is. Bovendien is het moeilijk om te bepalen of een respectieve AF4-methode met behulp van maatnormen voldoende goed werkt of niet. Dit geldt met name voor onbekende monsters die zeer brede grootteverdelingen vertonen, waarbij het onduidelijk blijft of alle monsterbestanddelen het normale elutiepatroon volgen: fractionering van kleinere tot grotere deeltjes, of dat grotere monsterbestanddelen al in sterisch-hyperlayermodus eluteeren, waardoor mogelijk wordt samengewerkt met kleinere monsterbestanddelen43,44. Hoewel de FFF-theorie benadrukt dat AF4 zich uitsluitend scheidt op basis van verschillen in hydrodynamische grootte waarbij deeltjes als puntmassa's worden beschouwd zonder interacties met hun omgeving22, vertelt de werkelijkheid een ander verhaal met deeltjes-deeltjes- en deeltjesmembraaninteracties (zoals elektrostatische aantrekking/afstoting of van-der-Waals aantrekkingskracht) kan een aanzienlijke rol spelen en kan mogelijk een meetbare bias in groottebepalingen introduceren via externe groottekalibratie45,46. Het wordt daarom aanbevolen om maatnormen te gebruiken die idealiter overeenkomen met de samenstelling en de oppervlakte-eigenschappen (Zeta-potentiaal) van het deeltje van belang40,42 of, indien deze niet beschikbaar zijn, ten minste gebruik maken van goed gekarakteriseerde deeltjesgroottenormen (bv. polystyreen latexdeeltjes) en hun vergelijkbaarheid met het betrokken deeltje zorgvuldig evalueren, met name wat betreft hun oppervlakte Zetapotentieel in de respectieve omgeving, waarin de analyse moet worden uitgevoerd41,47.
De veelzijdigheid van AF4 wordt vaak beschouwd als de grootste sterkte, omdat het een toepassingsbereik biedt dat verder gaat dan de meeste andere gangbare maattechnieken op dit gebied22,48,49. Tegelijkertijd kan het, vanwege de bijbehorende vermoedelijke complexiteit, ook worden beschouwd als het belangrijkste nadeel ervan, vooral tegen snelle en schijnbaar gebruiksvriendelijke maattechnieken zoals DLS, Nanoparticle Tracking Analysis of ICP-MS met één deeltje. Niettemin wordt bij het relativeren van AF4 met deze populaire maattechnieken duidelijk dat alle technieken hun voor- en nadelen hebben, maar ze dragen allemaal bij aan een uitgebreider begrip van het fysisch-chemische karakter van nanodeeltjes en moeten daarom eerder als complementair dan als concurrerend worden beschouwd.
De hier gepresenteerde standaardbedrijfsprocedure (SOP) benadrukt de uitstekende toepasbaarheid van AF4-UV-vis met externe groottekalibratie voor de dimensionering van een onbekend AuNP-monster in suspensie en werd uiteindelijk toegepast als een aanbevolen richtlijn voor AF4-analyse van een onbekend AuNP-monster binnen een internationale interlaboratory comparison (ILC) die werd uitgevoerd in het kader van het Horizon 2020-project, ACEnano (het resultaat van deze ILC zal het onderwerp zijn van een toekomstige publicatie). Dit protocol draagt dus bij aan de bemoedigende en voortdurende internationale inspanningen om AF4-methodologieën25 , 50,51,52te valideren en te standaardiseren, wat het veelbelovende potentieel van AF4 op het gebied van nanodeeltjeskarakterisering onderstreept.
Disclosures
Alle auteurs van dit manuscript zijn medewerkers van Postnova Analytics GmbH, waarvan de producten in dit protocol worden gebruikt.
Acknowledgments
De auteurs willen het hele ACEnano-consortium bedanken voor vruchtbare discussies in alle stadia van de voorbereiding van het hier gepresenteerde protocol. De auteurs waarderen ook de financiering uit het Horizon 2020-programma van de Europese Unie (H2020) in het kader van subsidieovereenkomst nr. 720952 in het kader van het ACEnano-project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
| 0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
| Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF - AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
| Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
| Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
| Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
| Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
| Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
| Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
| Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
| Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
| Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
| UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
| Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
| Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
| Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |
References
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
- Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
- Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
- Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
- Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
- Borries, B. v, Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
- Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
- Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
- Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), Basel, Switzerland. 43 (2016).
- Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167 (2019).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
- Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
- Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
- Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
- Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
- Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
- Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
- López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , Advance Article (2020).
- Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
- Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. Field-flow fractionation handbook. , Wiley-Interscience. (2000).
- Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the "nano-world". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
- Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
- ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies - of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
- Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
- Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
- Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
- Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
- Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
- Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
- Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
- de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
- Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
- Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
- Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
- Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization - and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
- Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
- Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
- Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
- Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
- Aureli, F., D'Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
- Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
- Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
- Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
- Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
- Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292 (2016).
- Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
- Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
- Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
- Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
- ASTM. ASTM WK68060 - New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).
