Her presenterer vi en protokoll for å karakterisere fullstendig biomolekylær korona, proteiner og metabolitter, anskaffet av nanomaterialer fra biofluider ved hjelp av en kapillær elektroforese – massespektrometri tilnærming.
Adsorpsjonen av biomolekyler fra omkringliggende biologiske matriser til overflaten av nanomaterialer (NMs) for å danne korona har vært av interesse det siste tiåret. Interessen for bio-nano-grensesnittet oppstår fra det faktum at den biomolekylære koronaen gir en biologisk identitet til NMs og dermed får kroppen til å identifisere dem som “selv”. For eksempel har tidligere studier vist at proteinene i korona er i stand til å samhandle med membranreseptorer for å påvirke cellulært opptak og fastslått at korona er ansvarlig for cellulær smugling av NMs og deres eventuelle toksisitet. Til dags dato har de fleste undersøkelser fokusert på protein korona og oversett de mulige virkningene av metabolittene som er inkludert i korona eller synergistiske effekter mellom komponenter i fullstendig biomolekylær korona. Som sådan demonstrerer dette arbeidet metoder for å karakterisere både protein- og metabolittkomponentene i biomolekylær korona ved hjelp av bunn-opp proteomikk og metabolomics tilnærminger parallelt. Dette inkluderer en partikkel fordøyelse av protein korona med et overflateaktivt middel som brukes til å øke protein utvinning, og en passiv karakterisering av metabolitt korona ved å analysere metabolitt matriser før og etter NM eksponeringer. Dette arbeidet introduserer kapillær elektroforese – massespektrometri (CESI-MS) som en ny teknikk for NM koronakarakterisering. Protokollene som er skissert her demonstrerer hvordan CESI-MS kan brukes til pålitelig karakterisering av både protein og metabolitt korona ervervet av NMs. Flyttingen til CESI-MS reduserer volumet av prøve som kreves (sammenlignet med tradisjonell væskekromatografi – massespektrometri (LC-MS) tilnærminger) med flere injeksjoner mulig fra så lite som 5 μL prøve, noe som gjør den ideell for volumbegrensede prøver. Videre reduseres miljøkonsekvensene av analyse med hensyn til LC-MS på grunn av de lave strømningshastighetene (<20 nL / min) i CESI-MS, og bruk av vandige elektrolytter som eliminerer behovet for organiske løsningsmidler.
Bio-nano interaksjoner, ved grensesnittet mellom nanomaterialer (NM) overflater og biologiske matriser hvorfra biomolekyl adsorb til NM, er et intenst forskningsområde som underbygger nanosikkerhet og nanomedisin1. Dette laget av adsorbert biomolekyler gir en biologisk identitet til NMs, og cellene identifiserer dem dermed som “selv”, og påvirker deretter cellulært opptak, distribusjon og biologiske endepunkter2,3,4. De aller fleste bio-nano studier har fokusert på proteinene i korona, og har vist at proteiner varierer kvantitativt og kvalitativt mellom NMs av forskjellige komposisjoner5. Denne variasjonen er avhengig av både egenskapene til NM som størrelse, funksjonalisering og materiale i tillegg til egenskapene til den biologiske matrisen, inkludert sammensetning og saltinnhold5. Et stigende interesseområde for bio-nano-grensesnittet er metabolittene som adsorberer til NMs6. Flere studier har vist at, som med proteinene, er NM-egenskaper en nøkkelfaktor for å bestemme sammensetningen av metabolittene i korona og at de kan påvirke biologiske utfall av NM-eksponering6,7,8.
I studier av biomolekylær korona er det fire forskjellige faser til karakterisering, koronadannelse, isolering av biomolekylene i korona, deres deteksjon via kvalitativ eller kvantitativ massespektrometri og identifikasjon9. Til dags dato har en rekke teknikker blitt vedtatt for å isolere protein korona inkludert koking i SDS-PAGE løpebuffer, løsningsmiddel og saltutvinning eller direkte fordøyelse av proteiner in situ på overflaten av NMs. Når det gjelder metabolittene i korona, er isolasjonen mer kompleks med ulike metoder ved hjelp av løsningsmidler eller til og med oppløsningen av NMs foreslått som løsninger8,10,11. Men i motsetning til protein korona en “one size fits all” tilnærming er usannsynlig å gjelde for isolering av metabolitter fra NMs, på grunn av det brede kjemiske rommet okkupert av metabolome og mangfoldet av mulige NMs. En alternativ tilnærming er å karakterisere den biologiske matrisen før og etter NM-eksponering med forskjellen i metabolittkonsentrasjoner tilskrevet adsorpsjon av metabolitter til NMs.12
Denne alternative tilnærmingen vil gjelde for alle biofluider og NMs, og selv om det krever dobbelt så mye analyse, tilbyr den følgelig et mye mer presist mål på metabolitt korona og har ingen risiko for lave metabolittutvinninger fra NM-overflaten som forveksles med lav binding av den spesifikke metabolitten.
Det andre trinnet i den biomolekylære koronaanalysen er påvisning av biomolekylene. Tradisjonelt for proteinene i korona har dette vært remit av nano-LC-MS, arbeidshesten av proteomikk; andre tilnærminger som NMR13, 1D og 2D SDS-PAGE er også brukt. Når det gjelder metabolitten corona LC-MS7, GC-MS8 og direkte infusjonsmassespektrometri har blitt brukt14. Imidlertid har en ny tilnærming nylig begynt å få trekkraft, nemlig kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS)11,15 og har vært til stede i NM-laboratorier som en frittstående teknikk for å karakterisere ulike fysiske og kjemiske egenskaper til NMs16. CE-MS er en ortogonal separasjonsteknikk for nanoLC-MS og GC-MS og er i stand til å muliggjøre påvisning av svært polare og ladede metabolitter17,18. Videre er CE-MS godt egnet for analyse av proteiner og deres posttranslasjonelle modifikasjoner som fosforylering og glykosylering19,20,21,22. Det siste trinnet, identifisering og dataanalyse kan utføres på flere måter, avhengig av om en kvantitativ / kvalitativ eller målrettet / umålt tilnærming brukes, faller dette imidlertid utenfor denne protokollen.
CESI-MS, en kombinasjon av CE og et nanoESI-grensesnitt, er et nylig fremskritt innen CE-teknologi ved hjelp av et kappeløst grensesnitt. Dette muliggjør direkte tilkobling av ultra-lav strømning CE (<20 nL/min) til et høyoppløselig massespektrometer uten fortynning, noe som resulterer i betydelig forbedret deteksjonsfølsomhet23,24,25. CESI-MS gjør det mulig å analysere volumbegrensede prøver (< 10 μL) samtidig som en svært sensitiv analyse26opprettholdes. CESI-MS sammenligner også gunstig med tradisjonelle nanoLC-MS-tilnærminger med lav strømningshastighet som brukes i proteomikk og metabolomikk når det gjelder reproduserbarhet27,28, gjennomstrømning og overføring, noe som gjør det til et spennende prospekt for fullstendig biomolekylær koronakarakterisering.
For å synliggjøre potensialet til CESI-MS for analysene av bio-nano interaksjoner beskriver dette arbeidet prøveprepareringen som kreves for å isolere NM biomolekylær korona fra en enkelt human plasmaprøve på en slik måte at data maksimeres fra både protein- og metabolittaspektene ved den komplette biomolekylære NM-koronaen. Mens vi rapporterer om bruk av humant plasma, vil denne protokollen være like passende for andre biofluider som blodserum, komplett cellekulturmedium, cellelysat, cerebrospinalvæske eller urin. Analysene av disse to komponentene (proteiner og metabolitter) vil da bli beskrevet ved hjelp av nøytrale belagte CESI-kapillærer for protein korona og nakne silika kapillærer for både kationiske og anioniske metabolitter.
Dette er den første metoden som foreslås å karakterisere den komplette biomolekylære koronainkorporerende proteiner og metabolitter, fra samme prøve, ved hjelp av CESI-MS. Evnen til å karakterisere både proteiner og metabolitter fra samme prøve vil øke mengden data som samles inn fra en enkelt eksperimentell eksponering, noe som muliggjør ny innsikt i prosessen med koronadannelse og dens effekter for NMs toksisitet og effekt som nanomedisiner. Videre er CESI-MS en ideell plattform for å karakterisere begge klasser av biomolekyler med bare en endring av kapillær som kreves. Fremover vil nye metoder utviklet for ikke-vandig CE gjøre det mulig å utføre lipidomikk ved hjelp av CE-MS40, og det er nå mulig å analysere proteiner, metabolitter og lipider ved hjelp av en enkelt plattform. De nåværende konvensjonelle tilnærmingene ville kreve to dedikerte LC-MS-plattformer, en for protein korona og en for metabolitt korona. Dermed kan denne tilnærmingen samle dobbelt så mye data ved hjelp av en enkelt analytisk plattform.
Det er noen forbehold om denne tilnærmingen spesielt med metabolitt korona som denne protokollen foreslår en indirekte måling av korona. Som sådan kan det oppstå problemer når metabolittnivåene er til stede ved høye konsentrasjoner i forhold til NMs og den påfølgende nedgangen i metabolittkonsentrasjonen i matrisen er liten. Men i motsetning til protein korona, er det usannsynlig at en “one size fits all” tilnærming til å isolere metabolitt korona vil bli utviklet på grunn av at hvert NM har unike overflatekjemier. Fremover er det mer sannsynlig at NM-spesifikke tilnærminger for å isolere metabolitt korona vil bli utviklet og validert; Dette gjelder bare for det spesifikke NM. Til tross for dette vil CESI-MS fortsatt være en svært egnet plattform for karakterisering av de polarladede metabolittene uavhengig av hvordan de er isolert. Også bemerkelsesverdig er at hvis en pellet ikke dannes under sentrifugeringstrinnene designet for å pellets NMs, kan det være nødvendig med en høyere sentrifugalkraft; Dette vil mest sannsynlig skje med mindre tette NMs. Det er også kritisk at alle filtreringstrinn overholdes innenfor protokollen på grunn av den smale boringen av kapillærene, disse kan lett bli blokkert hvis noe svevestøv ikke er tilstrekkelig eliminert fra prøven.
Mens protein korona har vært et intenst forskningsområde i en årrekke, er evnen til å kombinere det med metabolitt korona et nytt interessefelt for forskere som undersøker bio-nano-grensesnittet6,14. Til dags dato har flertallet av disse studiene fokusert på den ikke-polare, lipidfraksjonen av metabolitten corona9,28. Denne nåværende metoden muliggjør karakterisering av de svært polare og ladede metabolittene i korona som inkluderer viktige metabolitter involvert i energimetabolisme, glykolyse og DNA-syntese. Som et resultat, når det kombineres med proteomics arbeidsflyten, er en mer helhetlig karakterisering av biomolekylær korona mulig. Dette muliggjør en mer dyptgående analyse av bio-nano interaksjoner fremover. Denne metoden muliggjør forbedret mekanistisk innsikt i reseptormediert endokytose via protein og metabolittinteraksjoner med membranreseptorer. Videre kan inter- og intra koronainteraksjoner mellom proteiner og små molekyler utforskes; for eksempel har det nylig vist seg at proteinene i korona spiller en nøkkelrolle i rekrutteringen av metabolitter15. Det er verdt å merke seg at de representative resultatene i figur 3 og figur 4 er absolutt kvantifisering av metabolitter, men en umålt tilnærming ved hjelp av multivariat dataanalyse for å sammenligne alle CE-MS-funksjoner i kontroller sammenlignet med eksponert plasma vil også belyse metabolittbinding. Dermed er det et betydelig rom for å undersøke hvordan, og hvilke, metabolitter og proteiner påvirker deres respektive rekruttering til NM koronaer. Disse tilleggsstudiene kan bidra til å designe koronaer for å optimalisere levering av nanomedisiner eller avdekke ytterligere hindringer for deres utvikling som undertrykkelse av farmasøytisk virkning på grunn av biomolekylær koronablokkering eller maskering av målrettingsfunksjoner.
CESI-MS med sine nanoskalastrømningshastigheter på rundt 20 nL / min og minimal bruk av organiske løsningsmidler gir en forbedring i grønn og økonomisk legitimasjon over henholdsvis standard LC-MS og nanoLC-MS når det gjelder bruk av løsningsmidler, de viktigste utfordringene for henholdsvis metabolomikk og proteomikkstudier. CESI-MS gir svært reproduserbare resultater for både migreringstid og toppområde som sammenligner seg gunstig med LC-MS-baserte metoder11,15. Sammenlignet med nanoLC-MS er overføring heller ikke et problem i CESI-MS. Derfor er det ikke nødvendig med omfattende systemopprydding mellom utvalgsanalyser, noe som i stor grad forbedrer prøvegjennomstrømningen11.
Oppsummert er den foreslåtte arbeidsflyten den første til å detaljere en tilnærming for å karakterisere både protein- og metabolittkomponentene i den komplette biomolekylære koronaen til NMs. Dette låser opp et nytt aspekt av bio-nano interaksjoner, metabolitt korona, og dermed muliggjør innsamling av dobbelt så mye data fra samme prøve, noe som muliggjør en mer fullstendig forståelse av interaksjoner ved bio-nano-grensesnittet.
The authors have nothing to disclose.
A.J.C, J.A.T og I.L erkjenner finansiering fra EU-kommisjonen via Horisont 2020-prosjektet ACEnano (Grant No. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z anerkjenner ph.d.-midler fra China Scholarship Council (CSC, nr. 201507060011). R.R anerkjenner den økonomiske støtten til Vidi-tilskuddsordningen til Den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO Vidi 723.0160330).
1,4-Dithiothreitol | Sigma | 10197777001 | |
2,2,4,4-D4-citric | Simga | 485438-1G | Internal standard anion |
Ammonium Acetate >98% | Sigma | A1542 | |
Ammonium Bicarbonate >99.5% | Sigma | 09830 | |
Capillary cartridge coolant | Sciex | 359976 | |
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | |
CESI Cap | Sciex | B24699 | |
CESI Vials | Sciex | B11648 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic, use in a fume hood |
Glacial Acetic acid | Sigma | A6283 | |
Hydrochloric acid 1mol/L | Sigma | 43617 | |
Iosoacetamide | Sigma | I1149 | |
L-methionine sulfone | Sigma | M0876-1G | Internal standard cation |
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) | Sigma | 14262 | Use in a fume hood |
Microvials | Sciex | 144709 | |
nanoVials | Sciex | 5043467 | |
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length | Sciex | B07368 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers |
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
Phospahte buffered saline 10x | Sigma | P7059 | |
Pierce C18 Tips, 100 µL bed | Thermo Fisher Scientific | 87784 | |
Polystyrene 100 nm | Polysciences Inc | 876 | |
Polystyrene carboxylated 100 nm | Polysciences Inc | 16688 | |
Polystyrene carboxylated 1000 nm | Polysciences Inc | 08226 | |
Rapigest SF (surfactant) | Waters | 186001860 | |
Sequencing Grade modified Trypsin | Promega | V5111 | |
SiO2 Ludox TM-40 | Sigma | 420786 | |
Sodium Hydroxide solution | Simga | 72079 | |
TiO2 Dispex coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 PVP coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 uncoated | Promethion particles | Bespoke particles |