Här presenterar vi ett protokoll för att karakterisera den kompletta biomolekylära koronan, proteiner och metaboliter, förvärvade av nanomaterial från biofluider med hjälp av en kapillärelektrofores – masspektrometrimetod.
Adsorptionen av biomolekyler från omgivande biologiska matriser till ytan av nanomaterial (NMs) för att bilda corona har varit av intresse under det senaste decenniet. Intresset för bionanogränssnittet beror på att den biomolekylära koronan ger NMs en biologisk identitet och därmed får kroppen att identifiera dem som “jag”. Tidigare studier har till exempel visat att proteinerna i koronan kan interagera med membranreceptorer för att påverka cellulärt upptag och konstaterat att koronan är ansvarig för cellulär handel med NMs och deras eventuella toxicitet. Hittills har de flesta forskning fokuserat på proteinet corona och förbisett de möjliga effekterna av de metaboliter som ingår i koronan eller synergistiska effekter mellan komponenter i den kompletta biomolekylära koronan. Som sådan visar detta arbete metoder för att karakterisera både protein- och metabolitkomponenterna i den biomolekylära koronan med hjälp av bottom-up proteomik och metabolomik närmar sig parallellt. Detta inkluderar en partikelsammanfattning av proteinet corona med ett tensid som används för att öka proteinåtervinningen och en passiv karakterisering av metaboliten koronan genom att analysera metabolitmatriser före och efter NM-exponeringar. Detta arbete introducerar kapillärelektrofores – masspektrometri (CESI-MS) som en ny teknik för NM-koronarkarakterisering. De protokoll som beskrivs här visar hur CESI-MS kan användas för tillförlitlig karakterisering av både proteinet och metaboliten corona som förvärvats av NMs. Flytten till CESI-MS minskar kraftigt den mängd prov som krävs (jämfört med traditionell vätskekromatografi – masspektrometri (LC-MS) med flera injektioner möjliga från så lite som 5 μL prov, vilket gör det idealiskt för volymbegränsade prover. Dessutom minskas analysernas miljökonsekvenser med avseende på LC-MS på grund av de låga flödeshastigheterna (<20 nL/min) i CESI-MS och användningen av vattenhaltiga elektrolyter som eliminerar behovet av organiska lösningsmedel.
Bionanointeraktioner, i gränslandet mellan nanomaterial (NM) ytor och biologiska matriser från vilka biomolekyler adsorberar till NM, är ett intensivt forskningsområde som ligger till grund för nanosäkerhet och nanomedicin1. Detta lager av adsorberade biomolekyler ger NMs en biologisk identitet, vilket innebär att celler identifierar dem som “jag”, vilket senare påverkar cellulärt upptag, distribution och biologiska slutpunkter2,3,4. De allra flesta bionanostudier har fokuserat på proteinerna i koronan och har visat att proteinerna varierar kvantitativt och kvalitativt mellan NMs av olikasammansättningar 5. Denna variation är beroende av både nm:s egenskaper, såsom storlek, funktionalisering och material utöver egenskaperna hos den biologiska matrisen inklusive komposition och saltinnehåll5. Ett växande intresseområde för bionanogränssnittet är de metaboliter som adsorberas till NMs6. Flera studier har visat att NM-egenskaper, som med proteinerna, är en nyckelfaktor för att bestämma sammansättningen av metaboliterna i koronan och att de kan påverka biologiska resultat avNM-exponering 6,7,8.
I studier av den biomolekylära koronan finns det fyra distinkta faser till dess karakterisering, koronabildning, isoleringen av biomolekylerna i koronan, deras upptäckt via kvalitativ eller kvantitativ masspektrometri och identifiering9. Hittills har en rad tekniker antagits för att isolera proteinet corona inklusive kokning i SDS-PAGE löpande buffert, lösningsmedel och saltextraktion eller direkt matsmältning av proteiner på plats på ytan av NMs. När det gäller metaboliterna i koronan är isoleringen mer komplex med olika metoder med lösningsmedel eller till och med upplösningen av de NMs som föreslås somlösningar 8,10,11. Men till skillnad från proteinet corona är det osannolikt att en “en storlek passar alla” -metoden kommer att tillämpas på isolering av metaboliter från NMs, på grund av det breda kemiska utrymmet som upptas av metabolomen och mångfalden av möjliga NMs. Ett alternativt tillvägagångssätt är att karakterisera den biologiska matrisen före och efter NM-exponeringen med skillnaden i metabolitkoncentrationer som tillskrivs adsorptionen av metaboliter till NMs.
Detta alternativa tillvägagångssätt skulle vara tillämpligt på alla biofluider och NMs och även om det kräver dubbelt så mycket analys, erbjuder det följaktligen ett mycket mer exakt mått på metaboliten korona och har ingen risk för att låga metaboliter återhämtar sig från NM-ytan misstas för låg bindning av den specifika metaboliten.
Det andra steget i den biomolekylära coronaanalysen är upptäckten av biomolekylerna. Traditionellt för proteinerna i koronan har detta varit ett ansvarsområde för nano-LC-MS, proteomikens arbetshäst; Andra tillvägagångssätt som NMR13,1D och 2D SDS-PAGE har också tillämpats. När det gäller metaboliten koronar LC-MS7,GC-MS8 och direkt infusion massa spektrometri har använts14. Ett nytt tillvägagångssätt har dock nyligen börjat få dragkraft, nämligen kapillärelektrometri-masspektrometri (CE-MS)11,15 och har funnits i NM-laboratorier som en fristående teknik för att karakterisera olika fysiska och kemiska egenskaper hos NMs16. CE-MS är en orthogonal separationsteknik till nanoLC-MS och GC-MS och kan möjliggöra detektering av högpolära och laddade metaboliter17,18. Dessutom är CE-MS väl lämpad för analys av proteiner och deras posttranslational modifieringar såsom fosforylering och glykosylering19,20,21,22. Det sista steget, identifiering och dataanalys kan utföras på flera sätt beroende på om en kvantitativ / kvalitativ eller riktad / obelaget metod används, detta faller dock utanför detta protokolls ansvarsområde.
CESI-MS, en kombination av CE och ett nanoESI-gränssnitt, är ett nytt framsteg inom CE-teknik som använder ett mantningslöst gränssnitt. Detta möjliggör direktanslutning av ultralågflödes-CE (<20 nL/min) till en högupplöst masspektrometer utan utspädning, vilket resulterar i avsevärt förbättrad detektionskänslighet23,24,25. CESI-MS gör det möjligt att analysera volymbegränsade prover (< 10 μL) samtidigt som en mycket känslig analys26 bibehålls. CESI-MS jämför också positivt med traditionella nanoLC-MS-metoder med lågt flöde som används inom proteomik och metabolomik när det gäller reproducerbarhet27,28,genomströmning och överföring vilket gör det till en spännande utsikt för den kompletta biomolekylära coronakarakteriseringen.
För att belysa CESI-MS:s potential för analyser av bionanointeraktioner beskriver detta arbete det provpreparat som krävs för att isolera NM biomolekylär korona från ett enda humant plasmaprov på ett sådant sätt att data maximeras från både protein- och metabolitaspekterna av den fullständiga biomolekylära NM-koronan. Medan vi rapporterar om användningen av human plasma, detta protokoll skulle vara lika lämpligt för andra biofluider såsom blodserum, komplett cellkultur medium, cell lysat, ryggmärgsvätska eller urin. Analyserna av dessa två komponenter (proteiner och metaboliter) kommer sedan att beskrivas med neutralbelagda CESI-kapillärer för proteinet korona och kala smälta kiseldioxid kapillärer för både katjoniska och anjoniska metaboliter.
Detta är den första metoden som föreslås för att karakterisera den fullständiga biomolekylära koronan som innehåller proteiner och metaboliter, från samma prov, med CESI-MS. Förmågan att karakterisera både proteiner och metaboliter från samma prov kommer att avsevärt öka mängden data som samlas in från en enda experimentell exponering som möjliggör nya insikter om processen för koronanbildning och dess effekter för NMs toxicitet och effekt som nanomediciner. Dessutom är CESI-MS en idealisk plattform för att karakterisera båda klasserna av biomolekyler med bara en förändring av kapillären som krävs. Framöver kommer nya metoder som utvecklats för icke-vattenhaltiga CE att göra det möjligt att utföra lipidomics med CE-MS40, vilket innebär att det nu är möjligt att analysera proteiner, metaboliter och lipider med hjälp av en enda plattform. De nuvarande konventionella metoderna skulle kräva två dedikerade LC-MS-plattformar, en för proteinet koronan och en för metaboliten corona. Således kan detta tillvägagångssätt samla in dubbelt så mycket data med hjälp av en enda analysplattform.
Det finns vissa varningar till detta tillvägagångssätt, särskilt med metaboliten corona eftersom detta protokoll föreslår en indirekt mätning av corona. Som sådan kan problem uppstå när metabolitnivåerna finns vid höga koncentrationer i förhållande till NMs och den efterföljande minskningen av metabolitkoncentrationen i matrisen är liten. Men till skillnad från proteinet corona är det osannolikt att en “en storlek passar alla” -metoden för att isolera metaboliten koronan kommer att utvecklas på grund av att varje NM har unika ytkemier. Framöver är det mer troligt att NM-specifika metoder för att isolera metaboliten corona kommer att utvecklas och valideras. Detta kommer endast att gälla för det specifika NM. Trots detta kommer CESI-MS fortfarande att vara en mycket lämplig plattform för karakterisering av de polära laddade metaboliterna oavsett hur de isoleras. Det är också anmärkningsvärt att om en pellet inte bildas under centrifuugeringsstegen som är utformade för att pelleta NMs, kan en högre centrifugalkraft krävas. Detta är mest sannolikt att inträffa med mindre täta NMs. Det är också viktigt att alla filtreringssteg följs inom protokollet på grund av kapillärens smala borrhål, dessa kan lätt blockeras om något partiklar inte har eliminerats tillräckligt från provet.
Medan protein corona har varit ett intensivt forskningsområde under ett antal år förmågan att kombinera det med metaboliten corona är ett nytt intresseområde för forskare som undersöker bionanogränssnittet6,14. Hittills har majoriteten av dessa studier fokuserat på den icke-polära, lipidfraktionen av metaboliten corona9,28. Denna nuvarande metod möjliggör karakterisering av de mycket polära och laddade metaboliterna i koronan som inkluderar viktiga metaboliter involverade i energimetabolism, glykolys och DNA-syntes. Som ett resultat, i kombination med proteomics arbetsflöde, är en mer holistisk karakterisering av biomolekylär corona möjligt. Detta möjliggör en mer djupgående analys av bionanointeraktioner framöver. Denna metod möjliggör förbättrade mekanistiska insikter i receptormedierad endocytos via protein- och metabolitinteraktioner med membranreceptorer. Dessutom kan interaktioner mellan och intra corona mellan proteiner och små molekyler utforskas. till exempel har det nyligen visat sig att proteinerna i corona spelar en nyckelroll i rekryteringen av metaboliter15. Det är värt att notera att de representativa resultaten i figur 3 och figur 4 är absolut kvantifiering av metaboliter, men ett oföränderligt tillvägagångssätt med hjälp av multivariat dataanalys för att jämföra alla CE-MS-funktioner i kontroller jämfört med exponerad plasma skulle också klargöra metabolitbindning. Det finns således ett betydande utrymme för att undersöka hur, och vilka, metaboliter och proteiner påverkar deras respektive rekrytering till NM-koronor. Dessa ytterligare studier kan hjälpa till att utforma koronor för att optimera leveransen av nanomediciner eller avslöja ytterligare hinder för deras utveckling, såsom undertryckande av farmaceutisk verkan på grund av biomolekylär coronablockering eller maskering av inriktningsfunktioner.
CESI-MS med sina nanovågsflöden på cirka 20 nL/min och minimal användning av organiska lösningsmedel ger en förbättring av gröna och ekonomiska referenser jämfört med standard LC-MS och nanoLC-MS när det gäller lösningsmedelsanvändning, de största utmaningarna för metabolomik respektive proteomikstudier. CESI-MS erbjuder mycket reproducerbara resultat för både migreringstid och toppområde som kan jämföras med LC-MS-baserademetoder 11,15. Jämfört med nanoLC-MS är överföring inte heller ett problem i CESI-MS. Därför krävs inte omfattande systemrensning mellan provanalyser, vilket avsevärt förbättrar provgenomströmningen11.
Sammanfattningsvis är det föreslagna arbetsflödet det första som beskriver ett tillvägagångssätt för att karakterisera både protein- och metabolitkomponenterna i den fullständiga biomolekylära koronan hos NMs. Detta låser upp en ny aspekt av bionanointeraktioner, metaboliten koronan, vilket möjliggör insamling av dubbelt så mycket data från samma prov, vilket möjliggör en mer fullständig förståelse av interaktioner vid bionanogränssnittet.
The authors have nothing to disclose.
A.J.C, J.A.T och I.L bekräftar finansiering från Europeiska kommissionen via Horizon 2020-projektet ACEnano (Bidrag nr. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkänner doktorsfinansiering från China Scholarship Council (CSC, nr 201507060011). R.R erkänner det ekonomiska stödet från Vidis bidragssystem från Den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO Vidi 723.0160330).
1,4-Dithiothreitol | Sigma | 10197777001 | |
2,2,4,4-D4-citric | Simga | 485438-1G | Internal standard anion |
Ammonium Acetate >98% | Sigma | A1542 | |
Ammonium Bicarbonate >99.5% | Sigma | 09830 | |
Capillary cartridge coolant | Sciex | 359976 | |
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | |
CESI Cap | Sciex | B24699 | |
CESI Vials | Sciex | B11648 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic, use in a fume hood |
Glacial Acetic acid | Sigma | A6283 | |
Hydrochloric acid 1mol/L | Sigma | 43617 | |
Iosoacetamide | Sigma | I1149 | |
L-methionine sulfone | Sigma | M0876-1G | Internal standard cation |
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) | Sigma | 14262 | Use in a fume hood |
Microvials | Sciex | 144709 | |
nanoVials | Sciex | 5043467 | |
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length | Sciex | B07368 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers |
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
Phospahte buffered saline 10x | Sigma | P7059 | |
Pierce C18 Tips, 100 µL bed | Thermo Fisher Scientific | 87784 | |
Polystyrene 100 nm | Polysciences Inc | 876 | |
Polystyrene carboxylated 100 nm | Polysciences Inc | 16688 | |
Polystyrene carboxylated 1000 nm | Polysciences Inc | 08226 | |
Rapigest SF (surfactant) | Waters | 186001860 | |
Sequencing Grade modified Trypsin | Promega | V5111 | |
SiO2 Ludox TM-40 | Sigma | 420786 | |
Sodium Hydroxide solution | Simga | 72079 | |
TiO2 Dispex coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 PVP coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 uncoated | Promethion particles | Bespoke particles |