Denne protokol viser, hvordan man billede biologiske cryo-konserverede prøver ved hjælp af kryo-struktureret belysning mikroskopi. Vi demonstrerer metoden ved at billeddanne cytoskeleton af U2OS-celler.
Tredimensionel (3D) struktureret belysningsmikroskopi (SIM) tillader billeddannelse af fluorescerende mærkede cellulære strukturer ved højere opløsning end konventionel fluorescensmikroskopi. Denne superopløsningsteknik gør det muligt at visualisere molekylære processer i hele celler og har potentiale til at blive brugt sammen med elektronmikroskopi og røntgentomografi til at korrelere strukturel og funktionel information. Et SIM-mikroskop til kryogent bevarede prøver (cryoSIM) er for nylig blevet bestilt på den korrelative kryo-imaging beamline B24 på den britiske synkrotron.
Det blev designet specielt til 3D-billeddannelse af biologiske prøver ved kryogene temperaturer på en måde, der er kompatibel med efterfølgende billeddannelse af de samme prøver ved røntgenmikroskopimetoder som kryoblød røntgentomografi. Denne videoartikel indeholder detaljerede metoder og protokoller til vellykket billeddannelse ved hjælp af cryoSIM. Ud over instruktioner om driften af cryoSIM mikroskop, anbefalinger er blevet medtaget vedrørende valg af prøver, fluorophores, og parameterindstillinger. Protokollen er demonstreret i U2OS celleprøver, hvis mitokondrier og tubulin er blevet fluorescerende mærket.
SR billeddannelse teknikker er blevet bredt tilgængelige for biologer i løbet af de sidste tiår 1. De tillader høj opløsning billeddannelse af fluorescerende mærkede prøver ud over diffraktion grænse. Det har dog været udfordrende at tilpasse SR-mikroskopimetoder til at arbejde med prøver ved kryogene temperaturer2. Dette ville være en fordel for korrelativ billeddannelse i kombination med elektron eller røntgentomografi. For nylig er SIM blevet tilpasset til brug med kryogene prøver og har med succes vist sig at muliggøre korrelative undersøgelser af biologiske celler i forbindelse med blød røntgentomografi (SXT)3 på den korrelative kryobilledstrålelinje B24 på Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM kan fordoble opløsningen af konventionel bredfeltmikroskopi ved at belyse prøven med stribede lysmønstre (Moiré frynser) i tre vinkler og i fem faser. Interferensen mellem disse lysmønstre og prøven fluorescens kan bruges til beregningsmæssigt at afdække ekstra oplysninger om sub-diffraktion strukturer4,5.
Der er flere fordele ved SIM i forhold til andre SR-teknikker til kryogene applikationer. For det første kan det fungere uden specielt designede blinkende fluorophorer; konventionelle fluorophorer kan anvendes, hvilket giver adgang til en bredere vifte af potentielle fluorescerende mærkningsmidler6. Derudover kræver det kun 15 billeder pr. z skive (i 3D; 9 billeder til 2D), mens andre SR-metoder tager ca. 1000 billeder pr. skive, hvilket øger chancen for, at prøven opvarmes og dermed øger risikoen for dannelse af iskrystal, hvilket kan forårsage genstande. Endelig kan denne teknik billede tykkere biologiske prøver på over 10 μm, så hele celler, der skal afbildes i deres nær-native state6. CryoSIM er bygget ved hjælp af standard optiske komponenter og med open-access software til billedbehandling, hvilket gør det nemt at dokumentere og duplikere, hvis det ønskes6. CryoSIM har en 100x/0.9 numerisk blænde mål (se tabellen over materialer); yderligere oplysninger om dens optiske komponenter, designparametre og ydeevne er blevet beskrevet af Phillips et al.6 Her viser denne protokol, hvordan man bruger cryoSIM-mikroskopet, herunder hvordan man indlæser og losser prøver på kryogenstadiet, hvordan man indsamler data om mikroskopet, og hvordan man rekonstruerer SIM-billederne.
3D SIM ved kryogene temperaturer har mange fordele i forhold til andre SR-billeddannelsesteknikker til billeddannelses vitrified biologisk materiale. Det kræver betydeligt færre billeder pr. z-skive sammenlignet med andre SR-metoder, hvilket resulterer i mindre bestråling og en lavere chance for iskrystaldannelse for vitrified prøver. Det er også i stand til at afbilde hele celler og kan korreleres med røntgentomografi for at matche struktur med funktion. Interessant nok bleges de fleste kommercielt tilgængelige fluorophorer og fluorescensmærker mindre under kryogene forhold end ved stuetemperatur. Men i betragtning af det høje kvanteudbytte af de mest almindelige fluorophorer ved stuetemperatur (mere end 80% i nogle tilfælde) skyldes den absolutte gevinst, der opdages i fotoner, ikke ændringer i kvanteudbyttet, men på grund af en reduktion i de komplekse blegningsprocesser. Mere information om udbyttet af fluorophorer ved kryogene temperaturer kan findes i 8.
Det er afgørende, at prøver, der ankommer til cryoSIM, er blevet forkortet ved hjælp af et konventionelt kryofluorescencemikroskop med brightfield evne til at producere et gitter “kort”, der omfatter fremhævning af alle potentielle AOIs til yderligere billeddannelse (Figur 5). Adgangstiden på cryoSIM tildeles via en konkurrenceproces, der indebærer indsendelse af et forslag, som efterfølgende evalueres for teknikmæssig gennemførlighed og biomedicinsk virkning. Tid på udstyret er derfor altid “til en præmie”, og forudtilsluttet net giver mulighed for den mest effektive udnyttelse af en tildeling. Det er også vigtigt, at prøven holdes vitrified, navnlig under prøveoverførsel fra prøveindehaveren til billeddannelsesplatformen, for at minimere dannelsen af iskrystaller og efterfølgende prøveskader. Prøven skal være af god kvalitet til at producere de bedste SIM-billeder. En velforberedt prøve vil være karakteriseret ved følgende funktioner: (a) det vil ikke have nogen iskrystal forurening, (b) det anvendte gitter vil være en finder gitter, (c) luftfartsselskabet vil være flad, (d) gitternet og substrat overflade vil ikke være auto-fluorescerende, og (e) der vil ikke være nogen pauser i støttemembranen. Disse forudsætninger kan opnås ved omhyggelig prøvehåndtering og sikre, at prøverne altid forbliver vitrified.
Det er vigtigt på forhånd at kontrollere, om foreslåede prøveflufluoriorter vil give tilstrækkeligt signal i kryoSIM-mikroskopet. Værktøjer som SPEKCheck9 kan hjælpe med at vælge de optimale fluorophore og filterkombinationer. Hvis der er problemer med den rå dataindsamling eller genopbygningsprocessen, kan genstande vises på billederne efter rekonstruktionen. Eksempler på forskellige genstande er dokumenteret af Demmerle et al.10 Billedrekonstruktionsparametrene kan gennemgås i SoftWoRx-logfilen, hvis rekonstruktionen ikke er optimal ved at åbne rekonstruktionsoversigtsfilen. Der bør være konsekvent linjeafstand på tværs af vinkler i en given kanal og relativt konsekvent amplitud. Variation på mere end 30 % og værdier, der ligger betydeligt over 1 (hvis der anvendes kompensation for perlestørrelse) bør undersøges nærmere og vil sandsynligvis indikere mislykkede rekonstruktioner. Derudover kan SIMcheck2-softwaren i Fiji også bruges til at udføre forskellige kontroller af de rå og rekonstruerede data for at diagnosticere årsagen til fejl i billed- eller rekonstruktionsparameterindstillingerne. SIM-check og dets gradueringskontrastkort kan også hjælpe med at vurdere kvaliteten af rekonstruerede data ved at fortolke, hvilke områder af et billede der sandsynligvis vil være reelle strukturer versus artefakter.
Lav graduering kontrast (vist ved mørk farve, i figur 5E) inden for det nukleare område betyder, at denne region vil være mere modtagelige for genopbygning artefakter, derfor indebærer, at hash mønstre vist i kernen kunne klassificeres (Figur 5D) som en artefakt. Stærke fluorescens signalområder er mere tilbøjelige til præcist at afspejle indfødte strukturer i de behandlede data. I områder med svagt signal, hvor fluorophorer er fordelt over bredere områder, såsom den samlede overflade af en vesikel, er det sandsynligt, at der er et reelt signal side om side med behandling af artefakter, og der bør udvises forsigtighed ved fortolkningen af disse data. Efter inspektion af hele spektret rekonstruerede data for at sikre, at der ikke er nogen mærkelige artefakter, og at baggrunden er generelt Gaussian og centreret nær nul, er dataene generelt klippet på nul, eller den modale værdi-toppen af baggrunden signal-bør være meget tæt på nul. Dette sikrer, at det viste billedes dynamiske område ikke domineres af negative baggrundsartefakter. Når der forventes et svagere signal, bør der udvises ekstra omhu i at analysere funktionerne og sikre, at de er reelle strukturer snarere end genopbygningsgenstande.
Der er nogle begrænsninger i billedbehandlingssystemet. Da prøvestadiet er fladt, er prøver med variabel tykkelse eller gitre, der ikke er flade, ikke ideelle emner til billeddannelse. Derudover, hvis korrelativ billeddannelse vil ske ved hjælp af blød X-ray tomografi, celler i nærheden af gitter grænser bør ikke afbildes, da disse ikke vil være synlige i X-ray mikroskop under tilt serien erhvervelse. Endelig har mængden af blotting af prøven før frysning af dyk en betydelig indvirkning på billedkvaliteten. for lidt blotting resulterer i prøver, der er for tykke, hvilket giver suboptimale SIM-billeder med høj baggrundsstøj, mens for meget blotting kan forårsage celler til at blive misformet og derfor mere modtagelige for varmeskader fra hændelsen laserstråle. Sammenfattende er cryoSIM et kraftfuldt fluorescensmikroskopiværktøj til billeddannelse af biologiske prøver i 3D i et næsten indfødt stadium og har vidtrækkende applikationer på mange områder.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har modtaget støtte fra Europa-Kommissionens Horizon 2020 iNEXT-Discovery-projekt. Jeg .M. Dobbie anerkender finansiering fra Wellcome Trust (107457 / Z / 15 / Z). Dette arbejde blev udført med støtte fra Diamond Light Source, instrument B24 (forslag BI25512). Vores tak til personalet hos Micron og alle vores fremragende brugere og samarbejdspartnere for at hjælpe os med at etablere cryoSIM og dets korrelative potentiale.
Auto grids | FEI | ||
Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |