Summary
Questo protocollo dimostra come immaginare campioni biologici crio-conservati utilizzando la microscopia a illuminazione criostrutto. Dimostriamo la metodologia mediante l'imaging del citoscheletro delle cellule U2OS.
Abstract
La microscopia a illuminazione strutturata tridimensionale (3D) (SIM) consente l'imaging di strutture cellulari marcate fluorescenti a una risoluzione più elevata rispetto alla microscopia a fluorescenza convenzionale. Questa tecnica di super-risoluzione (SR) consente la visualizzazione di processi molecolari in intere cellule e ha il potenziale per essere utilizzata in combinazione con la microscopia elettronica e la tomografia a raggi X per correlare informazioni strutturali e funzionali. Un microscopio SIM per campioni criogenicamente conservati (cryoSIM) è stato recentemente commissionato presso la correlativa cryo-imaging beamline B24 presso il sincrotrone del Regno Unito.
È stato progettato specificamente per l'imaging 3D di campioni biologici a temperature criogeniche in modo compatibile con la successiva imaging degli stessi campioni con metodi di microscopia a raggi X come la tomografia a raggi X crio-molli. Questo articolo video fornisce metodi e protocolli dettagliati per l'imaging di successo utilizzando la crioSIM. Oltre alle istruzioni sul funzionamento del microscopio crioSIM, sono state incluse raccomandazioni per quanto riguarda la scelta di campioni, fluorofori e impostazioni dei parametri. Il protocollo è dimostrato in campioni di cellule U2OS i cui mitocondri e tubulina sono stati marcati in modo fluorescente.
Introduction
Le tecniche di imaging SR sono diventate ampiamente accessibili ai biologi nell'ultimo decennio1. Consentono l'imaging ad alta risoluzione di campioni marcati in modo fluorescente oltre il limite di diffrazione. Tuttavia, è stato difficile adattare i metodi di microscopia SR per lavorare con campioni a temperature criogeniche2. Ciò sarebbe vantaggioso per l'imaging correlativo in combinazione con la tomografia elettronica o a raggi X. Recentemente, la SIM è stata adattata per l'uso con campioni criogenici e ha dimostrato con successo di consentire studi correlativi di cellule biologiche in combinazione con la tomografia a raggi X molli (SXT)3 presso la beamline di crio-imaging correlativa B24 presso il Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). Sim può raddoppiare la risoluzione della microscopia convenzionale a campo largo illuminando il campione con motivi di luce a strisce (frange Moiré) a tre angoli e in cinque fasi. L'interferenza tra questi modelli di luce e la fluorescenza del campione può essere utilizzata per scoprire computazionalmente informazioni extra sulle strutture di sotto-diffrazione4,5.
Ci sono diversi vantaggi della SIM rispetto ad altre tecniche SR per applicazioni criogeniche. In primo luogo, può funzionare senza fluorofori lampeggianti appositamente progettati; i fluorofori convenzionali possono essere utilizzati, dando accesso a una gamma più ampia di potenziali agenti di marcatura fluorescenti6. Inoltre, richiede solo 15 immagini per fetta z (in 3D; 9 immagini per 2D), mentre altri metodi SR richiedono circa 1000 immagini per fetta, aumentando la possibilità che il campione venga riscaldato e quindi aumentando il rischio di formazione di cristalli di ghiaccio, che possono causare artefatti. Infine, questa tecnica può immaginare campioni biologici più spessi di oltre 10 μm, consentendo di imageare intere cellule nel loro stato quasi nativo6. La crioSIM è stata costruita utilizzando componenti ottici standard e con software ad accesso aperto per l'imaging, rendendo facile documentare e duplicare se lo si desidera6. Il cryoSIM ha un obiettivo di apertura numerica 100x/0.9 (vedi tabella dei materiali); ulteriori informazioni sui suoi componenti ottici, parametri di progettazione e prestazioni sono state descritte da Phillips et al.6 Qui, questo protocollo dimostra come utilizzare il microscopio crioSIM, incluso come caricare e scaricare campioni sullo stadio criogenico, come raccogliere dati sul microscopio e come ricostruire le immagini SIM.
Protocol
NOTA: Questo protocollo riguarda campioni contenenti cellule coltivate o depositate su griglie d'oro piatto da 3 mm al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un film di supporto al carbonio bucato che sono state vetrificate mediante congelamento a immersione o congelamento ad alta pressione. Questo protocollo presuppone che i campioni siano già stati ripresi utilizzando un microscopio convenzionale a epifluorescenza e a campo luminoso per mappare le posizioni di interesse per l'imaging in crioSIM. Vedere la Figura 1 per una panoramica dell'intero protocollo.
1. Preparazione della fase crio-
- Preparare l'azoto liquido senza ghiaccio (LN2) facendo passare LN2 attraverso un imbuto rivestito con qualsiasi salvietta di carta secca scientifica standard.
NOTA: Poiché LN2 provoca ustioni, indossare dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti e occhiali crioprotettivi, durante la manipolazione. Tali liquidi possono spostare l'ossigeno e causare un rapido soffocamento e devono essere maneggiati in un'area adeguatamente ventilata. - Rimuovere la polvere superficiale dal criostadio con aria pressurizzata. Espellere il liquido dal contenitore dell'aria pressurizzata prima di utilizzarlo.
- Assicurarsi che la cartuccia di caricamento del campione sia in posizione con il portase campioni a camera appropriato (verificare che non sia rimasta alcuna griglia nel portase campioni di un esperimento precedente) (Figura 2).
- Rimuovere il coperchio dal dewar esterno dello stadio crio e versare LN2 filtrato fino a circa 1/4del pieno. Attendere che l'ebollizione iniziale si plachi prima di versarne di più; riempire la nave a circa 2/3° pieno. Sostituire accuratamente il coperchio, puntando l'ugello lontano dal conduttore e dallo stadio/ottica mentre LN2 bolle fuori dall'uscita.
- Una volta che LN2 ha smesso di uscire dall'uscita, posizionare il tubo di uscita sopra il dewar del palco sul criostadio.
- Collegare la fonte di alimentazione del palco e collegare il cavo USB al criostadio. Assicurarsi che il coperchio della camera del campione riscaldato sia collegato. Collega il dewar esterno al palco.
NOTA: non collegare il dewar esterno fino a quando il tubo di uscita non è stato posizionato sopra il dewar dello stadio sul criostadio. Se LN2 trabocca (o per evitare che trabocchi), estrarre il cavo USB per ~ 10 s, consentirgli di equilibrarsi e ricollegare il cavo USB per riattivare il sensore. - Dopo che LN2 è stato consegnato nello stadio dewar, premere il pulsante di rilascio sullo stadio crio per consentire a LN2 di entrare nella camera del campione.
NOTA: non lasciare il sistema incustodito mentre LN2 sta riempiendo la camera. - Attendere ~ 30-45 minuti per consentire al sistema di raffreddarsi e stabilizzarsi prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine. Controllare periodicamente il dewar esterno e ricaricare con LN2 filtrato se è pieno meno di un quarto (circa ogni ora).
2. Trasferimento della scatola di stoccaggio del campione nella fase crio-crio
NOTA: Immergere la scatola di stoccaggio del campione, il supporto e le punte di qualsiasi strumento (ad esempio, pinna) all'interno di LN 2 filtrato per raffreddarli prima ditoccare qualsiasi superficie fredda come il campione o qualsiasi oggetto all'interno della camera del campione. Indossare un cappotto da laboratorio e guanti quando si maneggiano campioni biologici.
- Assicurarsi che i campioni vetrificati siano in un contenitore criocompatibile e portarli al microscopio. Premere il pulsante corrispondente sul criostadio per accendere la luce nella camera del campione.
- Utilizzare la chiave esadecimale sullo strumento cassetta per aprire le due piastre della cassetta di trasferimento del campione. Aprire le piastre abbastanza larghe da cadere nella griglia tra le due piastre, ma evitare di aprirsi nella posizione massima aperta per evitare che la griglia cada attraverso l'altro lato.
- Utilizzare una pinza lunga per sollevare la scatola della griglia del campione dalla LN2, girarla dove la tacca si allinea con la posizione della posizione di stoccaggio all'interno del palco e posizionarla sul palco. Utilizzare il dispositivo appropriato (ad esempio, un cacciavite) per aprire il coperchio della scatola di stoccaggio nella posizione corretta del campione.
- Utilizzando una pinna invertita (o qualsiasi pinna chirurgica a punta fine), rimuovere la griglia TEM dal porta campioni, immergerla all'interno della LN2e lasciarla cadere in posizione nella cassetta di trasferimento del campione, mantenendosi vicino alla LN2 durante il processo di trasferimento. Assicurarsi che il lato del film di carbonio sia posizionato in modo che alla fine sia rivolto verso l'obiettivo sul ponte campione.
- Chiudere la cartuccia campione utilizzando il tasto esadecimale sullo strumento cassetta. Chiudere e rimuovere la scatola di stoccaggio insieme a tutti i campioni rimanenti.
- Utilizzare il punto magnetico sullo strumento cassetta per sollevare e montare la cartuccia contenente la griglia sul ponte campione. Tenerlo immerso/vicino alla LN2 durante il processo di trasferimento. Assicurarsi che l'orientamento sia appropriato per il ponte (i due magneti verranno a contatto con i magneti sul ponte). Posizionare la cassetta piatta all'interno dei perni di posizionamento del ponte e spingere delicatamente per assicurarsi che sia fissa.
NOTA: Una cassetta campione per griglie ritagliate che sono state preparate per la successiva fresatura a fascio iogonale focalizzato è disponibile anche presso lo stabilimento CryoSIM presso la beamline B24.
3. Aggancio e messa a fuoco dello stadio
- Spostare il coperchio del criostadio aprendosi nella posizione di imaging e spegnere la luce della camera del campione. Far scorrere il palco verso l'ottica per allinearlo sotto la lente dell'obiettivo. Far cadere delicatamente l'obiettivo in posizione utilizzando la leva, assicurandosi che riposi all'interno del coperchio del criostadio, ma non lo tocchi.
NOTA: Assicurarsi che il tubo di uscita esterno di Dewar non tocchi il dewar dello stadio sul crio-stadio in nessun punto durante la raccolta dei dati. - Coprire il palcoscenico e l'ottica con una tenda nera opaca. Avviare il software di controllo Cockpit sul PC cryoSIM (Figura 3 e Figura 4).
- Fare clic sul pulsante della modalità di lettura per ogni telecamera e impostarlo su CONV 3 MHz. Verificare che la temperatura di ciascuna telecamera sia -80 °C e che la ventola della fotocamera sia spenta.
- Accendere la fotocamera riflessa. Sotto Luci, scegli ambiente (esposizione 20 ms), e sotto linkam, fai clic su condensatore. Fare clic sul pulsante Modalità video.
- Nella finestra Visualizzazione mosaico, eseguire lo zoom indietro (scorrimento del mouse) per visualizzare il contorno della griglia. Fare clic su Trova fase se non può essere visto. Centrare la griglia facendo doppio clic con il pulsante sinistro del mouse al centro del cerchio.
- Focalizzare il campione fino a quando la pellicola di supporto della griglia (o qualsiasi altra caratteristica di campionamento pertinente) è a fuoco, utilizzando i tasti su e giù per spostare il criostadio su e giù e utilizzando i tasti 9 e 3 sul tastierino numerico per modificare il passo z (impostarlo su 20 μm per la messa a fuoco iniziale).
NOTA: se l'utente esaurisce la corsa in z, il palco può essere spostato manualmente verso l'alto o verso il basso utilizzando la ruota sotto lo stadio crio. Ruotalo di una tacca alla volta e controlla se il campione rientra nell'intervallo di visualizzazione. Modificare nuovamente la direzione se la messa a fuoco peggiora.
4. Acquisizione del mosaico Brightfield
- Una volta centrato il palco, disattiva la modalità videoe raccogli un mosaico a luce visibile (fai clic su Esegui mosaico nella vista Mosaico per produrre tessere di immagini in luce visibile che si disgregano a spirale verso l'esterno dal centro). Se la griglia è piegata, prova diverse posizioni sulla griglia (doppio clic sinistro all'interno della vista Mosaico),rimode quantoidati e fai di nuovo clic su Esegui mosaico per raccogliere mosaici parziali. In alternativa, inserire un'immagine focalizzata sulla parte superiore del mosaico (Figura 3).
- Salva la vista cliccando su Salva mosaico. Assegnagli un nome file breve contenente informazioni sulla casella di archiviazione e il rispettivo numero di griglia (un timestamp verrà aggiunto automaticamente al nome del file).
5. Individuazione delle aree di interesse
- Ispeziona il mosaico a campo luminoso insieme a qualsiasi precedente immagine "mappa" di fluorescenza per dove sono state precedentemente localizzate cellule o caratteristiche biologiche di interesse. Controlla se quelle aree producono una fluorescenza adeguata.
- Spegnere la luce ambientale e il condensatore, nonché la modalità video, se attiva. Accendere il laser di eccitazione richiesto (405, 488, 561 o 647) e scegliere la fotocamera e il filtrocorrispondenti, inizialmente a 50 mW, per un tempo di esposizione di 50 ms.
NOTA: aumentare/diminuire le impostazioni della fotocamera e del filtro in base al segnale di fluorescenza. - Premere 0 per scattare un'immagine e * per il contrasto automatico. In alternativa, regola manualmente il contrasto utilizzando il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dell'immagine.
NOTA: Accendere il segno Laser on per la stanza. - Una volta trovate cellule biologicamente interessanti con fluorescenza adatta, contrassegnare le loro posizioni utilizzando il pulsante Segna sito nella vista Mosaico.
NOTA: questi siti contrassegnati appariranno nell'elenco allegato e sono accessibili facendo doppio clic sulle coordinate. Quando torni a un sito contrassegnato, ingrandisci l'area prima di fare doppio clic. - Continua a contrassegnare tutti i potenziali siti prima di iniziare l'acquisizione delle immagini. Ri-salvare il mosaico con i siti contrassegnati; clicca su Salva siti su file.
- Per cucire insieme le immagini del mosaico utilizzando il software StitchM (sviluppato internamente alla beamline B24), trascinare e rilasciare il file di mosaico .txt nel file StitchM con estensione .bat e salvare l'immagine tiff combinata delle tessere di mosaico nella stessa cartella. Per salvare un'immagine con i siti contrassegnati, trascinare e rilasciare contemporaneamente il file mosaico.txt e il file .txt marcatori nell'icona.
NOTA: bilanciare la raccolta dei dati con le esigenze del progetto (ad esempio, se verrà eseguita l'imaging correlativo, verificare quante immagini possono essere scattate con la modalità di imaging del partner e scegliere il numero appropriato di siti per l'imaging crioSIM). Inoltre, se il dewar esterno richiede il riempimento con LN2 , il sistema criostadio cambierà posizione e i siti contrassegnati probabilmente non torneranno nelle stesse posizioni; quindi considera questo quando scegli il numero di siti da immaginare.
- Per cucire insieme le immagini del mosaico utilizzando il software StitchM (sviluppato internamente alla beamline B24), trascinare e rilasciare il file di mosaico .txt nel file StitchM con estensione .bat e salvare l'immagine tiff combinata delle tessere di mosaico nella stessa cartella. Per salvare un'immagine con i siti contrassegnati, trascinare e rilasciare contemporaneamente il file mosaico.txt e il file .txt marcatori nell'icona.
- Spegnere la luce ambientale e il condensatore, nonché la modalità video, se attiva. Accendere il laser di eccitazione richiesto (405, 488, 561 o 647) e scegliere la fotocamera e il filtrocorrispondenti, inizialmente a 50 mW, per un tempo di esposizione di 50 ms.
6. Strategia di raccolta dei dati
- Impostare il tempo di esposizione laser in base ai conteggi nella gamma dinamica nell'immagine a fluorescenza (nella parte inferiore della finestra di ripresa della fotocamera). Scegli quale filtro applicare e ottimizza queste impostazioni per ogni lunghezza d'onda della luce di eccitazione da utilizzare, accendendo ciascun laser separatamente.
NOTA: sebbene 10.000-20.000 conteggi siano ottimali, i conteggi inferiori sono accettabili se c'è un buon contrasto. Idealmente, controllare le impostazioni del filtro prima che ogni pila di immagini venga acquisita perché le celle in aree diverse della griglia potrebbero avere livelli di fluorescenza variabili.
7. Raccolta dei dati
- Fare clic su entrambe le fotocamere per accenderle. Tornare a uno dei siti contrassegnati e concentrarsi nuovamente sulla profondità desiderata. Una volta a fuoco in un'area di interesse, spostati verso l'alto (tasto ↑ ) nella finestra XY nella fase macro per scegliere l'altezza dello stack z da acquisire e fai clic su Salva in alto. Spostati fuori fuoco verso il basso (↓ tasto), clicca su Salva in basso e poi su Vai al centro,e controlla che l'immagine sia ancora a fuoco.
NOTA: l'altezza del campione verrà visualizzata nella finestra. - Fare clic con il pulsante destro del mouse su slm (modulatore della luce spaziale) nella finestra Cockpit e assicurarsi che l'angolo sia impostato su 0,41. Nella finestra Cockpit, seleziona Esperimento a sito singolo.
NOTA: non fare clic su slm on; Cockpit lo accenderà automaticamente durante l'acquisizione delle immagini.- Dall'elenco a discesa, selezionare Illuminazione strutturata. Modificate l'altezza della pila in modo che sia uguale all'altezza z + 1 μm.
NOTA: L'aggiunta di 1 μm garantisce la cattura dell'intero campione in z e riduce al minimo i manufatti di ricostruzione. - Immettere i tempi di esposizione (ms) per i laser a 405 nm e 488 nm nella riga superiore (per la fotocamera riflessa) e i tempi di esposizione per i laser a 561 nm e 647 nm nella riga inferiore (per la fotocamera trasmessa).
NOTA: i valori per il tempo di esposizione devono corrispondere ai valori decisi in precedenza e mostrati nella finestra principale del Cockpit. - Immettere un nome di file (convenzione di denominazione: box number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescenza) o BF (campo luminoso) a seconda del tipo di imaging in corso). Fare clic su Aggiorna per produrre un nuovo file contenente la data e l'ora senza sovrascrivere i file precedenti. Quindi, fai clic su Start.
- Dall'elenco a discesa, selezionare Illuminazione strutturata. Modificate l'altezza della pila in modo che sia uguale all'altezza z + 1 μm.
- Controllare la visualizzazione Fotocamera durante la raccolta dei dati. Riprendere le immagini se c'è uno spostamento xy. Se il dewar LN2 ricarica il criostadio durante l'acquisizione dell'immagine, interrompere il processo facendo clic sul pulsante Abort nel software Cockpit.
- Una volta che il dewar esterno ha finito di riempire lo stage dewar, ripeti l'esperimento perché la ricarica sposta il campione verticalmente. Rimettere a fuoco l'immagine per centrarla nuovamente in z e ripetere l'esperimento a sito singolo. Ripeti l'esperimento a sito singolo per tutte le combinazioni di laser e filtri necessari.
NOTA: ci vogliono circa 30 s-1 min per completare la ricarica. Durante l'imaging di una griglia, il riempimento avverrà ~ 4-8x.
- Una volta che il dewar esterno ha finito di riempire lo stage dewar, ripeti l'esperimento perché la ricarica sposta il campione verticalmente. Rimettere a fuoco l'immagine per centrarla nuovamente in z e ripetere l'esperimento a sito singolo. Ripeti l'esperimento a sito singolo per tutte le combinazioni di laser e filtri necessari.
- In ogni posizione, raccogli una pila z usando la luce visibile.
- Spegnere i laser e accendere la luce ambientale e il condensatore. In Esperimentoa sito singolo , selezionare Z-stack, impostare la luce ambientale su 20 ms di esposizione e mantenere l'altezza z come sopra.
- Ripetere i passaggi da 7.2 a 7.4 per tutti i siti contrassegnati sulla griglia.
- Prima di passare a un altro campione, eliminare il mosaico facendo clic su Elimina tessere.
- Disegna un quadrato attorno a tutte le tessere per eliminarle. Elimina anche i marcatori selezionandoli tutti nell'elenco e quindi facendo clic su Elimina siti selezionati.
- Spegnere la luce ambientale e il condensatore prima di procedere alla modifica della griglia. Seguire i passaggi nella sezione 4 in ordine inverso per sganciare la fase da sotto l'obiettivo e modificare la griglia.
8. Dopo l'imaging
- Al termine dell'imaging, sganciare lo stadio e rimuovere tutti i campioni. Spegnere la spia della camera campione. Scollegare il dewar esterno e decantare l'LN2 rimanente in un altro contenitore criocompatibili, consentendo al dewar di tornare in sicurezza a una temperatura normale.
- Metti il tappo del coperchio sul criostadio. Attendere fino a quando l'opzione per cuocere il display crio-stadio diventa disponibile dopo che non rimane più LN2 nel dewar dello stadio. Premere il pulsante bake-out per accedere alla modalità di riscaldamento e rimuovere l'umidità dallo stadio crio per evitare la formazione di ghiaccio.
9. Ricostruzione
- Trasferire i file di dati SIM grezzi alla workstation appropriata per la ricostruzione. Esegui l'elaborazione in batch attraverso la finestra del generatore di attività di elaborazione utilizzando le funzioni di trasferimento ottico specifiche del canale (OTFS) (calcolate dalle funzioni di diffusione del punto di perline multifluorescenza) e gli angoli K0 (0,29278, -1,8028, 2,3786) con un filtro Wiener costante per tutti i canali di 0,004 e un offset di polarizzazione di 200.
- Nel pannello Opzioni aggiuntive, assicuratevi che le intensità negative vengano eliminate mantenendo deselezionate altre opzioni. Salvare le immagini SIR in una cartella denominata "elaborata".
NOTA: il software di ricostruzione SIM commerciale di solito produce dati SIM ricostruiti e conserva il nome del file, ma aggiunge SIR.dv alla fine. Viene inoltre creato un file di registro che contiene il protocollo di elaborazione, i passaggi e le informazioni statistiche sul successo della ricostruzione.
10. Correzione cromatica del cambiamento
- Scarica il software Chromagnon7 per correggere il cambio cromatico.
- Utilizzare la matrice di riferimento dello spostamento cromatico che corrisponde alle lunghezze d'onda di fluorescenza dei dati raccolti (forniti dalla beamline).
NOTA: Il file di riferimento è un file 'chromagnon.csv', che contiene i parametri di allineamento ed è stato ottenuto da immagini di calibrazione utilizzando nanoparticelle multi-fluorescenti. Può essere utilizzato per elaborare in batch più set di dati contemporaneamente.- Scegliete il file di riferimento appropriato che corrisponda alla lunghezza d'onda del laser e al filtro utilizzato per l'imaging del campione e aggiungetelo al campo di riferimento. Aggiungere i dati SIR ricostruiti da allineare nel campo di origine e fare clic su Esegui.
- Verificare che il segnale di fluorescenza sia ora allineato nelle immagini. Per l'elaborazione batch, posizionare tutte le immagini SIR da allineare nel campo di origine e il file di riferimento nel campo di riferimento, quindi premere Esegui tutto.
Representative Results
Un campione contenente cellule U2OS è stato colorato con una miscela di colorante citoscheletrico a microtubuli verdi e colorante mitocondriale rosso, con conseguente colorazione della componente microtubulica del citoscheletro (verde) e dei mitocondri (rosso). L'imaging successivo ha mostrato la localizzazione dei mitocondri all'interno della cellula e la disposizione dei microtubuli, evidenziando la struttura strutturale che forniscono alla cellula e l'assemblaggio del citoscheletro attorno agli organelli come il nucleo. La risoluzione in crioSIM è significativamente superiore a quella della microscopia a epifluorescenza standard (Figura 5). La Figura 6 mostra come la "mappa" fluorescente di un microscopio a epifluorescenza convenzionale può essere utilizzata per individuare le aree di interesse per l'imaging e la corrispondente immagine ricostruita crioSIM da una posizione sulla griglia.
Figura 1: Diagramma di flusso che mostra le fasi del protocollo di imaging crioSIM. Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lo stadio crio. (A) La configurazione criostadio. (B) Una griglia di esempio mostrata tenuta da pinzò invertita. (C) Componenti dello stadio crio. Le porte di connessione sono etichettate, con i colori corrispondenti all'arancione: alimentazione, giallo: coperchio del palco riscaldato, blu: dewar esterno, verde: connessione al PC. Abbreviazioni: PC = personal computer; LN2 = azoto liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Viste dei pannelli software Cockpit. (A) Pannello principale, (B) macro stadio XY, (C) vista mosaico, (D) viste telecamera. Abbreviazione: SLM = modulatore di luce spaziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Viste dei pannelli software Cockpit. (A) Z stack single site experiment. (B) Si esperimento a sito singolo. (C) Scorciatoie da tastiera per il software cockpit utilizzato durante l'acquisizione delle immagini. (D) Il microscopio cryoSIM è in loco alla beamline B24 presso il sincrotrone Diamond Light Source. Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risoluzione di cryoSIM. (A) Vista a mosaico di una griglia in esame. (B) Immagine Brightfield di un'area di interesse (AOI). (C) Immagine pseudo-widefield rispetto alla sua immagine SIM (D) che mostra l'aumento della risoluzione. La freccia bianca indica gli artefatti di ricostruzione sim. (E) Mappa di contrasto di modulazione che combina le informazioni sull'intensità dei pixel dell'immagine ricostruita con le informazioni sul colore dei rispettivi valori del rapporto contrasto-rumore di modulazione (MCNR) dei dati grezzi generati da SIMCheck2. Le regioni chiare e scure mostrano rispettivamente un contrasto alto e basso. Barra della scala = 10 μm. Impostazioni di imaging CryoSIM: lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: 488/525 nm, potenza laser 50 mW, tempo di esposizione 50 ms e 647/655 nm, potenza laser 20 mW, tempo di esposizione 5 ms. Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Ricostruzione dell'immagine in crioSIM da una posizione sulla griglia in una mappa di fluorescenza da una mappa di epifluorescenza convenzionale. (A, B) Sovrapposizione di mappe di immagini a campo luminoso e fluorescenza generate con un microscopio a epifluorescenza convenzionale. Questa mappa viene utilizzata per individuare le regioni di interesse da successivamente image in cryoSIM. (C) L'immagine crioSIM ricostruita ottenuta nel luogo mostrato in (B). Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
La SIM 3D a temperature criogeniche presenta molti vantaggi rispetto ad altre tecniche di imaging SR per l'imaging di materiale biologico vetrificato. Richiede un numero significativamente inferiore di immagini per fetta z rispetto ad altri metodi SR, con conseguente minore irradiazione e una minore possibilità di formazione di cristalli di ghiaccio per campioni vetrificati. È anche in grado di visualizzare intere cellule e può essere correlato con la tomografia a raggi X per abbinare la struttura con la funzione. È interessante notare che la maggior parte dei fluorofori e dei tag di fluorescenza disponibili in commercio sbiancano meno in condizioni criogeniche che a temperatura ambiente. Tuttavia, data l'elevata resa quantistica dei fluorofori più comuni a temperatura ambiente (oltre l'80% in alcuni casi), il guadagno assoluto rilevato nei fotoni non è dovuto a cambiamenti nella resa quantistica, ma a causa di una riduzione dei complessi processi di sbiancamento. Maggiori informazioni sulla resa dei fluorofori a temperature criogeniche sono disponibili in 8.
È fondamentale che i campioni che arrivano alla crioSIM siano stati premappati utilizzando un microscopio a criofluorescenza convenzionale con capacità di campo luminoso per produrre una "mappa" a griglia che includa l'evidenziazione di tutti i potenziali AOI per ulteriori immagini (Figura 5). Il tempo di accesso alla crioSIM viene assegnato attraverso un processo competitivo che prevede la presentazione di una proposta, che viene successivamente valutata per la fattibilità tecnica e l'impatto biomedico. Il tempo all'attrezzatura, quindi, è sempre "a pagamento", e le griglie premappate consentono l'uso più efficiente di un'allocazione. È inoltre essenziale che il campione sia mantenuto vetrificato, specialmente durante il trasferimento del campione dal portasecchi alla piattaforma di imaging, per ridurre al minimo la formazione di cristalli di ghiaccio e il conseguente danno al campione. Il campione dovrebbe essere di buona qualità per produrre le migliori immagini SIM. Un campione ben preparato sarà caratterizzato dalle seguenti caratteristiche: (a) non avrà contaminazione da cristalli di ghiaccio, (b) la griglia utilizzata sarà una griglia di ricerca, (c) il supporto sarà piatto, (d) la rete della griglia e la superficie del substrato non saranno auto-fluorescenti e (e) non ci saranno rotture nella membrana di supporto. Questi prerequisiti possono essere raggiunti con un'attenta gestione dei campioni e assicurando che i campioni rimangano sempre vetrificati.
È importante verificare in anticipo se i fluorofori campione proposti forniranno un segnale sufficiente nel microscopio crioSIM. Strumenti come SPEKCheck9 possono aiutare a scegliere le combinazioni ottimali di fluoroforo e filtro. Se ci sono problemi con la raccolta dei dati grezzi o il processo di ricostruzione, gli artefatti possono apparire nelle immagini dopo la ricostruzione. Esempi di vari artefatti sono stati documentati da Demmerle et al.10 I parametri di ricostruzione dell'immagine possono essere rivisti nel file di registro SoftWoRx se la ricostruzione non è ottimale aprendo il file di riepilogo della ricostruzione. Ci dovrebbe essere un'interlinea coerente tra gli angoli in un dato canale e un'ampiezza relativamente coerente. Variazioni superiori al 30% e valori significativamente superiori a 1 (se viene applicata la compensazione delle dimensioni del perle) dovrebbero essere studiati più da vicino e probabilmente indichere ricostruzioni non riuscite. Inoltre, il software SIMcheck2 nelle Figi può essere utilizzato anche per eseguire vari controlli sui dati grezzi e ricostruiti per diagnosticare la causa di errori nelle impostazioni dei parametri di imaging o ricostruzione. Sim-check e la sua mappa di contrasto di modulazione possono anche aiutare nella valutazione della qualità dei dati ricostruiti interpretando quali aree di un'immagine sono suscettibili di essere strutture reali rispetto agli artefatti.
Il basso contrasto di modulazione (mostrato dal colore scuro, nella Figura 5E)all'interno dell'area nucleare significa che questa regione sarà più suscettibile agli artefatti di ricostruzione, implicando quindi che i modelli di hash mostrati nel nucleo potrebbero essere classificati(Figura 5D)come artefatto. Le aree del segnale di fluorescenza forte hanno maggiori probabilità di riflettere accuratamente le strutture native nei dati elaborati. Nelle aree di segnale debole in cui i fluorofori sono distribuiti su aree più ampie, come la superficie totale di una vescicola, è probabile che il segnale reale coesista con artefatti di elaborazione e si dovrebbe prestare attenzione nell'interpretazione di tali dati. Dopo l'ispezione dei dati ricostruiti a gamma completa per garantire che non ci siano strani artefatti e che lo sfondo sia generalmente gaussiano e centrato vicino allo zero, i dati vengono generalmente ritagliati a zero, o il valore modale - il picco del segnale di sfondo - dovrebbe essere molto vicino allo zero. Ciò garantisce che la gamma dinamica dell'immagine visualizzata non sia dominata da artefatti di sfondo negativi. Quando ci si aspetta un segnale più debole, è necessario prestare particolare attenzione nell'analizzare le caratteristiche e assicurarsi che siano strutture reali piuttosto che artefatti di ricostruzione.
Esistono alcune limitazioni del sistema di imaging. Poiché lo stadio del campione è piatto, i campioni con spessore variabile o griglie non piatte non sono soggetti ideali per l'imaging. Inoltre, se l'imaging correlativo verrà eseguito utilizzando la tomografia a raggi X molli, le cellule vicino ai confini della griglia non dovrebbero essere riprese in quanto non saranno visibili nel microscopio a raggi X durante l'acquisizione della serie di inclinazione. Infine, la quantità di blotting del campione prima del congelamento a immersione ha un impatto significativo sulla qualità dell'immagine; troppo poco blotting si traduce in campioni troppo spessi, dando immagini SIM non ottimali con un rumore di fondo elevato, mentre un ingoiatura troppo può causare il misshaped delle cellule e quindi più suscettibili ai danni da calore del raggio laser incidente. In sintesi, cryoSIM è un potente strumento di microscopia a fluorescenza per l'imaging di campioni biologici in 3D in una fase quasi nativa e ha applicazioni ad ampio raggio in molte aree.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal progetto Horizon 2020 iNEXT-Discovery della Commissione Europea. I.M. Dobbie riconosce il finanziamento del Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Questo lavoro è stato svolto con il supporto della Diamond Light Source, strumento B24 (proposta BI25512). I nostri ringraziamenti allo staff di Micron e a tutti i nostri eccellenti utenti e collaboratori per averci aiutato a stabilire la crioSIM e il suo potenziale correlativo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto grids | FEI | ||
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
| BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
| Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
| cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
| Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
| cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
| Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
| Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
| Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
| SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
| StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
| TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |
References
- Schermelleh, L., et al.
- Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Kounatidis, I., et al. 3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182 (2), 515-530 (2020).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H.
- Phillips, M. A., et al. CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging. Optica. 7 (7), 802 (2020).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8, 7583 (2018).
- Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).
- Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource. Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
