Denne protokollen demonstrerer hvordan man kan avbilde biologiske kryokonserverte prøver ved hjelp av kryostrukturert belysningsmikroskopi. Vi demonstrerer metodikken ved å avbilde cytoskjelettet til U2OS-celler.
Tredimensjonal (3D) strukturert belysningsmikroskopi (SIM) gjør det mulig å avbilde fluorescerende merkede cellulære strukturer med høyere oppløsning enn konvensjonell fluorescensmikroskopi. Denne superoppløsningsteknikken (SR) muliggjør visualisering av molekylære prosesser i hele celler og har potensial til å bli brukt sammen med elektronmikroskopi og røntgentomografi for å korrelere strukturell og funksjonell informasjon. Et SIM-mikroskop for kryogenisk bevarte prøver (cryoSIM) har nylig blitt bestilt på den korrelative kryoavbildningsstrålelinjen B24 ved den britiske synkrotronen.
Den ble designet spesielt for 3D-avbildning av biologiske prøver ved kryogeniske temperaturer på en måte som er kompatibel med etterfølgende avbildning av de samme prøvene ved røntgenmikroskopimetoder som kryomyk røntgentomografi. Denne videoartikkelen inneholder detaljerte metoder og protokoller for vellykket avbildning ved hjelp av cryoSIM. I tillegg til instruksjoner om driften av cryoSIM-mikroskopet, er det inkludert anbefalinger om valg av prøver, fluoroforer og parameterinnstillinger. Protokollen er demonstrert i U2OS celleprøver hvis mitokondrier og tubulin har blitt fluorescerende merket.
SR-avbildningsteknikker har blitt allment tilgjengelige for biologer det siste tiåret1. De tillater høyoppløselig avbildning av fluorescerende merkede prøver utover diffraksjonsgrensen. Det har imidlertid vært utfordrende å tilpasse SR-mikroskopimetoder for å jobbe med prøver ved kryogeniske temperaturer2. Dette vil være fordelaktig for korrelativ avbildning i kombinasjon med elektron- eller røntgentomografi. Nylig har SIM blitt tilpasset for bruk med kryogenprøver og har vist seg å muliggjøre korrelative studier av biologiske celler i forbindelse med myk røntgentomografi (SXT)3 ved den korrelative kryoavbildningsstrålelinjen B24 ved Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM kan doble oppløsningen til konvensjonell bredfeltmikroskopi ved å belyse prøven med stripete lysmønstre (Moiré-frynser) i tre vinkler og i fem faser. Interferensen mellom disse lysmønstrene og prøvefluorescensen kan brukes til å avdekke ekstra informasjon om underdiffraksjonsstrukturer4,5.
Det er flere fordeler med SIM i forhold til andre SR-teknikker for kryogene applikasjoner. For det første kan det fungere uten spesialdesignede blinkende fluoroforer; konvensjonelle fluoroforer kan brukes, noe som gir tilgang til et bredere spekter av potensielle fluorescerende merkingsmidler6. I tillegg krever det bare 15 bilder per z-stykke (i 3D; 9 bilder for 2D), mens andre SR-metoder tar omtrent 1000 bilder per stykke, noe som øker sjansen for at prøven blir oppvarmet og dermed øker risikoen for iskrystalldannelse, noe som kan forårsake gjenstander. Til slutt kan denne teknikken bilde tykkere biologiske prøver på over 10 μm, slik at hele celler kan avbildes i sin nesten innfødte tilstand6. CryoSIM er bygget ved hjelp av standard optiske komponenter og med programvare for åpen tilgang for avbildning, noe som gjør det enkelt å dokumentere og duplisere om ønskelig6. CryoSIM har et 100x /0,9 numerisk blenderåpningsmål (se materialtabellen); ytterligere informasjon om dens optiske komponenter, designparametere og ytelse har blitt beskrevet av Phillips et al.6 Her demonstrerer denne protokollen hvordan du bruker cryoSIM-mikroskopet, inkludert hvordan du laster inn og fjerner prøver på det kryogene stadiet, hvordan du samler inn data på mikroskopet, og hvordan du rekonstruerer SIM-bildene.
3D SIM ved kryogeniske temperaturer har mange fordeler i forhold til andre SR-avbildningsteknikker for avbildning av vitrifisert biologisk materiale. Det krever betydelig færre bilder per z-skive sammenlignet med andre SR-metoder, noe som resulterer i mindre bestråling og lavere sjanse for iskrystalldannelse for vitrifiserte prøver. Det er også i stand til å avbilde hele celler og kan korreleres med røntgentomografi for å matche struktur med funksjon. Interessant nok bleker de fleste kommersielt tilgjengelige fluoroforer og fluorescenskoder mindre under kryogene forhold enn ved romtemperatur. Men gitt det høye kvanteutbyttet av de vanligste fluoroforene ved romtemperatur (mer enn 80% i noen tilfeller), skyldes den absolutte gevinsten som oppdages i fotoner ikke endringer i kvanteutbyttet, men på grunn av en reduksjon i de komplekse blekingsprosessene. Mer informasjon om utbyttet av fluoroforer ved kryogeniske temperaturer finnes i 8.
Det er viktig at prøver som ankommer cryoSIM, er forhåndstilordnes ved hjelp av et konvensjonelt kryofluorescensmikroskop med brightfield-evne til å produsere et rutenett “kart” som inkluderer utheving av alle potensielle AOIer for videre avbildning (figur 5). Tilgangstid på cryoSIM tildeles via en konkurransedyktig prosess som innebærer innlevering av et forslag, som senere evalueres for teknikk gjennomførbarhet og biomedisinsk innvirkning. Tid på utstyret er derfor alltid “på en premie”, og forhåndstilordnede rutenett tillater mest effektiv bruk av en tildeling. Det er også viktig at prøven holdes vitrified, spesielt under prøveoverføring fra prøveholderen til bildeplattformen, for å minimere dannelsen av iskrystaller og påfølgende prøveskader. Prøven bør være av god kvalitet for å produsere de beste SIM-bildene. En godt forberedt prøve vil bli preget av følgende egenskaper: (a) den vil ikke ha iskrystallforurensning, (b) rutenettet som brukes vil være et finnergitter, (c) bæreren vil være flat, (d) rutenettet og substratoverflaten vil ikke være auto-fluorescerende, og (e) det vil ikke være noen brudd i støttemembranen. Disse forutsetningene kan oppnås ved nøye prøvehåndtering og sikre at prøvene alltid forblir vitrifisert.
Det er viktig å sjekke på forhånd om foreslåtte prøvefluoreforer vil gi nok signal i cryoSIM-mikroskopet. Verktøy som SPEKCheck9 kan hjelpe deg med å velge optimal fluorofor og filterkombinasjoner. Hvis det er problemer med rå datainnsamlingen eller rekonstruksjonsprosessen, kan gjenstander vises i bildene etter rekonstruksjon. Eksempler på ulike gjenstander er dokumentert av Demmerle et al.10 Bilderekonstruksjonsparametrene kan gjennomgås i SoftWoRx-loggfilen hvis rekonstruksjonen ikke er optimal ved å åpne sammendragsfilen for rekonstruksjon. Det bør være konsekvent linjeavstand på tvers av vinkler i en gitt kanal og relativt konsistent amplitude. Variasjon av mer enn 30% og verdier betydelig over 1 (hvis perlestørrelse kompensasjon brukes) bør undersøkes nærmere og vil sannsynligvis indikere mislykkede rekonstruksjoner. I tillegg kan SIMcheck2-programvaren i Fiji også brukes til å utføre ulike kontroller av rå og rekonstruerte data for å diagnostisere årsaken til feil i innstillingene for bildebehandling eller rekonstruksjonsparameter. SIM-kontroll og dets modulasjonskontrastkart kan også hjelpe til med å vurdere kvaliteten på rekonstruerte data ved å tolke hvilke områder av et bilde som sannsynligvis vil være reelle strukturer kontra gjenstander.
Lav modulasjonskontrast (vist med mørk farge, i figur 5E) innenfor atomområdet betyr at denne regionen kommer til å være mer utsatt for rekonstruksjonsartefakter, noe som innebærer at hashmønstrene som vises i kjernen, kan klassifiseres (Figur 5D) som en gjenstand. Sterke fluorescenssignalområder er mer sannsynlig å nøyaktig reflektere innfødte strukturer i de bearbeidede dataene. I områder med svakt signal der fluoroforer er fordelt over bredere områder, for eksempel den totale overflaten av en vesicle, er det sannsynlig at reelt signal sameksisterer med behandling av gjenstander, og det bør tas hensyn til tolkningen av disse dataene. Etter inspeksjon av rekonstruerte data i hele spekteret for å sikre at det ikke er noen merkelige artefakter, og at bakgrunnen generelt er gaussisk og sentrert nær null, blir dataene vanligvis kuttet til null, eller den modale verdien – toppen av bakgrunnssignalet – bør være svært nær null. Dette sikrer at det dynamiske området i bildet som vises, ikke domineres av negative bakgrunnsartefakter. Når et svakere signal forventes, bør det tas ekstra hensyn til å analysere funksjonene og sikre at de er reelle strukturer i stedet for rekonstruksjonsgjenstander.
Det er noen begrensninger i bildesystemet. Fordi prøvestadiet er flatt, er ikke prøver med variabel tykkelse eller rutenett som ikke er flate, ideelle motiver for avbildning. I tillegg, hvis korrelativ avbildning vil bli gjort ved hjelp av myk røntgentomografi, bør celler nær rutenettgrenser ikke avbildes, da disse ikke vil være synlige i røntgenmikroskopet under oppkjøp av tilt-serien. Til slutt har mengden blotting av prøven før dypfrysing en betydelig innvirkning på bildekvaliteten; for lite blotting resulterer i prøver som er for tykke, noe som gir suboptimale SIM-bilder med høy bakgrunnsstøy, mens for mye blotting kan føre til at celler blir feilformet og derfor mer utsatt for varmeskader fra hendelsen laserstråle. Oppsummert er cryoSIM et kraftig fluorescensmikroskopiverktøy for avbildning av biologiske prøver i 3D i et nesten innfødt stadium og har omfattende applikasjoner på mange områder.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har fått støtte fra EU-kommisjonens Horisont 2020 iNEXT-Discovery-prosjekt. Jeg .M. Dobbie erkjenner finansiering fra Wellcome Trust (107457 / Z / 15 / Z). Dette arbeidet ble utført med støtte fra Diamond Light Source, instrument B24 (forslag BI25512). Vår takk til de ansatte hos Micron og alle våre utmerkede brukere og samarbeidspartnere for å hjelpe oss med å etablere cryoSIM og dets korrelative potensial.
Auto grids | FEI | ||
Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |