该协议演示了如何使用低温结构照明显微镜对生物低温保存样品进行成像。我们通过成像 U2OS 细胞的细胞骨骼来演示该方法。
三维 (3D) 结构照明显微镜 (SIM) 允许以高于传统荧光显微镜的高分辨率成像荧光标记的细胞结构。这种超分辨率 (SR) 技术能够可视化整个细胞中的分子过程,并有可能与电子显微镜和 X 射线断层扫描相结合,将结构和功能信息关联在一起。英国同步加速器的相关低温成像光束线B24最近委托了一台用于低温保存样品(cryoSIM)的SIM显微镜。
它专为低温下生物样本的3D成像而设计,其方式与随后通过X射线显微镜(如低温X射线断层扫描)对相同样本的成像相容。本视频文章提供了使用低温SIM成功成像的详细方法和协议。除了关于低温SIM显微镜操作的说明外,还就样品的选择、荧光和参数设置提出了建议。该协议在U2OS细胞样本中得到证明,这些细胞样本的线粒体和管蛋白被荧光标记。
在过去的十年里,SR成像技术已经为生物学家们广泛所接受。它们允许对荧光标记的样品进行高分辨率成像,使其超过衍射极限。然而,在低温温度2下调整SR显微镜方法与样品配合工作是一项艰巨的工作。这将有利于与电子或X射线断层扫描相结合的相关成像。最近,SIM已适应低温样品的使用,并已成功证明能够结合软X射线断层扫描(SXT)3在钻石光源同步加速器(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html)的相关低温成像光束线B24对生物细胞进行相关研究。SIM 可以通过在三个角度和五个阶段用条纹光模式(Moiré 边缘)照亮样品,使传统广域显微镜的分辨率翻倍。这些光模式和样品荧光之间的干扰可以用来计算发现关于亚衍射结构4,5的额外信息。
与其他低温应用 SR 技术相比,SIM 有几个优点。首先,它可以工作,没有专门设计的闪烁荧光:传统的荧光剂可以使用,使访问更广泛的潜在的荧光标记剂6。此外,它只需要每 z 切片 15 张图像(3D 中;2D 中 9 张图像),而其他 SR 方法每片需要大约 1000 张图像,从而增加样品被加热的机会,从而增加冰晶形成的风险,从而导致人工制品。最后,这项技术可以成像超过10μm的更厚的生物样本,使整个细胞在其近原生状态6成像。低温SIM是使用标准光学元件和开放访问软件构建的成像,因此,如果需要,可以轻松记录和复制。低温SIM具有100x/0.9数值孔径目标(参见 材料表):Phillips 等人介绍了有关其光学元件、设计参数和性能的进一步信息。 在此,本协议演示了如何使用低温SIM显微镜,包括如何在低温舞台上装载和卸载样品、如何收集显微镜上的数据以及如何重建 SIM 图像。
低温下的 3D SIM 比其他 SR 成像技术在成像化生物材料方面有许多优势。与其他 SR 方法相比,它要求每 z 切片的图像显著减少,因此对受病毒化样品的辐照更少,形成冰晶的几率也更低。它还能够对整个细胞进行成像,并且可以与 X 射线断层扫描相关联,使结构与功能相匹配。有趣的是,大多数市售的荧光和荧光标签在低温条件下漂白的比在室温下少。然而,鉴于大多数常见氟在室温下的量子产量高(在某些情况下超过80%),光子中检测到的绝对增益不是由于量子产量的变化,而是由于复杂漂白过程的减少。有关低温下氟的产量的更多信息,可在 8月份找到。
至关重要的是,到达低温SIM的样品已经使用传统的低温发光显微镜进行了预制,具有亮场能力,以生成一个网格”地图”,其中包括突出显示所有潜在的OOIs进行进一步成像(图5)。冷冻SIM的进入时间通过一个涉及提交提案的竞争性流程分配,随后对该提案的技术可行性和生物医学影响进行评估。因此,设备上的时间总是”高得无比”,预制网格允许最有效地使用分配。样品也必须保持病毒化,特别是在样品从样品持有人转移到成像平台期间,以尽量减少冰晶的形成和随后的样品损害。样品的质量应该很好,以产生最好的SIM图像。准备充分的样品将具有以下特征:(a) 它将没有冰晶污染,(b) 使用的网格将是一个查找器网格,(c) 载体将是平的,(d) 网格网格和基板表面不会是自动荧光的,(e) 支撑膜不会断裂。这些先决条件可以通过仔细的样品处理和确保样品始终保持病毒化来实现。
提前检查提议的氟氟样品是否会在低温显微镜中发出足够的信号,这一点很重要。诸如SPEKCheck9 这样的工具可以帮助选择最佳的荧光和滤光片组合。如果原始数据收集或重建过程出现问题,重建后图像中可能会出现人工制品。Demmerle 等人记录了各种文物的示例10 如果重建不是最佳,可以通过打开重建摘要文件在 SoftWoRx 日志文件中查看图像重建参数。在给定通道中,应有一致的跨角度线间距和相对一致的振幅。应更密切地调查超过 30% 和显著高于 1 值(如果应用珠子大小补偿)的变异,并可能表示重建失败。此外,斐济的SIMCheck2 软件还可用于对原始和重建数据进行各种检查,以诊断成像或重建参数设置中错误的原因。SIM 检查及其调制对比图还可以通过解释图像的哪些区域可能是真实结构与人工制品,从而有助于评估重建数据的质量。
核区内低调制对比度(图 5E以深色显示)意味着该区域将更容易受到重建文物的影响,因此意味着核中显示的哈希图案可以归类为人工制品(图5D)。强荧光信号区更有可能在处理数据中准确反映本地结构。在荧光素分布在较广区域(如囊泡总表面)的弱信号区域,真正的信号很可能与处理人工制品并存,在解释该数据时应小心谨慎。在检查了全方位的重建数据以确保没有奇怪的文物,并且背景一般是高斯和中心接近零,数据一般被剪辑为零,或模式值 – 背景信号的峰值 – 应该非常接近零。这可确保显示图像的动态范围不被负面背景文物所支配。当预期信号较弱时,应格外小心地分析这些特征,并确保它们是真正的结构,而不是重建文物。
成像系统存在一些局限性。由于样品阶段是平的,因此厚度可变或网格不平的样品不是理想的成像对象。此外,如果使用软 X 射线断层扫描进行相关成像,则不应对网格边界附近的细胞进行成像,因为在倾斜系列采集期间,这些细胞在 X 射线显微镜中是看不到的。最后,在暴跌冻结前样品的印迹量对成像质量有显著影响:太少的印迹会导致样品太厚,给低背景噪音的次优 SIM 图像,而太多的印迹会导致细胞出现错误,因此更容易受到事件激光束的热损伤。总之,CryoSIM 是一种强大的荧光显微镜工具,用于在近本地阶段对 3D 生物样本进行成像,并在许多领域具有广泛的应用。
The authors have nothing to disclose.
该项目已获得欧盟委员会地平线2020 iNEXT-发现项目的资金。一.M多比承认来自韦康信托基金(107457/Z/15/Z)的资金。这项工作是在钻石光源B24仪器(建议BI25512)的支持下进行的。我们感谢美光的员工以及我们所有优秀的用户和合作者帮助我们建立低温SIM及其相关潜力。
Auto grids | FEI | ||
Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |