Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie biologische kryokonservierte Proben mit kryostrukturierter Beleuchtungsmikroskopie abgebildet werden können. Wir demonstrieren die Methodik, indem wir das Zytoskelett von U2OS-Zellen abbilden.
Abstract
Die dreidimensionale (3D) Structured Illumination Microscopy (SIM) ermöglicht die Abbildung fluoreszierend markierter Zellstrukturen mit höherer Auflösung als die herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie. Diese superauflösende (SR) Technik ermöglicht die Visualisierung molekularer Prozesse in ganzen Zellen und hat das Potenzial, in Verbindung mit Elektronenmikroskopie und Röntgentomographie verwendet zu werden, um strukturelle und funktionelle Informationen zu korrelieren. Ein SIM-Mikroskop für kryogen konservierte Proben (CryoSIM) wurde kürzlich an der korrelativen Kryo-Imaging-Beamline B24 am britischen Synchrotron in Betrieb genommen.
Es wurde speziell für die 3D-Bildgebung biologischer Proben bei kryogenen Temperaturen entwickelt, die mit der nachfolgenden Bildgebung derselben Proben durch Röntgenmikroskopiemethoden wie der kryoweichen Röntgentomographie kompatibel ist. Dieser Videoartikel bietet detaillierte Methoden und Protokolle für eine erfolgreiche Bildgebung mit der KryoSIM. Neben Anweisungen zur Bedienung des KryoSIM-Mikroskops wurden Empfehlungen zur Auswahl von Proben, Fluorophoren und Parametereinstellungen aufgenommen. Das Protokoll wird in U2OS-Zellproben nachgewiesen, deren Mitochondrien und Tubulin fluoreszierend markiert wurden.
Introduction
SR-Bildgebungstechniken sind in den letzten zehn Jahren für Biologen allgemein zugänglich geworden1. Sie ermöglichen eine hochauflösende Bildgebung von fluoreszierend markierten Proben jenseits der Beugungsgrenze. Es war jedoch eine Herausforderung, SR-Mikroskopiemethoden anzupassen, um mit Proben bei kryogenen Temperaturen zu arbeiten2. Dies wäre vorteilhaft für die korrelative Bildgebung in Kombination mit Elektronen- oder Röntgentomographie. Vor kurzem wurde SIM für den Einsatz mit kryogenen Proben angepasst und es wurde erfolgreich gezeigt, dass es korrelative Studien biologischer Zellen in Verbindung mit der weichen Röntgentomographie (SXT)3 an der korrelativen Kryo-Imaging-Beamline B24 an der Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html) ermöglicht. SIM kann die Auflösung der herkömmlichen Weitfeldmikroskopie verdoppeln, indem die Probe mit gestreiften Lichtmustern (Moiré-Fransen) in drei Winkeln und in fünf Phasen beleuchtet wird. Die Interferenz zwischen diesen Lichtmustern und der Probenfluoreszenz kann genutzt werden, um rechnerisch zusätzliche Informationen über Subbeugungsstrukturenaufzudecken 4,5.
Es gibt mehrere Vorteile von SIM gegenüber anderen SR-Techniken für kryogene Anwendungen. Erstens kann es ohne speziell entwickelte blinkende Fluorophore arbeiten; Konventionelle Fluorophore können verwendet werden, wodurch Zugang zu einer breiteren Palette potenzieller fluoreszierender Markierungsmittelerhalten wird 6. Darüber hinaus werden nur 15 Bilder pro Z-Slice (in 3D; 9 Bilder für 2D) benötigt, während andere SR-Methoden etwa 1000 Bilder pro Slice aufnehmen, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Probe erhitzt wird und somit das Risiko der Eiskristallbildung erhöht, die Artefakte verursachen kann. Schließlich kann diese Technik dickere biologische Proben von über 10 μm abbilden, so dass ganze Zellen in ihrem nahezu nativen Zustand abgebildet werden können6. Die KryoSIM wurde mit optischen Standardkomponenten und mit Open-Access-Software für die Bildgebung gebaut, so dass sie auf Wunsch einfach dokumentiert und dupliziert werdenkann 6. Die KryoSIM hat ein 100x/0,9 numerisches Aperturobjektiv (siehe Materialtabelle); Weitere Informationen zu seinen optischen Komponenten, Designparametern und Leistung wurden von Phillips et al.6 beschrieben Hier zeigt dieses Protokoll, wie das KryoSIM-Mikroskop verwendet wird, einschließlich des Ladens und Entladens von Proben auf der kryogenen Stufe, der Erfassung von Daten am Mikroskop und der Rekonstruktion der SIM-Bilder.
Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll bezieht sich auf Proben, die Zellen enthalten, die auf Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 3 mm flachen Goldgittern mit einer löchrigen Kohlenstoffträgerfolie gezüchtet oder abgeschieden wurden, die durch Tauchgefrieren oder Hochdruckgefrieren verglast wurden. Dieses Protokoll geht davon aus, dass Proben bereits mit einem herkömmlichen Epifluoreszenz- und Hellfeldmikroskop abgebildet wurden, um Orte zu kartieren, die für die Bildgebung in KryoSIM von Interesse sind. Eine Übersicht über das gesamte Protokoll finden Sie in Abbildung 1.
1. Vorbereitung der Kryophase
- Bereiten Sie eisfreien flüssigen Stickstoff (LN2)vor, indem Sie LN2 durch einen Trichter führen, der mit standarden wissenschaftlichen Trockenpapiertüchern ausgekleidet ist.
HINWEIS: Da LN 2 Verbrennungen verursacht, tragen Sie beim Umgang mit LN2 geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Kryoschutzhandschuhen und Schutzbrillen. Solche Flüssigkeiten können Sauerstoff verdrängen und schnelles Ersticken verursachen und sollten in einem ordnungsgemäß belüfteten Bereich gehandhabt werden. - Entfernen Sie Oberflächenstaub aus der Kryostufe mit Druckluft. Spülen Sie Flüssigkeit aus dem Druckluftbehälter aus, bevor Sie ihn verwenden.
- Stellen Sie sicher, dass die Probenbeschickungskartusche mit dem entsprechenden Kammerprobenhalter an Ort und Stelle ist (überprüfen Sie, ob im Probenhalter aus einem früheren Versuch kein Gitter mehr vorhanden ist) (Abbildung 2).
- Entfernen Sie den Deckel aus dem äußeren Dewar der Kryostufe und gießen Sie gefiltertes LN2, bis es etwa 1/4 vollist. Warten Sie, bis das anfängliche Kochen nachlässt, bevor Sie mehr gießen; Füllen Sie das Gefäß bis ca. 2/3voll. Ersetzen Sie den Deckel vorsichtig und richten Sie die Düse vom Handler und der Bühne/Optik weg, während LN2 aus dem Auslass herauskocht.
- Sobald LN2 nicht mehr aus dem Auslass kommt, legen Sie das Auslassrohr über die Bühne Dewar auf die Kryo-Bühne.
- Schließen Sie die Stromquelle der Bühne an und schließen Sie das USB-Kabel an die Kryostufe an. Stellen Sie sicher, dass der Deckel der beheizten Probenkammer eingesteckt ist. Stecken Sie den externen Dewar in die Bühne.
HINWEIS: Schließen Sie den externen Dewar erst an, wenn das Auslassrohr über dem Stage Dewar auf der Kryostufe positioniert wurde. Wenn LN2 überläuft (oder um ein Überlaufen zu verhindern), ziehen Sie das USB-Kabel für ~ 10 s heraus, lassen Sie es ausgleichen und schließen Sie das USB-Kabel wieder an, um den Sensor wieder zu aktivieren. - Nachdem LN2 in die Stufe Dewar geliefert wurde, drücken Sie den Auslöseknopf auf der Kryostufe, damit LN2 in die Probenkammer gelangen kann.
HINWEIS: Lassen Sie das System nicht unbeaufsichtigt, während LN2 die Kammer füllt. - Warten Sie ~30-45 Minuten, damit das System abkühlen und stabilisieren kann, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen. Überprüfen Sie regelmäßig den externen Dewar und beladen Sie ihn mit gefilterten LN2, wenn er weniger als ein Viertel voll ist (ungefähr jede Stunde).
2. Übergabe der Probenaufbewahrungsbox in die Kryostufe
HINWEIS: Tauchen Sie die Probenaufbewahrungsbox, den Halter und die Spitzen aller Instrumente (z. B. Zinnen) in das gefilterte LN2 ein, um sie zu kühlen, bevor Sie kalte Oberflächen wie die Probe oder Objekte in der Probenkammer berühren. Tragen Sie einen Laborkittel und Handschuhe, wenn Sie mit biologischen Proben umgehen.
- Stellen Sie sicher, dass sich die verglasten Proben in einem kryokompatiblen Behälter befinden, und bringen Sie sie zum Mikroskop. Drücken Sie die entsprechende Taste auf der Kryobühne, um das Licht in der Probenkammer einzuschalten.
- Verwenden Sie die Sechskanttaste am Kassettenwerkzeug, um die beiden Platten der Probentransferkassette zu öffnen. Öffnen Sie die Platten weit genug, um das Gitter zwischen den beiden Platten fallen zu lassen, aber vermeiden Sie es, sich in die maximal offene Position zu öffnen, um zu verhindern, dass das Gitter durch die andere Seite fällt.
- Verwenden Sie eine lange Zette, um die Probengitterbox aus dem LN2zu heben, drehen Sie sie an der Stelle, an der sich die Notbe an der Position der Speicherposition innerhalb der Bühne ausrichtet, und legen Sie sie auf die Bühne. Verwenden Sie das entsprechende Gerät (z. B. einen Schraubendreher), um den Deckel der Aufbewahrungsbox in die richtige Probenposition zu öffnen.
- Entfernen Sie mit einer invertierten Stoßzette (oder einer chirurgischen Feinspitzenzette) das TEM-Gitter aus dem Probenhalter, tauchen Sie es in die LN2ein und lassen Sie es in der Probentransferkassette in Position, wobei Sie während des Transfervorgangs nahe am LN2 bleiben. Stellen Sie sicher, dass die Kohlenstofffilmseite so platziert ist, dass sie letztendlich dem Objektiv auf der Probenbrücke zugewandt ist.
- Schließen Sie die Probenkassette mit der Sechskanttaste am Kassettenwerkzeug. Schließen und entfernen Sie die Aufbewahrungsbox zusammen mit den verbleibenden Proben.
- Verwenden Sie den Magnetpunkt am Kassettenwerkzeug, um die Patrone mit dem Gitter auf der Probenbrücke anzuheben und zu montieren. Halten Sie es während des Übertragungsvorgangs eingetaucht / nahe am LN2. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung für die Brücke geeignet ist (die beiden Magnete nehmen Kontakt mit den Magneten auf der Brücke auf). Legen Sie die Kassette flach in die Positionierungsstifte der Brücke und stupsen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sie fixiert ist.
HINWEIS: Eine Musterkassette für abgeschnittene Gitter, die für das anschließende fokussierte Ionenstrahlfräsen vorbereitet wurden, ist auch in der CryoSIM-Anlage an der beamline B24 erhältlich.
3. Stage Docking und Fokussierung
- Bewegen Sie die Öffnung des Kryo-Deckels in die Bildposition und schalten Sie das Probenkammerlicht aus. Schieben Sie die Bühne in Richtung Der Optik, um sie unter der Objektivlinse auszurichten. Lassen Sie das Objektiv vorsichtig mit dem Hebel in Position und stellen Sie sicher, dass es im Deckel der Kryostufe ruht, es aber nicht berührt.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das externe Dewar-Auslassrohr während der Datenerfassung zu keinem Zeitpunkt die Stage-Dewar auf der Kryostufe berührt. - Bedecken Sie die Bühne und die Optik mit einem undurchsichtigen schwarzen Vorhang. Starten Sie die Steuerungssoftware Cockpit auf dem kryoSIM-PC (Bild 3 und Abbildung 4).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche für den Auslesemodus für jede Kamera und stellen Sie sie auf CONV 3 MHzein. Überprüfen Sie, ob die Temperatur jeder Kamera -80 °C beträgt und der Kameralüfter ausgeschaltet ist.
- Schalten Sie die reflektierte Kamera ein. Wählen Sie unter Lichterdie Option Ambient (Belichtung 20 ms) und klicken Sie unter linkamauf Kondensator. Klicken Sie auf die Schaltfläche Videomodus.
- Verkleinern Sie im Mosaikansichtsfenster (Mausbildlauf), um die Rasterkontur anzuzeigen. Klicken Sie auf Bühne suchen, wenn sie nicht zu sehen ist. Zentrieren Sie das Raster, indem Sie mit der linken Maustaste in die Mitte des Kreises doppelklicken.
- Fokussieren Sie die Probe, bis der Gitterträgerfilm (oder ein anderes relevantes Probenmerkmal) im Fokus ist, indem Sie die Kehr- und Abwärtstasten verwenden, um die Kryostufe nach oben und unten zu bewegen, und die Tasten 9 und 3 auf dem numerischen Pad verwenden, um den Z-Schritt zu ändern (stellen Sie ihn für die erste Fokussierung auf 20 μm ein).
HINWEIS: Wenn dem Benutzer die Fahrt in z ausgeht, kann die Bühne manuell mit dem Rad unter der Kryostufe nach oben oder unten bewegt werden. Drehen Sie es um eine Stufe nach dem anderen und überprüfen Sie, ob sich die Probe im Sichtbereich befindet. Ändern Sie die Richtung erneut, wenn sich die Fokussierung verschlechtert.
4. Erwerb von Hellfeldmosaik
- Sobald die Bühne zentriert ist, deaktivieren Sie den Videomodusund sammeln Sie ein Mosaik mit sichtbarem Licht (klicken Sie in der Mosaikansicht auf Mosaik ausführen, um Kacheln mit Bildern mit sichtbarem Licht zu erzeugen, die sich von der Mitte nach außen spiralförmig drehen). Wenn das Raster gebogen ist, versuchen Sie es mit verschiedenen Positionen auf dem Raster (Doppelklick mit der linken Maustaste in der Mosaikansicht),fokussieren Sie erneut und klicken Sie erneut auf Mosaik ausführen, um Teilmosaike zu sammeln. Alternativ können Sie ein fokussiertes Bild über dem Mosaik ablegen (Abbildung 3).
- Speichern Sie die Ansicht, indem Sie auf Mosaik speichernklicken. Geben Sie ihm einen kurzen Dateinamen mit Informationen zur Speicherbox und der entsprechenden Rasternummer (ein Zeitstempel wird automatisch an den Dateinamen angehängt).
5. Identifizierung von Interessensgebieten
6. Datenerhebungsstrategie
- Stellen Sie die Laserbelichtungszeit basierend auf den Zählungen im Dynamikbereich im Fluoreszenzbild ein (am unteren Rand des Kameraansichtsfensters). Wählen Sie den anzuwendenden Filter aus und optimieren Sie diese Einstellungen für jede Wellenlänge des zu verwendenden Anregungslichts, indem Sie jeden Laser separat einschalten.
HINWEIS: Obwohl 10.000-20.000 Zählungen optimal sind, sind niedrigere Zählungen akzeptabel, wenn ein guter Kontrast vorhanden ist. Überprüfen Sie idealerweise die Filtereinstellungen, bevor jeder Bildstapel erfasst wird, da Zellen an verschiedenen Bereichen des Gitters variable Fluoreszenzwerte aufweisen können.
7. Datenerhebung
- Klicken Sie auf beide Kameras, um sie einzuschalten. Kehren Sie zu einer der markierten Stellen zurück und konzentrieren Sie sich wieder auf die gewünschte Tiefe. Sobald Sie sich in einem Interessenbereich im Fokus befinden, bewegen Sie sich im XY-Fenster in der Makrostufe nach oben(↑-Taste), um die Höhe des zu erfassenden Z-Stapels auszuwählen, und klicken Sie auf Oben speichern. Bewegen Sie sich nach unten ( ↓-Taste), klicken Sie unten auf Speichern und dann auf Zur Mitte gehen, und überprüfen Sie, ob das Bild noch im Fokus ist.
HINWEIS: Die Probenhöhe wird im Fenster angezeigt. - Klicken Sie im Cockpit-Fenster mit der rechten Maustaste auf slm (Spatial Light Modulator) und stellen Sie sicher, dass der Winkel auf 0,41 eingestellt ist. Wählen Sie im Fenster Cockpit die Option Einzelstandortexperimentaus.
HINWEIS: Klicken Sie nicht auf slm on; Cockpit schaltet es während der Bildaufnahme automatisch ein.- Wählen Sie in der Dropdown-Liste Strukturierte Beleuchtungaus. Ändern Sie die Stapelhöhe so, dass sie der z-Höhe + 1 μm entspricht.
HINWEIS: Die Zugabe von 1 μm gewährleistet die Erfassung der gesamten Probe in z und minimiert Rekonstruktionsartefakte. - Geben Sie die Belichtungszeiten (ms) für die 405 nm und 488 nm Laser in der oberen Reihe (für die reflektierte Kamera) und die Belichtungszeiten für die 561 nm und 647 nm Laser in der unteren Reihe (für die übertragene Kamera) ein.
HINWEIS: Die Werte für die Belichtungszeit sollten mit den zuvor festgelegten werten übereinstimmen, die im Cockpit-Hauptfenster angezeigt werden. - Geben Sie einen Dateinamen ein (Namenskonvention: Feld number_grid area_filters_FL) (FL (Fluoreszenz) oder BF (Hellfeld), je nachdem, welche Art der Bildgebung durchgeführt wird). Klicken Sie auf Aktualisieren, um eine neue Datei mit Datum und Uhrzeit zu erstellen, ohne vorherige Dateien zu überschreiben. Klicken Sie dann auf Start.
- Wählen Sie in der Dropdown-Liste Strukturierte Beleuchtungaus. Ändern Sie die Stapelhöhe so, dass sie der z-Höhe + 1 μm entspricht.
- Überprüfen Sie die Kameraansicht, während Daten gesammelt werden. Nehmen Sie die Bilder erneut auf, wenn eine xy-Verschiebung vorliegt. Füllt der LN2 dewar während der Bildaufnahme die Kryostufe wieder auf, bricht der Vorgang ab, indem Sie in der Cockpit-Software auf die Schaltfläche Abbrechen klicken.
- Sobald der externe Dewar das Nachfüllen der Stage Dewar beendet hat, wiederholen Sie das Experiment, da das Refill die Probe vertikal verdrängt. Fokussieren Sie das Bild neu, um es in z neu zu zentrieren, und wiederholen Sie das Einzelstandortexperiment. Wiederholen Sie das Einzelstandortexperiment für alle erforderlichen Kombinationen von Lasern und Filtern.
HINWEIS: Es dauert ungefähr 30 s-1 min, um das Nachfüllen abzuschließen. Während der Bildgebung eines Gitters erfolgt das Nachfüllen ~ 4-8x.
- Sobald der externe Dewar das Nachfüllen der Stage Dewar beendet hat, wiederholen Sie das Experiment, da das Refill die Probe vertikal verdrängt. Fokussieren Sie das Bild neu, um es in z neu zu zentrieren, und wiederholen Sie das Einzelstandortexperiment. Wiederholen Sie das Einzelstandortexperiment für alle erforderlichen Kombinationen von Lasern und Filtern.
- Sammeln Sie an jeder Position einen Z-Stapel mit sichtbarem Licht.
- Schalten Sie die Laser aus und schalten Sie Umgebungslicht und Kondensator ein. Wählen Sie unter Einzelstandortexperimentdie Option Z-Stack aus, stellen Sie das Umgebungslicht auf 20 ms Einstrahlung ein, und behalten Sie die z-Höhewie oben beschrieben bei.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.4 für alle im Raster markierten Standorte.
- Bevor Sie zu einem anderen Beispiel wechseln, löschen Sie das Mosaik, indem Sie auf Kacheln löschenklicken.
- Zeichnen Sie ein Quadrat um alle Kacheln, um sie zu löschen. Löschen Sie auch die Marker, indem Sie alle in der Liste auswählen und dann auf Ausgewählte Sites löschenklicken.
- Schalten Sie das Umgebungslicht und den Kondensator aus, bevor Sie das Gitter wechseln. Befolgen Sie die Schritte in Abschnitt 4 in umgekehrter Reihenfolge, um die Stufe unter dem Ziel abzudocken und das Raster zu ändern.
8. Nach der Bildgebung
- Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, koppeln Sie die Bühne ab und entfernen Sie alle Proben. Schalten Sie die Probenkammerleuchte aus. Trennen Sie den externen Dewar und dekantieren Sie den verbleibenden LN2 in einen anderen kryokompatiblen Behälter, damit der Dewar sicher auf eine normale Temperatur zurückkehren kann.
- Setzen Sie den Deckelstecker auf die Kryobühne. Warten Sie, bis die Option zum Ausbacken des Kryo-Stage-Displays verfügbar wird, nachdem kein LN2 mehr in der Phase Dewar verbleibt. Drücken Sie die Bake-Out-Taste, um in den Heizmodus zu wechseln, und entfernen Sie Feuchtigkeit aus der Kryostufe, um Eisbildung zu vermeiden.
9. Wiederaufbau
- Übertragen Sie SIM-Rohdatendateien zur Rekonstruktion auf die entsprechende Workstation. Führen Sie die Verarbeitung in Batches über das Processing Task Builder-Fenster mit kanalspezifischen optischen Übertragungsfunktionen (OTFS) (berechnet aus mehrfluoreszierenden Perlenpunktspreizfunktionen) und K0-Winkeln (0,29278, -1,8028, 2,3786) mit einem konstanten Wiener Filter für alle Kanäle von 0,004 und einem Bias-Offset von 200 durch.
- Stellen Sie im Bedienfeld "Zusätzliche Optionen" sicher, dass negative Dichten verworfen werden, indem Sie andere Optionen deaktiviert halten. Speichern Sie die SIR-Bilder in einem Ordner mit dem Namen "processed".
HINWEIS: Kommerzielle SIM-Rekonstruktionssoftware erzeugt normalerweise rekonstruierte SIM-Daten und behält den Dateinamen bei, hängt jedoch SIR.dv am Ende an. Außerdem wird eine Protokolldatei erstellt, die das Verarbeitungsprotokoll, die Schritte und statistische Informationen zum Rekonstruktionserfolg enthält.
10. Chromatische Verschiebungskorrektur
- Laden Sie die Software Chromagnon7 herunter, um die chromatische Verschiebung zu korrigieren.
- Verwenden Sie die chromatische Verschiebungsreferenzmatrix, die den Fluoreszenzwellenlängen der gesammelten Daten entspricht (bereitgestellt von der Beamline).
HINWEIS: Die Referenzdatei ist eine "chromagnon.csv"-Datei, die die Ausrichtungsparameter enthält und aus Kalibrierbildern mit multifluoreszierenden Nanopartikeln gewonnen wurde. Es kann verwendet werden, um mehrere Datensätze gleichzeitig zu stapeln.- Wählen Sie die entsprechende Referenzdatei aus, die der Laserwellenlänge und dem Filter entspricht, die für die Abbildung der Probe verwendet werden, und fügen Sie sie dem Referenzfeld hinzu. Fügen Sie die rekonstruierten SIR-Daten, die im Quellfeld ausgerichtet werden sollen, hinzu und klicken Sie auf Ausführen.
- Überprüfen Sie, ob das Fluoreszenzsignal nun in den Bildern ausgerichtet ist. Legen Sie für die Stapelverarbeitung alle auszurichtenden SIR-Bilder im Quellfeld und die Referenzdatei im Referenzfeld ab, und drücken Sie Alle ausführen.
Representative Results
Eine Probe, die U2OS-Zellen enthielt, wurde mit einer Mischung aus grünem Mikrotubuli-Zytoskelettfarbstoff und rotem Mitochondrienfarbstoff gefärbt, was zur Färbung der Mikrotubuli-Komponente des Zytoskeletts (grün) und der Mitochondrien (rot) führte. Die anschließende Bildgebung zeigte die Lokalisation der Mitochondrien innerhalb der Zelle sowie die Anordnung der Mikrotubuli, wobei der strukturelle Rahmen, den sie der Zelle bieten, und die Montage des Zytoskeletts um Organellen wie den Kern hervorgehoben wurden. Die Auflösung in KryoSIM ist deutlich höher als in der Standard-Epifluoreszenzmikroskopie (Abbildung 5). Abbildung 6 zeigt, wie die fluoreszierende "Karte" eines herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskops verwendet werden kann, um Bereiche von Interesse für die Bildgebung und das entsprechende kryoSIM-rekonstruierte Bild von einem Ort auf dem Gitter aus zu lokalisieren.
Abbildung 1: Flussdiagramm mit den Stufen des CryoSIM-Bildgebungsprotokolls. Abkürzung: cryoSIM = Kryostrukturierte Beleuchtungsmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Kryostufe. (A) Die Kryostufe. (B) Ein Probengitter, das von einer invertierten Wendezette gehalten wird. (C) Bestandteile der Kryostufe. Die Anschlussanschlüsse sind beschriftet, mit den Farben orange: Netzteil, gelb: beheizter Bühnendeckel, blau: externer Dewar, grün: Anschluss an PC. Abkürzungen: PC = Personal Computer; LN2 = flüssiger Stickstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ansichten der Cockpit-Software-Panels. (A) Hauptfenster, (B) Makrostufe XY, (C) Mosaikansicht, (D) Kameraansichten. Abkürzung: SLM = Spatial Light Modulator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ansichten der Cockpit-Software-Panels. (A) Z-Stack-Einzelstandortexperiment. (B) SI Einzelstandortexperiment. (C) Tastenkombinationen für die Cockpit-Software, die während der Bildaufnahme verwendet wird. (D) Das KryoSIM-Mikroskop befindet sich vor Ort an der Beamline B24 am Diamond Light Source Synchrotron. Abkürzung: cryoSIM = Kryostrukturierte Beleuchtungsmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Auflösung der KryoSIM. (A) Mosaikansicht eines untersuchten Gitters. (B) Hellfeldbild eines Interessengebiets (AOI). (C) Pseudo-Weitfeldbild im Vergleich zu seinem (D) SIM-Bild, das die Erhöhung der Auflösung zeigt. Der weiße Pfeil zeigt SIM-Rekonstruktionsartefakte an. (E) Modulationskontrastkarte, die die Pixelintensitätsinformationen des rekonstruierten Bildes mit den Farbinformationen der jeweiligen Modulationskontrast-Rausch-Verhältnis -Werte (MCNR) der von SIMCheck2generierten Rohdaten kombiniert. Die hellen und dunklen Regionen zeigen einen hohen bzw. niedrigen Kontrast. Maßstabsleiste = 10 μm. CryoSIM-Bildgebungseinstellungen: Anregungs-/Emissionswellenlängen: 488/525 nm, 50 mW Laserleistung, 50 ms Belichtungszeit und 647/655 nm, 20 mW Laserleistung, 5 ms Belichtungszeit. Abkürzung: cryoSIM = Kryostrukturierte Beleuchtungsmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Bildrekonstruktion in KryoSIM von einem Ort auf dem Gitter in einer Fluoreszenzkarte aus einer herkömmlichen Epifluoreszenzkarte. (A,B) Überlagerung von Hellfeld- und Fluoreszenzbildkarten, die mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop erzeugt wurden. Diese Karte wird verwendet, um Regionen von Interesse zu lokalisieren, um sie anschließend in KryoSIM abzubilden. (C) Das rekonstruierte KryoSIM-Bild, das an der unter BuchstabeB)angegebenen Stelle erhalten wurde. Abkürzung: cryoSIM = Kryostrukturierte Beleuchtungsmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
3D-SIM bei kryogenen Temperaturen hat viele Vorteile gegenüber anderen SR-Bildgebungsverfahren zur Abbildung von verglastem biologischem Material. Es erfordert im Vergleich zu anderen SR-Methoden deutlich weniger Bilder pro Z-Slice, was zu einer geringeren Bestrahlung und einer geringeren Wahrscheinlichkeit der Eiskristallbildung für verglaste Proben führt. Es ist auch in der Lage, ganze Zellen abbilden und kann mit Röntgentomographie korreliert werden, um Struktur mit Funktion abzugleichen. Interessanterweise bleichen die meisten kommerziell erhältlichen Fluorophore und Fluoreszenz-Tags unter kryogenen Bedingungen weniger als bei Raumtemperatur. Angesichts der hohen Quantenausbeute der meisten gängigen Fluorophore bei Raumtemperatur (in einigen Fällen mehr als 80%) ist die in Photonen nachgewiesene absolute Verstärkung jedoch nicht auf Änderungen der Quantenausbeute zurückzuführen, sondern auf eine Verringerung der komplexen Bleichprozesse. Weitere Informationen zur Ausbeute von Fluorophoren bei kryogenen Temperaturen finden Sie in 8.
Es ist wichtig, dass Proben, die an der KryoSIM ankommen, mit einem herkömmlichen Kryofluoreszenzmikroskop mit Hellfeldfähigkeit vorkartiert wurden, um eine Raster-"Karte" zu erstellen, die die Hervorhebung aller potenziellen AOIs für die weitere Bildgebung enthält (Abbildung 5). Die Zugriffszeit an der KryoSIM wird über einen Wettbewerbsprozess zugewiesen, der die Einreichung eines Vorschlags beinhaltet, der anschließend auf die Machbarkeit der Technik und die biomedizinischen Auswirkungen bewertet wird. Die Zeit an der Ausrüstung ist daher immer "knapp", und vorkartierte Raster ermöglichen die effizienteste Nutzung einer Zuteilung. Es ist auch wichtig, dass die Probe verglast gehalten wird, insbesondere während des Probentransfers vom Probenhalter zur Bildgebungsplattform, um die Bildung von Eiskristallen und nachfolgende Probenschäden zu minimieren. Die Probe sollte von guter Qualität sein, um die besten SIM-Bilder zu erzeugen. Eine gut vorbereitete Probe zeichnet sich durch folgende Merkmale aus: (a) sie weist keine Eiskristallkontamination auf, (b) das verwendete Gitter ist ein Findergitter, (c) der Träger ist flach, (d) das Gitternetz und die Substratoberfläche sind nicht automatisch fluoreszierend und (e) es gibt keine Brüche in der Stützmembran. Diese Voraussetzungen können durch einen sorgfältigen Probenhandling und die Sicherstellung, dass die Proben immer verglast bleiben, erreicht werden.
Es ist wichtig, im Voraus zu überprüfen, ob die vorgeschlagenen Probenfluorophore im KryoSIM-Mikroskop genügend Signal geben. Werkzeuge wie SPEKCheck9 können bei der Auswahl der optimalen Fluorophor- und Filterkombinationen helfen. Wenn es Probleme mit der Rohdatenerfassung oder dem Rekonstruktionsprozess gibt, können Artefakte nach der Rekonstruktion in den Bildern erscheinen. Beispiele für verschiedene Artefakte wurden von Demmerle et al.dokumentiert 10 Die Parameter der Bildrekonstruktion können in der SoftWoRx-Protokolldatei überprüft werden, wenn die Rekonstruktion nicht optimal ist, indem die Rekonstruktionszusammenfassungsdatei geöffnet wird. Es sollte einen konsistenten Zeilenabstand über Winkel in einem bestimmten Kanal und eine relativ konsistente Amplitude geben. Variationen von mehr als 30% und Werte deutlich über 1 (wenn eine Perlengrößenkompensation angewendet wird) sollten genauer untersucht werden und weisen wahrscheinlich auf fehlgeschlagene Rekonstruktionen hin. Darüber hinaus kann die SIMcheck2-Software in Fidschi auch verwendet werden, um verschiedene Überprüfungen der Roh- und rekonstruierten Daten durchzuführen, um die Ursache von Fehlern in den Einstellungen der Bildgebungs- oder Rekonstruktionsparameter zu diagnostizieren. SIM-Check und seine Modulationskontrastkarte können auch bei der Beurteilung der Qualität rekonstruierter Daten helfen, indem interpretiert wird, welche Bereiche eines Bildes wahrscheinlich reale Strukturen im Vergleich zu Artefakten sind.
Ein niedriger Modulationskontrast (dargestellt durch dunkle Farbe, in Abbildung 5E)innerhalb des Kernbereichs bedeutet, dass dieser Bereich anfälliger für Rekonstruktionsartefakte ist, was bedeutet, dass die im Kern gezeigten Hash-Muster als Artefakt klassifiziert werden könnten (Abbildung 5D). Starke Fluoreszenzsignalbereiche spiegeln eher native Strukturen in den verarbeiteten Daten genau wider. In Bereichen mit schwachem Signal, in denen Fluorophore über größere Bereiche verteilt sind, wie z. B. die Gesamtoberfläche eines Vesikels, ist es wahrscheinlich, dass echtes Signal mit Verarbeitungsartefakten koexistiert, und bei der Interpretation dieser Daten sollte Vorsicht walten lassen. Nach der Überprüfung der rekonstruierten Daten im gesamten Bereich, um sicherzustellen, dass es keine seltsamen Artefakte gibt und dass der Hintergrund im Allgemeinen Gauß ist und nahe Null zentriert ist, werden die Daten im Allgemeinen auf Null abgeschnitten, oder der modale Wert - der Höhepunkt des Hintergrundsignals - sollte sehr nahe Null liegen. Dadurch wird sichergestellt, dass der Dynamikumfang des angezeigten Bildes nicht von negativen Hintergrundartefakten dominiert wird. Wenn ein schwächeres Signal erwartet wird, sollte besonders sorgfältig darauf geachtet werden, die Merkmale zu analysieren und sicherzustellen, dass es sich um echte Strukturen und nicht um Rekonstruktionsartefakte handelt.
Es gibt einige Einschränkungen des Bildgebungssystems. Da der Probenstand flach ist, sind Proben mit variabler Dicke oder Gittern, die nicht flach sind, keine idealen Motive für die Bildgebung. Wenn die korrelative Bildgebung mit weicher Röntgentomographie durchgeführt wird, sollten zellen in der Nähe von Gittergrenzen nicht abgebildet werden, da diese während der Erfassung von Neigungsreihen im Röntgenmikroskop nicht sichtbar sind. Schließlich hat die Menge des Blottings der Probe vor dem Einfrieren einen erheblichen Einfluss auf die Bildqualität; Zu wenig Blotting führt zu zu dicken Proben, die suboptimale SIM-Bilder mit hohem Hintergrundrauschen ergeben, während zu viel Blotting dazu führen kann, dass Zellen unförmig werden und daher anfälliger für Hitzeschäden durch den einfallenden Laserstrahl sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass cryoSIM ein leistungsstarkes Fluoreszenzmikroskopie-Tool zur Abbildung biologischer Proben in 3D in einem nahezu nativen Stadium ist und in vielen Bereichen vielfältige Anwendungen findet.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde von der Europäischen Kommission Horizon 2020 iNEXT-Discovery Projekt gefördert. I.M. Dobbie erkennt die Finanzierung durch den Wellcome Trust an (107457/Z/15/Z). Diese Arbeiten wurden mit Unterstützung der Diamond Light Source, Instrument B24 (Vorschlag BI25512) durchgeführt. Unser Dank gilt den Mitarbeitern von Micron und all unseren exzellenten Anwendern und Mitarbeitern, die uns geholfen haben, die KryoSIM und ihr korrelatives Potenzial zu etablieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto grids | FEI | ||
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
| BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
| Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
| cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
| Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
| cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
| Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
| Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
| Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
| SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
| StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
| TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |
References
- Schermelleh, L., et al.
- Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Kounatidis, I., et al. 3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182 (2), 515-530 (2020).
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