यह प्रोटोकॉल यह दर्शाता है कि क्रायो-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जैविक क्रायो-संरक्षित नमूनों को कैसे छवि दी जाए। हम U2OS कोशिकाओं के साइटोस्केलेटन इमेजिंग द्वारा कार्यप्रणाली का प्रदर्शन करते हैं।
त्रि-आयामी (3 डी) संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की तुलना में उच्च संकल्प पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाली सेलुलर संरचनाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है। यह सुपर-रिज़ॉल्यूशन (एसआर) तकनीक पूरी कोशिकाओं में आणविक प्रक्रियाओं के दृश्य को सक्षम बनाती है और संरचनात्मक और कार्यात्मक जानकारी को सहसंबंधित करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और एक्स-रे टोमोग्राफी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने की क्षमता है। क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित नमूनों (क्रायोसिम) के लिए एक सिम माइक्रोस्कोप हाल ही में यूके सिंक्रोट्रॉन में सहसंबद्ध क्रायो-इमेजिंग बीमलाइन बी 24 में कमीशन किया गया है।
यह विशेष रूप से क्रायोजेनिक तापमान पर जैविक नमूनों की 3 डी इमेजिंग के लिए डिजाइन किया गया था, जो एक्स-रे माइक्रोस्कोपी विधियों जैसे क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी द्वारा एक ही नमूनों के बाद इमेजिंग के साथ संगत तरीके से किया गया था। यह वीडियो लेख क्रायोसिम का उपयोग करके सफल इमेजिंग के लिए विस्तृत तरीके और प्रोटोकॉल प्रदान करता है। क्रायोसिम माइक्रोस्कोप के संचालन के निर्देशों के अलावा, नमूनों, फ्लोरोफोरेस और पैरामीटर सेटिंग्स की पसंद के बारे में सिफारिशों को शामिल किया गया है। प्रोटोकॉल U2OS सेल नमूनों में प्रदर्शित किया जाता है जिसका माइटोकॉन्ड्रिया और ट्यूबलिन फ्लोरोसेंटली लेबल किया गया है ।
एसआर इमेजिंग तकनीक पिछले1दशक में जीव विज्ञानियों के लिए व्यापक रूप से सुलभ हो गई है । वे फ्लोरोसेंटली टैग किए गए नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को विवर्तन सीमा से परे अनुमति देते हैं। हालांकि, क्रायोजेनिक तापमान2पर नमूनों के साथ काम करने के लिए एसआर माइक्रोस्कोपी विधियों को अनुकूलित करना चुनौतीपूर्ण रहा है। यह इलेक्ट्रॉन या एक्स-रे टोमोग्राफी के संयोजन में सहसंबद्ध इमेजिंग के लिए लाभप्रद होगा। हाल ही में, सिम को क्रायोजेनिक नमूनों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है और डायमंड लाइट सोर्स सिंक्रोट्रॉन (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html) में सहसंबद्ध क्रायो-इमेजिंग बीमलाइन बी 24 में नरम एक्स-रे टोमोग्राफी(एसएलटी) 3 के साथ मिलकर जैविक कोशिकाओं के सहसंबद्ध अध्ययन को सक्षम करने के लिए सफलतापूर्वक दिखाया गया है। सिम तीन कोणों पर और पांच चरणों में प्रकाश (Moiré किनारे) के धारीदार पैटर्न के साथ नमूना रोशन द्वारा पारंपरिक चौड़े क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के संकल्प को दोगुना कर सकते हैं । इन प्रकाश पैटर्न और नमूना फ्लोरेसेंस के बीच हस्तक्षेप का उपयोग उप-विवर्तन संरचनाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी को उजागर करने के लिए किया जा सकता है4,5.
क्रायोजेनिक अनुप्रयोगों के लिए अन्य एसआर तकनीकों पर सिम के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह विशेष रूप से डिजाइन किए गए निमिष फ्लोरोफोरस के बिना काम कर सकता है; पारंपरिक फ्लोरोफोरस का उपयोग किया जा सकता है, जिससे संभावित फ्लोरोसेंट टैगिंग एजेंट्स6की एक व्यापक रेंज तक पहुंच मिल सके । इसके अलावा, इसके लिए केवल प्रति जेड स्लाइस (3D; 9 छवियों में 2D) में 15 छवियों की आवश्यकता होती है, जबकि अन्य एसआर विधियों में प्रति स्लाइस लगभग 1000 छवियां होती हैं, जिससे नमूना गर्म होने की संभावना बढ़ आती है और इसलिए बर्फ क्रिस्टल गठन का खतरा बढ़ जाता है, जो कलाकृतियों का कारण बन सकता है। अंत में, इस तकनीक को 10 माइक्रोन से अधिक के मोटे जैविक नमूनों की छवि कर सकते हैं, पूरी कोशिकाओं को उनके पास मूल राज्य6में छवि की अनुमति । क्रायोसिम को मानक ऑप्टिकल घटकों का उपयोग करके और इमेजिंग के लिए ओपन-एक्सेस सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया है, जिससेवांछित 6होने पर दस्तावेज़ और डुप्लिकेट करना आसान हो जाता है। क्रायोसिम में 100x/0.9 संख्यात्मक अपर्चर उद्देश्य है (सामग्रियों की तालिकादेखें); इसके ऑप्टिकल घटकों, डिजाइन मापदंडों और प्रदर्शन के बारे में अधिक जानकारी फिलिप्स एट अल द्वारा वर्णित की गई है।6 यहां, यह प्रोटोकॉल यह दर्शाता है कि क्रायोसिम माइक्रोस्कोप का उपयोग कैसे किया जाए जिसमें क्रायोजेनिक चरण पर नमूनों को लोड और अनलोड किया जाए, माइक्रोस्कोप पर डेटा कैसे एकत्र किया जाए, और सिम छवियों को कैसे पुनर्निर्मित किया जाए।
क्रायोजेनिक तापमान पर 3डी सिम इमेजिंग विट्रीफाइड जैविक सामग्री के लिए अन्य एसआर इमेजिंग तकनीकों पर कई फायदे हैं। यह अन्य एसआर तरीकों की तुलना में प्रति जेड टुकड़ा काफी कम छवियों की आवश्यकता है, कम विकिरण और vitrified नमूनों के लिए बर्फ क्रिस्टल गठन की एक कम संभावना में जिसके परिणामस्वरूप। यह पूरी कोशिकाओं को छवि देने में भी सक्षम है और समारोह के साथ संरचना से मेल खाने के लिए एक्स-रे टोमोग्राफी के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। दिलचस्प बात यह है कि सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोफोरस और फ्लोरेसेंस टैग कमरे के तापमान की तुलना में क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत कम ब्लीच करते हैं। हालांकि, कमरे के तापमान पर सबसे आम फ्लोरोफोरस की उच्च क्वांटम उपज (कुछ मामलों में 80% से अधिक) को देखते हुए, फोटॉनों में पाया गया पूर्ण लाभ क्वांटम उपज में परिवर्तन के कारण नहीं है, बल्कि जटिल ब्लीचिंग प्रक्रियाओं में कमी के कारण है। क्रायोजेनिक तापमान पर फ्लोरोफोरस की उपज के बारे में अधिक जानकारी 8में पाई जा सकती है ।
यह महत्वपूर्ण है कि क्रायोसिम में पहुंचने वाले नमूनों को एक ग्रिड “मानचित्र” का उत्पादन करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र क्षमता के साथ एक पारंपरिक क्रायोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रीमैप किया गया है जिसमें आगे इमेजिंग(चित्रा 5)के लिए सभी संभावित एओआई को हाइलाइट करना शामिल है। क्रायोसिम में पहुंच समय एक प्रतिस्पर्धी प्रक्रिया के माध्यम से आवंटित किया जाता है जिसमें एक प्रस्ताव प्रस्तुत करना शामिल है, जिसे बाद में तकनीक व्यवहार्यता और जैव चिकित्सा प्रभाव के लिए मूल्यांकन किया जाता है। उपकरण पर समय, इसलिए, हमेशा “प्रीमियम पर” होता है, और प्रीमैप्ड ग्रिड आवंटन के सबसे कुशल उपयोग की अनुमति देते हैं। यह भी आवश्यक है कि नमूना को विशेष रूप से नमूना धारक से इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर नमूना हस्तांतरण के दौरान, बर्फ क्रिस्टल के गठन और बाद में नमूना क्षति को कम करने के लिए विट्रीफाइड रखा जाता है। नमूना सबसे अच्छा सिम छवियों का उत्पादन करने के लिए अच्छी गुणवत्ता का होना चाहिए। एक अच्छी तरह से तैयार नमूना निम्नलिखित विशेषताओं की विशेषता होगी: (क) इसमें कोई आइस क्रिस्टल संदूषण नहीं होगा, (ख) ग्रिड का उपयोग एक खोजक ग्रिड होगा, (ग) वाहक सपाट होगा, (घ) ग्रिड जाल और सब्सट्रेट सतह ऑटो-फ्लोरोसेंट नहीं होगी, और (ई) समर्थन झिल्ली में कोई ब्रेक नहीं होगा। इन आवश्यकताओं को सावधानीपूर्वक नमूना हैंडलिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और यह सुनिश्चित करना कि नमूने हमेशा विट्रीपिफाइड रहें।
यह पहले से जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रस्तावित नमूना फ्लोरोफोरस क्रायोसिम माइक्रोस्कोप में पर्याप्त संकेत देगा या नहीं। SPEKCheck9 जैसे उपकरण इष्टतम फ्लोरोफोर और फ़िल्टर संयोजनों को चुनने में सहायता कर सकते हैं। यदि कच्चे डेटा संग्रह या पुनर्निर्माण प्रक्रिया के साथ मुद्दे हैं, तो पुनर्निर्माण के बाद छवियों में कलाकृतियां दिखाई दे सकती हैं। विभिन्न कलाकृतियों के उदाहरणों को डेमरले एट अल द्वारा प्रलेखित किया गया है।10 इमेज रिकंस्ट्रक्शन पैरामीटर्स की समीक्षा सॉफ्टWoआरएक्स लॉग फाइल में की जा सकती है यदि पुनर्निर्माण सारांश फ़ाइल खोलकर पुनर्निर्माण इष्टतम नहीं है। किसी दिए गए चैनल में कोणों में लगातार लाइन अंतर होना चाहिए और अपेक्षाकृत सुसंगत आयाम होना चाहिए। 30% से अधिक की भिन्नता और मूल्यों को काफी ऊपर 1 (यदि मनका आकार मुआवजा लागू किया जाता है) की अधिक बारीकी से जांच की जानी चाहिए और विफल पुनर्निर्माण का संकेत मिलने की संभावना है। इसके अलावा, फिजी में सिमचेक2 सॉफ्टवेयर का उपयोग इमेजिंग या पुनर्निर्माण पैरामीटर सेटिंग्स में त्रुटियों के कारण का निदान करने के लिए कच्चे और पुनर्निर्मित डेटा पर विभिन्न जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। सिम-चेक और इसके मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट मैप से यह व्याख्या करके पुनर्निर्मित डेटा की गुणवत्ता के आकलन में भी सहायता मिल सकती है कि छवि के कौन से क्षेत्र वास्तविक संरचनाएं बनाम कलाकृतियों होने की संभावना है।
परमाणु क्षेत्र के भीतर कम मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट (डार्क कलर द्वारा दिखाया गया है, चित्रा 5Eमें) का मतलब है कि यह क्षेत्र पुनर्निर्माण कलाकृतियों के लिए अतिसंवेदनशील होने जा रहा है, इसलिए इसका मतलब है कि नाभिक में दिखाए गए हैश पैटर्न को एक कलाकृतियों के रूप में वर्गीकृत(चित्रा 5D)किया जा सकता है। मजबूत फ्लोरेसेंस सिग्नल क्षेत्रों में प्रसंस्कृत डेटा में देशी संरचनाओं को सही ढंग से प्रतिबिंबित करने की अधिक संभावना है। कमजोर संकेत के क्षेत्रों में जहां फ्लोरोफोरस को व्यापक क्षेत्रों में वितरित किया जाता है, जैसे कि एक वेसिकल की कुल सतह, यह संभावना है कि वास्तविक संकेत प्रसंस्करण कलाकृतियों के साथ मौजूद है, और उस डेटा की व्याख्या में देखभाल की जानी चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी दूरी के खंगाले गए डेटा के निरीक्षण के बाद कोई अजीब कलाकृतियां नहीं हैं, और यह कि पृष्ठभूमि आम तौर पर गॉसियन होती है और शून्य के पास केंद्रित होती है, डेटा आम तौर पर शून्य पर काटा जाता है, या मोडल मूल्य-पृष्ठभूमि सिग्नल का शिखर- शून्य के पास होना चाहिए। यह सुनिश्चित करता है कि प्रदर्शित छवि की गतिशील रेंज नकारात्मक पृष्ठभूमि कलाकृतियों का प्रभुत्व नहीं है। जब एक कमजोर संकेत की उम्मीद है, तो सुविधाओं का विश्लेषण करने और यह सुनिश्चित करने में अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए कि वे पुनर्निर्माण कलाकृतियों के बजाय वास्तविक संरचनाएं हैं।
इमेजिंग सिस्टम की कुछ सीमाएं हैं। क्योंकि नमूना चरण सपाट है, चर मोटाई या ग्रिड वाले नमूने जो फ्लैट नहीं हैं, इमेजिंग के लिए आदर्श विषय नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, यदि नरम एक्स-रे टोमोग्राफी का उपयोग करके सहसंबद्ध इमेजिंग की जाएगी, तो ग्रिड सीमाओं के पास की कोशिकाओं को चित्रित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि ये झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण के दौरान एक्स-रे माइक्रोस्कोप में दिखाई नहीं देंगे। अंत में, डुबकी ठंड से पहले नमूने के ब्लॉटिंग की मात्रा इमेजिंग गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है; बहुत कम ब्लॉटिंग के नमूने में परिणाम होते हैं जो बहुत मोटे होते हैं, उच्च पृष्ठभूमि शोर के साथ उप-तापीय सिम छवियां देते हैं, जबकि बहुत अधिक ब्लॉटिंग कोशिकाओं को गलत बनने का कारण बन सकता है और इसलिए घटना लेजर बीम से गर्मी के नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है। संक्षेप में, क्रायोसिम एक निकट-देशी चरण में 3 डी में जैविक नमूनों इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी उपकरण है और कई क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोग हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को यूरोपीय आयोग क्षितिज 2020 iNEXT-डिस्कवरी परियोजना से धन प्राप्त हुआ है। I.M Dobbie वेलकम ट्रस्ट (107457/Z/15/Z) से धन स्वीकार करते हैं । यह काम डायमंड लाइट सोर्स, इंस्ट्रूमेंट बी24 (प्रस्ताव BI25512) के समर्थन से किया गया था। माइक्रोन में कर्मचारियों और हमारे सभी उत्कृष्ट उपयोगकर्ताओं और सहयोगियों के लिए हमारा धन्यवाद हमें क्रायोसिम और इसकी सहसंबद्ध क्षमता स्थापित करने में मदद करने के लिए।
Auto grids | FEI | ||
Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |