We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.
Snelle reacties met snelle herverdeling van boodschapper(m)RNA en veranderingen in mRNA-translatie zijn relevant voor voortdurende homeostatische aanpassingen van de cellen. Deze aanpassingen zijn van cruciaal belang voor de overlevingskansen van eukaryote cellen en ‘damage control’ tijdens fluctuerende voedings- en zoutgehalteniveaus, temperatuur en verschillende chemische en stralingsstress. Vanwege de zeer dynamische aard van de reacties op RNA-niveau en de instabiliteit van veel van de RNA:RNA- en RNA:eiwittussenproducten, is het verkrijgen van een zinvolle momentopname van de cytoplasmatische RNA-toestand alleen mogelijk met een beperkt aantal methoden. Transcriptoombrede, op RNA-seq gebaseerde ribosoomprofileringsexperimenten behoren tot de meest informatieve gegevensbronnen voor de controle van de translatie. Afwezigheid van een uniform RNA en RNA:eiwit intermediaire stabilisatie kan echter leiden tot verschillende vooroordelen, met name in de snelle cellulaire responsroutes. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol van snelle fixatie dat van toepassing is op eukaryote cellen met verschillende permeabiliteit, om te helpen bij RNA en RNA: eiwit intermediaire stabilisatie. We geven verder voorbeelden van isolatie van de gestabiliseerde RNA:eiwitcomplexen op basis van hun co-sedimentatie met ribosomale en poly(ribo)somale fracties. Het gescheiden gestabiliseerde materiaal kan vervolgens worden gebruikt als onderdeel van ribosoomprofileringsachtige experimenten, zoals in translation complex profile sequencing (TCP-seq) benadering en zijn afgeleiden. Veelzijdigheid van de TCP-seq-achtige methoden is nu aangetoond door de toepassingen in een verscheidenheid aan organismen en celtypen. De gestabiliseerde complexen kunnen ook extra affiniteitsgezuiverd en in beeld worden gebracht met behulp van elektronenmicroscopie, gescheiden in verschillende poly (ribo) somale fracties en onderworpen aan RNA-sequencing, vanwege het gemak van de crosslink-omkering. Daarom kunnen methoden op basis van snap-chilling en formaldehyde-fixatie, gevolgd door de sedimentatie-gebaseerde of een ander type RNA:eiwitcomplexverrijking, van bijzonder belang zijn bij het onderzoeken van fijnere details van snelle RNA:eiwitcomplexdynamiek in levende cellen.
Levende organismen zijn onderhevig aan dynamische intra- en extracellulaire veranderingen gedurende hun levensduur, die snelle reacties vereisen om de homeostase te behouden en overleving te garanderen. Om aanpassing aan het milieu mogelijk te maken, passen eukaryote cellen hun metabolisme aan via genexpressiecontrole. Genexpressiecontrole kan worden uitgeoefend tijdens transcriptie en/of translatie; waarbij translationele responsen over het algemeen sneller optreden1,2,3,4. Translationele veranderingen treden bijvoorbeeld meestal op binnen 1-30 minuten na het begin van de stress, terwijl veranderingen op transcriptieniveau uren na stressblootstelling3,4,5volgen. Veranderingen in de translatie-output worden sneller bereikt als gevolg van de aanhoudende beschikbaarheid van boodschapper (m)RNA-moleculen in het cytoplasma. Omgekeerd moeten op transcriptieniveau nieuwe mRNA-moleculen worden gesynthetiseerd en in eukaryoten worden verwerkt en geëxporteerd vanuit de kern, waardoor uitgebreide vertragingen in de responstijd2,4,6,7, 8ontstaan.
Acute translationele respons op stress wordt over het algemeen gekenmerkt door een algehele afname van de translatie-output, met de selectieve upregulatie van eiwitten die nodig zijn voor celoverleving1,3,4,9. Het verminderen van de eiwitproductie-output wordt als cruciaal beschouwd vanwege de hoge energiekosten van het proces3,7. Om de selectieve remming en upregulatie te vergemakkelijken, worden translationele responsen bediend door een reeks complexe regulerende mechanismen. Regulatie kan worden uitgeoefend in alle fasen van de vertaling: initiatie, verlenging, beëindiging van polypeptide biosynthese en ribosomale recycling10,11,12,13, maar wordt het sterkst tentoongesteld in de initiatiefase5,7,9,10,13. Tijdens de initiatie bindt de kleine ribosomale subeenheid (SSU), bijgestaan door eukaryote initiatiefactoren (eIFs), zich aan en scant het 5′ onvertaalde gebied (UTR) van mRNA totdat een startcodon wordt herkend2,5,6,8,11,12,13. Regelgevende mechanismen zijn vaak gericht op eIF’s die van invloed zijn op hechting, scannen en codonherkenning starten. Bijvoorbeeld de initiatiefactor eIF2, een essentiële vertaalfactor die helpt bij de rekrutering van een initiator Met-tRNAiMet aan de SSU, is vaak gericht op eukaryoten onder stressomstandigheden4,6,11. In gist kan fosforylering van deze factor worden geïnduceerd onder tekort aan voedingsstoffen en osmotische stress1,4,11,14,15, en in zoogdiercellen kunnen aminozuurgebrek, endoplasmatisch reticulum (ER) stress, UV-stress, virale infectie en veranderde zuurstofniveaus deze reactie veroorzaken8,9,11. Snelle upregulatie van specifieke mRNA-translatie is duidelijk in de zoogdiercelrespons op hypoxie, die een wereldwijde snelle translatieremming en selectieve upregulatie van hypoxie-induceerbare factoren (HIFs) biosynthese vertoont. HIFs zijn transcriptiefactoren, die vervolgens cellulaire herprogrammering op langere termijn op DNA-transcriptieniveau uitlokken8,9,16. Vergelijkbare reacties zijn waargenomen in gist onder hittestress, met snelle translationele expressie van Heat Shock Proteins (HSP’s) gevolgd door vertraagde reacties op transcriptieniveau17,18. Naast het tekort aan voedingsstoffen en hitteschok zijn translationele reacties in gist bestudeerd onder verschillende zuurstof8,19zoutgehalte5, fosfaat, zwavel20,21 en stikstof22,23 Niveaus. Dit onderzoek heeft wijdverspreide implicaties voor het industriële gebruik van gist, zoals bakken en fermentatie24,25. Translationele reacties kunnen ook een rol spelen bij het bevorderen van het begrip van ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen en hartaandoeningen, die worden gekenmerkt door intracellulaire spanningen zoals oxidatieve stress. Over het algemeen zijn translationele reacties een integraal onderdeel van de genexpressiecontrole en vergemakkelijken ze een snelle aanpassing aan een breed scala aan stressomstandigheden in eukaryote organismen.
Om translationele responsen te bestuderen, zijn methoden nodig die minimaal vervormde momentopnamen van het vertaallandschap bieden. Polysome profiling is een klassieke benadering die wordt gebruikt in de studie van translatie over mRNA, waarbij poly(ribo)somale fracties van mRNA worden gescheiden via ultracentrifugatie via sucrosegradiënten26,27. De aanpak kan worden gebruikt om de vertaalniveaus voor individuele mRNA’s te onderzoeken (met de detectiemethoden zoals reverse transcriptie en polymerasekettingreactie, RT-PCR26), of wereldwijd in combinatie met high-throughput technieken (microarray of RNA-seq28,29). Een meer geëvolueerde benadering is ribosoomprofilering, die de studie mogelijk maakt van posities van langwerpige ribosomen langs een mRNA-molecuul op genoombrede schaal, evenals de gevolgtrekking van efficiëntie van translatie over transcriptoom en gebruik van de belangrijkste en alternatieve startplaatsen30,31. Ribosoomprofilering omvat de isolatie en sequencing van mRNA-fragmenten beschermd door ribosomale aanwezigheid eroverheen. Ribosoomprofilering heeft veel inzicht gegeven in de translatiedynamiek over een aantal aandoeningen, waaronder hypoxische stress, hitteschok en oxidatieve stress31,32. De techniek is aangepast aan meerdere soorten bronmateriaal, waaronder gist en zoogdiercellen.
Hoewel polysoom- en ribosoomprofilering van fundamenteel belang zijn geweest bij het uitbreiden van de mogelijkheden van onderzoek in vertaling, omvat het vertaalproces verschillende translationele tussenproducten en complexen die moeilijk te vangen zijn met deze methoden11,13. Een bijkomende beperking komt voort uit het gebrek aan vermogen om snelle responstypen te bestuderen, aangezien translationele complexen ofwel in vivo worden gestabiliseerd door de toevoeging van specifieke translatieremmers (antibiotica), wat leidt tot bepaalde ribosoomverdelingsartefacten, of ex vivo op cellyse specifiek (antibiotica) of niet-specifiek (hoog zout- of magnesiumionen), wat leidt tot de ontbering van de korterlevende of minder stabiele tussenproducten33, 34,35.
Formaldehyde wordt veel gebruikt om nucleïnezuren en eiwitten te crosslinken, zoals in chromatine immunoprecipitatie (ChIP) en crosslinking immunoprecipitatie (CLIP) studies. Het kleine formaat en de uitstekende celdoorlaatbaarheid zorgen voor een snelle in vivo actie36. Op basis van de snelle formaldehyde crosslinking is de ribosoomprofileringsbenadering uitgebreid met de Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, voor het eerst ontwikkeld in gist, maakt het mogelijk om alle translatietussenproducten vast te leggen, inclusief scanning of post-termination SSU-complexen en meerdere ribosomale configuraties37,38,41,42. De methode is gebruikt in verschillende studies10,38,39,41, 42,waarvan sommige een combinatorische benadering van zowel translatieremmers als formaldehyde-crosslinking gebruiken om de arrestatie van vertaling tevergemakkelijken. Een andere aangepaste versie van de techniek, selectieve TCP-seq39, is onlangs gebruikt om immunozuivering van de crosslinked complexen op te nemen, waardoor het bereik van de TCP-seq-toepassingen wordt verbreed. De snelle, efficiënte en omkeerbare aard van formaldehyde crosslinking maakt deze benaderingen geschikt voor het bestuderen van transiënte mRNA:translatie complexe interacties, met name in de context van zeer dynamische responsroutes op translatieniveau.
Hier beschrijven we de processen van in vivo formaldehyde crosslinking met het oog op uitgebreide translatie complexe stabilisatie en isolatie. We bieden afzonderlijke protocollen genuanceerd voor gist- en zoogdiercellen(figuur 1). We schetsen verder voorbeelden van het latere gebruik van het crosslink-gestabiliseerde materiaal (figuur 1), zoals voor co-gezuiverde eiwitfactordetectie met behulp van immunoblotting (western-blotting), immuno-geassisteerde zuivering (of ‘immunoprecipitatie’; IP) en verrijking van translationele complexen die specifieke factoren van belang, elektronenmicroscopie en RNA-sequencing bevatten.
Figuur 1: Schema met een overzicht van de typische experimentele opstelling. De belangrijkste stappen van in vivo formaldehydestabilisatie van translationele complexen worden weergegeven als een stroomdiagram, aangevuld met informatie over de belangrijkste noodzakelijke instrumenten. Mogelijke downstream-toepassingen van het verknoopte materiaal worden geschetst, inclusief voorbeelden die met succes zijn gebruikt maar niet direct in dit protocol zijn behandeld, zoals SPRI-parelzuivering van RNA, RNA-sequencing en massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Formaldehydefixatie is een handige en populaire methode om snelle in vivo crosslinking van biomoleculen te bereiken10,36,45,46,47,48. In vergelijking met de andere potentiële biomolecuuldoelen vereist een succesvolle vangst van translationele complexen een onmiddellijke fixatie tijdens het snel koelen van de cellen of ander materiaal. Zonder de ongedelayeerde stabilisatie is er een potentieel voor verschillende translatiegerelateerde processen om door te gaan, waardoor de complexe verdeling wordt verschoven van de onverstoorbare in vivo toestand49. Vergeleken met de andere methoden van translationele arrestatie en ribosomale complexe stabilisatie, beloven de snelheid van formaldehyde-actie over celmembranen en de willekeurige aard van de crosslinks behoud van de maximale diversiteit van de translatiecomplextussenproducten dichter bij hun oorspronkelijk gedistribueerde toestanden50.
De hier gepresenteerde aanpak is vastgesteld en geoptimaliseerd in zowel gist- als zoogdiercellen, en methoden zijn nu door andere groepen afgeleid voor gebruik in meer divers biologisch materiaal, zoals bij hele gewervelde dieren (bijv. Zebravisembryo’s)10,38,39,49,51,52 . Hoewel deze werken gezamenlijk de veelzijdigheid en brede toepasbaarheid van de aanpak verzekeren, kan snelle formaldehyde-crosslinking van translationele complexen als enigszins moeilijk te transponeren worden beschouwd naar nieuwe soorten biologisch materiaal vanwege de noodzaak van optimalisaties en aanpassingen.
Een belangrijke voorwaarde voor het succes van de methode is de heroptimalisatie van de concentratie van het formaldehyde en de celverzamelings- en verstoringstechniek. Minder doorlatende, kleine en ronde gistcellen vereisen een veel hogere (minstens 10-voudige) formaldehydeconcentratie en fysieke verstoring van de vaste cellen. Daarentegen kunnen grote en afgeplatte aanhangende zoogdiercellen in cultuur gemakkelijk overfixeren en moeten ze voorzichtig worden behandeld bij fixatie, terwijl de extractie van de vaste complexen chemisch kan worden uitgevoerd met membraanverstoring met behulp van detergentia. Onder-crosslinking kan minder stabiele of meer kortlevende tussenproducten in staat stellen om te dissociëren of te lekken in een latere toestand. Over-crosslinking kan het vermogen om ribosomale fracties te isoleren en te bestuderen negatief beïnvloeden en kan selectieve vooroordelen creëren, zoals diepere uitputting van zware complexen. In onze observatie kunnen zelfs kleine veranderingen, zoals het type aanhangende menselijke cellen dat wordt gebruikt, de opbrengst van de herstelde crosslinked complexen beïnvloeden en kunnen heroptimalisatie van het crosslinking-regime vereisen. We kunnen ook verwachten dat cellen met aanzienlijk verschillende permeabiliteitseigenschappen, zoals plantencellen, extra uitgebreide optimalisatie van de fixatieomstandigheden nodig hebben52. Toch is het moeilijk om je een soort biologisch materiaal voor te stellen dat volledig onverenigbaar zou zijn met de aanpak.
Een overweging die relevant is voor het fixatieprotocol van zoogdieren is de dichtheid en hoeveelheid celmateriaal die als input wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om de cellen gedurende ten minste 2 dagen continu te laten groeien zonder opnieuw te zaaien of andere verstoringen om externe invloeden op de cellulaire translatiedynamiek te voorkomen. Toepasbaar voor de meeste celtypen, maar voor de meerderheid van de aanhangende cellen consistent bereikte confluentieniveaus van niet meer dan 70% zullen zorgen voor afwezigheid van belangrijke contactremmingseffecten die de translatiesnelheid negatief en onvoorspelbaar kunnen beïnvloeden.
Een ander interessant en potentieel uniek handig kenmerk van formaldehydefixatie dat voortkomt uit zijn willekeurige reactiviteit is het stabilisatie-effect op translationele complexen in systemen van gemengde taxonomie. Bacteriële, en nog meer translationele complexen van mitochondriën, chloroplasten en verschillende intracellulaire parasieten, zijn notoir moeilijk te targeten met specifieke translatieremmers. In de TCP-seq-gegevens daarentegen zijn voetafdrukken die zijn toegewezen aan het mitotranscriptoom gemakkelijk waarneembaar in de gegevens38,39,50. Een interessante latere ontwikkeling zou het gebruik van de aanpak kunnen zijn om vertaling te onderzoeken in hele microgemeenschappen, zoals in bodem-, water- of darmmonsters, waar betrouwbare snelle translationele arrestatie en complexe stabilisatie met andere middelen problematisch zouden zijn.
Er moet ook worden vermeld dat voor het meest gecompliceerde materiaal (zoals harde en / of omvangrijke weefsels) niets het gebruik van formaldehydestabilisatie onmiddellijk na celverstoring en materiaalhomogenisatie verhindert. Deze aanpak wordt al vaak gebruikt om de celinvoervertraging weg te nemen bij het stabiliseren van translationele complexen met specifieke kleine molecuulremmers33,53,54,55. Gezien het feit dat formaldehydefixatie traditioneel wordt gebruikt met uitstekende resultaten voor ex vivo / in vitro monsterstabilisatie in toepassingen zoals elektronenmicroscopie45,56,57,58, kunnen we in dit geval nog minder negatieve effecten verwachten, met name die geassocieerd met de slechte extractie van de translationele complexen uit de grondig gefixeerde cellen.
Onze bevindingen bevestigen de bruikbaarheid van snelle formaldehydefixatie om zeer voorbijgaande complexen te stabiliseren, zoals die met eIF4A. Het is opmerkelijk dat gist eIF4A, in tegenstelling tot zoogdieren, veel zwakker geassocieerd is met het dopbindende complex eIF4F en, als gevolg daarvan, translationele complexen in het algemeen. eIF4A gaat meestal verloren tijdens een uitgebreide zuivering van het ribosomale materiaal in gist29,59,60,61,62,63. Toch is het in het in vivo-vastegistmateriaal mogelijk om een betrouwbare verrijking van eIF4A te bereiken in alle fracties van translationele complexen waar de aanwezigheid ervan zou worden verwacht. De eerder gepubliceerde Sel-TCP-seq-gegevens hebben de verrijking van eIF2 en eIF3 aangetoond die sterker associëren met de ribosomen (maar ook voorbijgaand optredende co-translationele eiwitcomplexassemblage onthulden)39. De methode is dus geschikt voor de detectie van zowel sterkere als zwakkere gehechte bestanddelen van de translationele complexen.
Samenvattend hebben we een benadering gepresenteerd die nuttig is om vooral inzicht te krijgen in de veranderingen die optreden in de startfase van de translatie en wanneer minimaal verstoorde ribosomale verdeling over het mRNA vereist is. Belangrijk is dat de aanpak geschikt is voor de stabilisatie van relatief labiele en dynamische componenten van translationele complexen, zoals eIF4A, en breed kan worden gebruikt, onderworpen aan noodzakelijke optimalisaties. We hebben ook bewijs geleverd van het nut van formaldehydefixatie in de scenario’s van snelle dynamische verandering van translatie, waardoor onderzoeksgebieden worden geopend, zoals snelle cellulaire reacties op omgevingsveranderingen of stressomstandigheden.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Australian Research Council Discovery Project grant (DP180100111 aan T.P. en N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 aan N.E.S.) en Research Fellowship (APP1135928 aan T.P.). De auteurs erkennen de faciliteiten van Microscopy Australia in het Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, een faciliteit die wordt gefinancierd door de universiteit en de federale overheid.
Yeast extract | Merck, Sigma-Aldrich | 70161 | |
Peptone | Merck, Sigma-Aldrich | 70178 | |
D-Glucose (Dextrose) | Merck, Sigma-Aldrich | 49139 | |
Adenine sulphate | Amresco | 0607-50G | |
Formaldehyde solution | Merck Sigma-Aldrich | F11635-500ML | ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation) |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific | 10777019 | |
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | COEDTAF-RO Roche by Merck | 11873580001 | |
Magnesium chloride solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | M1028 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | E7889 | |
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL | Ambion | AM2294 | |
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) | (Merck/Sigma-Aldrich) | P1944-100ML | |
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | 11033 | |
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9740 | |
Glycogen (5 mg/ml) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9510 | |
Ethyl alcohol, Pure | Merck; Sigma Aldrich | E7023 | |
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF | Merck | GE10600023 | PVDF membrane for western blotting |
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | NW04120BOX | Protein gel |
4X Bolt™ LDS Sample Buffer | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | B0007 | LDS sample loading buffer |
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards | BioRad | 1610375 | Protein ladder |
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer | ThermoFischer Scientific | B0002 | PAGE runninjg buffer |
Intercept® (PBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-70001 | Odyssey Blcoking buffer (PBS) |
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632210 | |
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632211 | |
TAP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | CAB1001 | |
Anti-beta Actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Sucrose | (Merck/Sigma-Aldrich) | 84097 | BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC) |
DL-Dithiothreitol solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | 43816 | BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O |
Terumo Syringe 1CC/mL | Terumo Syringe | 878499 | |
Potassium chloride | (Merck/Sigma-Aldrich) | 60128 | |
HEPES | (Merck/Sigma-Aldrich) | H3375 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
Tris hydrochloride | Merck/Sigma-Aldrich | 10812846001 | |
Sodium dodecyl sulfate | Merck/Sigma-Aldrich | 436143 | |
IGEPAL CA-630 | Merck/Sigma-Aldrich | I3021 | |
Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
Stainless steel grinding jar | Retsch | 02.462.0059 | |
MM400 mixer mill | Retsch | 20.745.0001 | |
Gradient Fractionator | Brandel | BRN-BR-188 | |
Thermomixer R | Eppendorf | Z605271 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices | Eppendorf Safe-Lock | 30121023 | |
Mini Gel Tank | (Thermo Fisher Scientific) | A25977 | PAGE running tank |
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | Beckman-Coulter | 344057 | |
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm – 50Pk | Beckman-Coulter | 331372 | |
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices | Merck | UFC5030 | Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume |
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge | Cambridge Scientific | 15566 | |
Beckman Coulter Optima L-90K | GMI | 8043-30-1191 | |
Nunc EasYFlask 175cm2 | Thermofisher Scientific | 159910 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermofisher Scientific | 14-432-22 | |
25 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1250 | |
10 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1100 | |
DNA lobind tubes | Eppendorf | 30108051 | |
Cold Centrifuge 5810 R | Eppendorf | EP022628188 | for 50 mL tubes |
Orbital Shaking Incubator | Ratek | OM11 | |
Frezco 17 Microcentrifuge | Thermofisher Scientific | 75002402 | |
Eppendorf DNA lo-bind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
Eppendorf® Protein LoBind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108116 | |
SW 41 Ti Swinging bucket rotor | Beckman-Coulter | 331362 | |
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L | Thermofisher Scientific | 51026282 | |
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe | BD Medical | 328822 | |
3 mL syringe with Luer Lok tip | BD Medical | 302113 | |
25 G x 16 mm Hypodermic Needle | Terumo | TUAN2516R1 |