Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Summary

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Abstract

Snelle reacties met snelle herverdeling van boodschapper(m)RNA en veranderingen in mRNA-translatie zijn relevant voor voortdurende homeostatische aanpassingen van de cellen. Deze aanpassingen zijn van cruciaal belang voor de overlevingskansen van eukaryote cellen en 'damage control' tijdens fluctuerende voedings- en zoutgehalteniveaus, temperatuur en verschillende chemische en stralingsstress. Vanwege de zeer dynamische aard van de reacties op RNA-niveau en de instabiliteit van veel van de RNA:RNA- en RNA:eiwittussenproducten, is het verkrijgen van een zinvolle momentopname van de cytoplasmatische RNA-toestand alleen mogelijk met een beperkt aantal methoden. Transcriptoombrede, op RNA-seq gebaseerde ribosoomprofileringsexperimenten behoren tot de meest informatieve gegevensbronnen voor de controle van de translatie. Afwezigheid van een uniform RNA en RNA:eiwit intermediaire stabilisatie kan echter leiden tot verschillende vooroordelen, met name in de snelle cellulaire responsroutes. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol van snelle fixatie dat van toepassing is op eukaryote cellen met verschillende permeabiliteit, om te helpen bij RNA en RNA: eiwit intermediaire stabilisatie. We geven verder voorbeelden van isolatie van de gestabiliseerde RNA:eiwitcomplexen op basis van hun co-sedimentatie met ribosomale en poly(ribo)somale fracties. Het gescheiden gestabiliseerde materiaal kan vervolgens worden gebruikt als onderdeel van ribosoomprofileringsachtige experimenten, zoals in translation complex profile sequencing (TCP-seq) benadering en zijn afgeleiden. Veelzijdigheid van de TCP-seq-achtige methoden is nu aangetoond door de toepassingen in een verscheidenheid aan organismen en celtypen. De gestabiliseerde complexen kunnen ook extra affiniteitsgezuiverd en in beeld worden gebracht met behulp van elektronenmicroscopie, gescheiden in verschillende poly (ribo) somale fracties en onderworpen aan RNA-sequencing, vanwege het gemak van de crosslink-omkering. Daarom kunnen methoden op basis van snap-chilling en formaldehyde-fixatie, gevolgd door de sedimentatie-gebaseerde of een ander type RNA:eiwitcomplexverrijking, van bijzonder belang zijn bij het onderzoeken van fijnere details van snelle RNA:eiwitcomplexdynamiek in levende cellen.

Introduction

Levende organismen zijn onderhevig aan dynamische intra- en extracellulaire veranderingen gedurende hun levensduur, die snelle reacties vereisen om de homeostase te behouden en overleving te garanderen. Om aanpassing aan het milieu mogelijk te maken, passen eukaryote cellen hun metabolisme aan via genexpressiecontrole. Genexpressiecontrole kan worden uitgeoefend tijdens transcriptie en/of translatie; waarbij translationele responsen over het algemeen sneller optreden^1,2,3,4. Translationele veranderingen treden bijvoorbeeld meestal op binnen 1-30 minuten na het begin van de stress, terwijl veranderingen op transcriptieniveau uren na stressblootstelling^3,4,5volgen. Veranderingen in de translatie-output worden sneller bereikt als gevolg van de aanhoudende beschikbaarheid van boodschapper (m)RNA-moleculen in het cytoplasma. Omgekeerd moeten op transcriptieniveau nieuwe mRNA-moleculen worden gesynthetiseerd en in eukaryoten worden verwerkt en geëxporteerd vanuit de kern, waardoor uitgebreide vertragingen in de responstijd^{2,4,6,7, 8ontstaan.}

Acute translationele respons op stress wordt over het algemeen gekenmerkt door een algehele afname van de translatie-output, met de selectieve upregulatie van eiwitten die nodig zijn voor celoverleving^1,3,4,9. Het verminderen van de eiwitproductie-output wordt als cruciaal beschouwd vanwege de hoge energiekosten van het proces^3,7. Om de selectieve remming en upregulatie te vergemakkelijken, worden translationele responsen bediend door een reeks complexe regulerende mechanismen. Regulatie kan worden uitgeoefend in alle fasen van de vertaling: initiatie, verlenging, beëindiging van polypeptide biosynthese en ribosomale recycling^10,11,12,13, maar wordt het sterkst tentoongesteld in de initiatiefase^5,7,9,10,13. Tijdens de initiatie bindt de kleine ribosomale subeenheid (SSU), bijgestaan door eukaryote initiatiefactoren (eIFs), zich aan en scant het 5' onvertaalde gebied (UTR) van mRNA totdat een startcodon wordt herkend^{2,5,6,8,11,12,13}. Regelgevende mechanismen zijn vaak gericht op eIF's die van invloed zijn op hechting, scannen en codonherkenning starten. Bijvoorbeeld de initiatiefactor eIF2, een essentiële vertaalfactor die helpt bij de rekrutering van een initiator Met-tRNA_i^Met aan de SSU, is vaak gericht op eukaryoten onder stressomstandigheden^4,6,11. In gist kan fosforylering van deze factor worden geïnduceerd onder tekort aan voedingsstoffen en osmotische stress^1,4,11,14,15, en in zoogdiercellen kunnen aminozuurgebrek, endoplasmatisch reticulum (ER) stress, UV-stress, virale infectie en veranderde zuurstofniveaus deze reactie veroorzaken^8,9,11. Snelle upregulatie van specifieke mRNA-translatie is duidelijk in de zoogdiercelrespons op hypoxie, die een wereldwijde snelle translatieremming en selectieve upregulatie van hypoxie-induceerbare factoren (HIFs) biosynthese vertoont. HIFs zijn transcriptiefactoren, die vervolgens cellulaire herprogrammering op langere termijn op DNA-transcriptieniveau uitlokken^8,9,16. Vergelijkbare reacties zijn waargenomen in gist onder hittestress, met snelle translationele expressie van Heat Shock Proteins (HSP's) gevolgd door vertraagde reacties op transcriptieniveau^17,18. Naast het tekort aan voedingsstoffen en hitteschok zijn translationele reacties in gist bestudeerd onder verschillende zuurstof^8,19zoutgehalte⁵, fosfaat, zwavel^20,21 en stikstof^22,23 Niveaus. Dit onderzoek heeft wijdverspreide implicaties voor het industriële gebruik van gist, zoals bakken en fermentatie^24,25. Translationele reacties kunnen ook een rol spelen bij het bevorderen van het begrip van ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen en hartaandoeningen, die worden gekenmerkt door intracellulaire spanningen zoals oxidatieve stress. Over het algemeen zijn translationele reacties een integraal onderdeel van de genexpressiecontrole en vergemakkelijken ze een snelle aanpassing aan een breed scala aan stressomstandigheden in eukaryote organismen.

Om translationele responsen te bestuderen, zijn methoden nodig die minimaal vervormde momentopnamen van het vertaallandschap bieden. Polysome profiling is een klassieke benadering die wordt gebruikt in de studie van translatie over mRNA, waarbij poly(ribo)somale fracties van mRNA worden gescheiden via ultracentrifugatie via sucrosegradiënten^26,27. De aanpak kan worden gebruikt om de vertaalniveaus voor individuele mRNA's te onderzoeken (met de detectiemethoden zoals reverse transcriptie en polymerasekettingreactie, RT-PCR²⁶), of wereldwijd in combinatie met high-throughput technieken (microarray of RNA-seq^28,29). Een meer geëvolueerde benadering is ribosoomprofilering, die de studie mogelijk maakt van posities van langwerpige ribosomen langs een mRNA-molecuul op genoombrede schaal, evenals de gevolgtrekking van efficiëntie van translatie over transcriptoom en gebruik van de belangrijkste en alternatieve startplaatsen^30,31. Ribosoomprofilering omvat de isolatie en sequencing van mRNA-fragmenten beschermd door ribosomale aanwezigheid eroverheen. Ribosoomprofilering heeft veel inzicht gegeven in de translatiedynamiek over een aantal aandoeningen, waaronder hypoxische stress, hitteschok en oxidatieve stress^31,32. De techniek is aangepast aan meerdere soorten bronmateriaal, waaronder gist en zoogdiercellen.

Hoewel polysoom- en ribosoomprofilering van fundamenteel belang zijn geweest bij het uitbreiden van de mogelijkheden van onderzoek in vertaling, omvat het vertaalproces verschillende translationele tussenproducten en complexen die moeilijk te vangen zijn met deze methoden^11,13. Een bijkomende beperking komt voort uit het gebrek aan vermogen om snelle responstypen te bestuderen, aangezien translationele complexen ofwel in vivo worden gestabiliseerd door de toevoeging van specifieke translatieremmers (antibiotica), wat leidt tot bepaalde ribosoomverdelingsartefacten, of ex vivo op cellyse specifiek (antibiotica) of niet-specifiek (hoog zout- of magnesiumionen), wat leidt tot de ontbering van de korterlevende of minder stabiele tussenproducten^{33, 34,35}.

Formaldehyde wordt veel gebruikt om nucleïnezuren en eiwitten te crosslinken, zoals in chromatine immunoprecipitatie (ChIP) en crosslinking immunoprecipitatie (CLIP) studies. Het kleine formaat en de uitstekende celdoorlaatbaarheid zorgen voor een snelle in vivo actie³⁶. Op basis van de snelle formaldehyde crosslinking is de ribosoomprofileringsbenadering uitgebreid met de Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)^{10,36,37,38,39,40}. TCP-seq, voor het eerst ontwikkeld in gist, maakt het mogelijk om alle translatietussenproducten vast te leggen, inclusief scanning of post-termination SSU-complexen en meerdere ribosomale configuraties^37,38,41,42. De methode is gebruikt in verschillende studies^{10,38,39,41, 42,}waarvan sommige een combinatorische benadering van zowel translatieremmers als formaldehyde-crosslinking gebruiken om de arrestatie van vertaling te^{vergemakkelijken.} Een andere aangepaste versie van de techniek, selectieve TCP-seq³⁹, is onlangs gebruikt om immunozuivering van de crosslinked complexen op te nemen, waardoor het bereik van de TCP-seq-toepassingen wordt verbreed. De snelle, efficiënte en omkeerbare aard van formaldehyde crosslinking maakt deze benaderingen geschikt voor het bestuderen van transiënte mRNA:translatie complexe interacties, met name in de context van zeer dynamische responsroutes op translatieniveau.

Hier beschrijven we de processen van in vivo formaldehyde crosslinking met het oog op uitgebreide translatie complexe stabilisatie en isolatie. We bieden afzonderlijke protocollen genuanceerd voor gist- en zoogdiercellen(figuur 1). We schetsen verder voorbeelden van het latere gebruik van het crosslink-gestabiliseerde materiaal (figuur 1), zoals voor co-gezuiverde eiwitfactordetectie met behulp van immunoblotting (western-blotting), immuno-geassisteerde zuivering (of 'immunoprecipitatie'; IP) en verrijking van translationele complexen die specifieke factoren van belang, elektronenmicroscopie en RNA-sequencing bevatten.

Figuur 1: Schema met een overzicht van de typische experimentele opstelling. De belangrijkste stappen van in vivo formaldehydestabilisatie van translationele complexen worden weergegeven als een stroomdiagram, aangevuld met informatie over de belangrijkste noodzakelijke instrumenten. Mogelijke downstream-toepassingen van het verknoopte materiaal worden geschetst, inclusief voorbeelden die met succes zijn gebruikt maar niet direct in dit protocol zijn behandeld, zoals SPRI-parelzuivering van RNA, RNA-sequencing en massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Gistcelprotocol

1. Gistcelkweek en fixatie
   OPMERKING: Celfixatie en oogst zijn aangepast van^10,38met wijzigingen.
   1. Stel 1 L gistcelcultuur in (wild-type (WT) BY4741 wordt als voorbeeld gegeven) in een orbitale shaker met de beginnende optische dichtheid van niet meer dan 0,05 AE bij 600 nm (OD₆₀₀) in geschikte media (1% w/v gistextract, 2% w/v pepton, 2% w/v dextrose (glucose), 40 mg/L adeninesulfaat (YPD) als voorbeeld gebruikt) onder de gewenste omstandigheden (30 °C gebruikt in deze experiment).
   2. Stel een voorbereidende centrifuge in met compatibele rotor- en centrifugeflessen voor het pelleteren van de vloeibare suspensiecultuur van gistcellen. Voor glucose-uithongeringsexperimenten, pellet de cellen zodra de optische dichtheid van 0,6-0,8 AE bij 600 nm (OD₆₀₀) is bereikt, met behulp van een korte centrifugatie bij 30 °C, 5.000 x g gedurende 1 minuut.
      OPMERKING: Houd de OD van de groeiende cellen bij en laat de cellen groeien totdat de OD₆₀₀ 0,6-0,8 AE bereikt, als de exponentiële groeifase van belang is.
   3. Resuspendeer de pellet onmiddellijk in warme (30 °C) YP-media zonder of weinig (0,25% w/v) toegevoegde glucose en incubeer de cultuur nog eens 10 minuten bij 30 °C in een orbitale shaker-incubator.
      OPMERKING: De samenstelling van de media kan van invloed zijn op de efficiëntie van de daaropvolgende crosslinking. Dit protocol is alleen getest met YPD. Bij het uitvoeren van hongerexperimenten is het van cruciaal belang om vast te houden aan de timing en de vertragingen tussen procedures te minimaliseren.
   4. Zodra de cellen klaar zijn, plaatst u een ijskist in de zuurkast met een bekerglas met 250 g schoon crushed waterijs. Zorg ervoor dat 25 ml stripettes en vers gekochte methanol-gestabiliseerde 37% w / v formaldehyde-oplossing toegankelijk zijn in de kap. Giet de 1 L-cultuur in het bekerglas met 25% w/v gemalen waterijs.
      OPMERKING: Houd de cellen op ijs tijdens alle volgende bewerkingen totdat de cellen zijn bevroren, tenzij anders aangegeven.
   5. Voeg 75 ml van 37% w/v formaldehydeoplossing toe tot een eindconcentratie van 2,2% m/v en roer het mengsel intensief tot het ijs smelt.
   6. Zodra het ijs is gesmolten, stelt u een timer in voor 10 minuten.
      OPMERKING: Houd u aan de aanbevolen timings en temperatuurregime om reproduceerbare fixatieresultaten te bereiken.
   7. Breng na het broeden gedurende 10 minuten de cultuur over in de voorgekoelde centrifugeflessen en pellet de cellen door centrifugering bij 4 °C, 5.000 x g gedurende 5 minuten. Terwijl deze spin aan is, koelt u een buis van 50 ml voor en houdt u vers bereide buffer A (die glycine bevat om resterende formaldehyde te neutraliseren) op ijs.
      OPMERKING: Raadpleeg de meegeleverde tabel voor de exacte buffersamenstellingen.
   8. Plaats na het centrifugeren de centrifugebuizen op ijs met de pelletzijde in contact met het ijs. Breng de buizen in de zuurkast en gooi het supernatant weg in een formaldehyde afvalcontainer.
   9. Resuspend de celkorrel uit alle buizen in 20 ml buffer A met behulp van een stripette van 25 ml en breng over naar een buis van 50 ml.
      OPMERKING: Deze wassing is van cruciaal belang voor het voorkomen van onherleidbare crosslinking en de buffertoevoeging mag niet langer zijn dan 20 minuten vanaf de oogst van de cellen.
   10. Maak het volume tot 40 ml met buffer A en verzamel de gewassen cellen door centrifugeren bij 4 °C, 5.000 x g gedurende 5 minuten.
   11. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 40 ml buffer A1, buffer A die geen glycine bevat, om eventuele glycineverontreiniging te verwijderen.
   12. Pelletcellen opnieuw door centrifugeren bij 4 °C, 5.000 x g gedurende 5 min.
   13. Herhaal de wasbeurten met buffer A1 nog één keer. Gooi het bovennatuurlijk middel weg en leg de celkorrel op ijs. Weeg de buis met de pellet (natte celmassa moet ~ 1 g per 1 l van de celcultuur zijn).
2. Verstoring van gistcellen en cytosolverzameling
   1. Vul een met aluminiumfolie beklede doos van polystyreenschuim met vloeibare stikstof tot een diepte van ongeveer 3 cm. Plaats een buis van 50 ml rechtop in de doos.
   2. Resuspend de pellet (~1 g natte celmassa) in 550 μL buffer A2 door pipetteren en vortexen gedurende 10 s. Voeg 10 μL van 40 E/μL RNase-remmer en vortex opnieuw toe gedurende 10 s.
      LET OP: Draag geschikte beschermingsmiddelen, zoals thermisch geïsoleerde handschoenen, bij het hanteren van vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat elke container die wordt gebruikt om vloeibare stikstof vast te houden niet lekt en dat het buizenrek binnenin niet op zijn kant zweeft of valt. Werk in een goed geventileerde ruimte om zuurstoftekort te voorkomen.
   3. Druppel met behulp van een pipet van 1 ml de celsuspensie in de buis van 50 ml die de vloeibare stikstof bevat.
      OPMERKING: Het druppelen moet langzaam en voorzichtig worden uitgevoerd om aggregatie van de druppels te voorkomen. Zorg ervoor dat de druppels bevriezen voordat u nieuwe druppels introduceert.
   4. Breng de buis van 50 ml met de bevroren celsuspendruppels over op kamertemperatuur en wacht tot de vloeibare stikstof volledig is verdampt. Sluit de buis af met de dop en bewaar de celkorrels bij -80 °C of ga onmiddellijk verder.
      LET OP: Zorg ervoor dat de vloeibare stikstof volledig is verdampt voordat u de buis afsluit. Overgebleven vloeibare stikstof in een afgesloten buis kan een gevaarlijke drukopbouw veroorzaken.
   5. Om je voor te bereiden op de volgende stap, koel je 1,5 ml nucleasevrije buizen en 10 ml roestvrijstalen slijppotten op droogijs.
   6. Breng de bevroren celsuspendruppels over in de potten met behulp van een schone, steriele spatel.
      LET OP: Zorg ervoor dat de maalpotten goed zijn afgesloten.
   7. Dompel de maalpotten gedurende 1 minuut onder in de vloeibare stikstof, zodat de vloeibare fase onder de junctie blijft. Zet een cryomengerfabriek op 27 Hz voor roeren gedurende 1 min.
      OPMERKING: Breng de slijpbus altijd in evenwicht met een andere bus van hetzelfde model, zelfs als het monster slechts één bus nodig heeft voor verwerking.
   8. Roer de verzegelde maalpotten op 27 Hz gedurende 1 min in de mengmolen.
   9. Koel de maalpotten opnieuw af in vloeibare stikstof zoals voorheen en schud op 27 Hz gedurende 1 minuut verder in de mengmolen.
   10. Breng de potten over naar de ijskist met droogijs samen met de nucleasevrije buizen van 1,5 ml. Breng met behulp van een kleine stalen spatel het resulterende poedervormige monster in ~100 mg aliquots over in de buizen en bewaar de buizen bij -80 °C.
       OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ~600 mg van het monster per experiment te gebruiken, bestaande uit analyse van het polysoombezinkingsprofiel, scheiding van het cytosol in vertaalde en niet-vertaalde fracties en verdere scheiding van de vertaalde fractie in SSU, ribosoom en disoomfracties bij RNase-vertering.
3. Scheiding van de vaste (poly)ribosomale complexen van de niet-vertaalde fracties van het cytosol
   OPMERKING: De eerder vastgestelde procedure^10,38wordt over het algemeen gevolgd om vertaald RNA te verrijken op basis van zijn co-sedimentatie met (poly)ribosomen. Een meer verfijnde benadering voor het scheiden van de vertaalde en niet-vertaalde cytosolfracties wordt hier geïntroduceerd, waardoor het materiaal niet meer hoeft te preciteren en vervolgens opnieuw op te lossen.
   1. Bereid 2,5 ml lineaire 10%-20% w/v sucrosegradiënten met buffer B met behulp van de vries-dooimethode⁴³ in dunwandige ultracentrifugebuizen (5 ml, 13 x 51 mm).
      OPMERKING: De vries-dooimethode wordt uitgevoerd door het sequentieel toevoegen en bevriezen van gebufferde sucroselagen met lineair regresserende concentraties op elkaar. Zie aanvullende tabel 1 voor nadere bijzonderheden.
   2. Om een discontinu 50% w/v sucrosekussen te creëren, doseer je op de lineaire gradiënten die ontdooien en stabiliseren langzaam 0,5 ml sucrose in buffer B rechtstreeks op de bodem van de buizen met behulp van een spuit van 1 ml bevestigd aan een naald van 19 G x 1,5"of een glazen capillair van vergelijkbare / geschikte afmetingen. Voordat u doseert, drijft u voorzichtig en langzaam de punt van de naald of het capillair van de bovenkant naar de onderkant van de voorgevormde sucrosegradiënten, waarbij verstoring wordt vermeden, totdat deze de bodem van de buis bereikt.
      OPMERKING: Zie aanvullende tabel 1 voor instructies over de bereiding van buffer B.
   3. Breng de gradiënten zorgvuldig in evenwicht door de bovenste delen te verwijderen of meer 10 w/v sucrose in buffer B te leggen en houd ze ijskoud of bij 4 °C.
      OPMERKING: De discontinue gradiënt met de onderste 50% sucroselaag is nodig om materiaal met een hogere bezinkingssnelheid te verzamelen zonder het op de buiswand te laten neerslaan.
   4. Ontdooi ~100 mg van het monster in poedervorm van de bevroren cel bij kamertemperatuur en plaats het onmiddellijk op ijs. Meng 150 μL buffer A2 door pipetteren, voeg RNase-remmer toe aan 1 U/μL en meng door vortexing (vermijd overmatig schuimen en mengen met de gasvormige fase) gedurende 10 s.
      OPMERKING: Ga door met alle bewerkingen terwijl u het materiaal op ijs houdt, tenzij anders aangegeven.
   5. Pelleteer het celafval door de buizen te centrifugeren bij 4 °C, 13.000 x g gedurende 5 minuten en het geklaarde supernatant (~ 150 μL) terug te winnen in een nieuwe 1,5 ml laag eiwitbindende buis.
   6. Laad het resulterende geklaarde mengsel op de discontinue sucrosegradiëntbuizen uit stap 1.3.3 en breng deze zorgvuldig in evenwicht.
   7. Ultracentrifugeer de buizen in een zwenkbakrotor met gemiddeld volume bij 4 °C, met een gemiddelde g-kracht van 287.980 x g (k-factor 49) gedurende 1 uur en 30 min.
      OPMERKING: Deze omstandigheden zijn vooraf geoptimaliseerd (met behulp van post-ultracentrifugatie gradiënt UV-absorptie sporenanalyse) om de vrije (niet-(poly)ribosomale) SSU's en LSU's (grote ribosomale subeenheid) in het bovenste (10% -20% sucrose) deel van de gradiënt te behouden terwijl de (poly)ribosomale fractie in het onderste (50%) sucrosekussen wordt geconcentreerd zonder het materiaal te pelleteren.
   8. Gebruik een nieuwe steriele spuit van 1 ml uitgerust met een naald van 19 G x 1,5" om de vertaalde cytosolfractie te verzamelen. Plaats de helling van 5 ml op een stabiel rek zodat de onderkant van de buis zichtbaar is.
   9. Steek vanaf de bovenkant van de buis de naald recht in de bodem van de gradiënt (zonder de buis te doorboren) en trek voorzichtig, zonder bubbels te creëren, precies 0,5 ml van de onderste oplossing met de vertaalde RNA-pool.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat deze stap wordt uitgevoerd in een koude kamer en dat de buis stevig wordt vastgehouden. Het wordt aanbevolen om de volledige 0,5 ml in een enkele opwaartse beweging te trekken om verstoring van de helling te voorkomen.
   10. Bevestig de (poly)ribosomale aanwezigheid en de uitputting van de SSU, LSU en lichtere fracties in het resulterende mengsel door absorptie-uitlezing van de sucrosegradiënt bij ultracentrifugatierun.
   11. Concentreer de verzamelde vertaalde RNA-pool uit de vorige stap tot 100 μL met behulp van ultrafiltratie in een microconcentratieapparaat met 10 kDa cut-off geregenereerd cellulosemembraan.
       OPMERKING: Was het membraan van het microconcentratieapparaat vooraf met 0,5 ml buffer 1 (zie figuur 2a)en gebruik spincondities (g) die door de fabrikant worden aanbevolen.
   12. Verdun het materiaal uit de vorige stap vijf keer verder (voeg 400 μL toe) met buffer 1 en concentreer terug tot 200 μL, om een kleiner volume en gedeeltelijke verwijdering van de sucrose mogelijk te maken.
       OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de resulterende mengsels maximaal 6 maanden bij -80 °C te bewaren en te gebruiken als invoermateriaal voor de 'totaal vertaalde RNA'-RNA-seq-bibliotheekconstructie of de RNase-vergistingsstap van de TCP-seq-bibliotheekconstructie. De 'niet-vertaalde' cytosolfractie kan met behulp van een vergelijkbare procedure van de bovenkant van de gradiënt worden teruggewonnen en bij -80 °C worden bewaard.
4. RNase-vertering van de vaste (poly)ribosomale complexen en scheiding van verteerd materiaal in kleine ribosomale subeenheid (SSU), monoribosomale (ribosomen, RS) en diribosomale (disomen, DS) fracties
   OPMERKING: De procedure volgt over het algemeen een eerder beschreven aanpak^10,38maar een gemodificeerd gradiënttype, scheidingstijd, versnelling en RNase-verteringsomstandigheden worden gebruikt om de beste resolutie over alle drie de geïsoleerde fracties te bereiken.
   1. Bereid zorgvuldig uitgebalanceerde 12,5 ml lineaire 10% -40% w / v sucrosegradiënten gemaakt met buffer 1 in 13 ml dunwandige polypropyleenbuizen, 14 x 89 mm, met behulp van de vries-dooimethode⁴³ zoals beschreven in stap 1.3.1 en noteer daarin.
   2. Ontdooi bij kamertemperatuur en breng de monsters onmiddellijk over op ijs of neem de geconcentreerde en sucrose-uitgeputte vertaalde cytosolfractie uit stap 1.3.12.
      OPMERKING: Ga door met alle procedures op ijs, tenzij anders aangegeven.
   3. Verteer de vertaalde cytosolfractie door gedurende 30 minuten bij 23 °C 4,5 U E. coli RNase I per 1 OD₂₆₀ eenheid van de fractie te mengen. Voeg onmiddellijk toe en meng door de RNase-remmer die RNase I kan inactiveren tot 0,25 E/μL in het mengsel te pipetteren om RNase I te inactiveren.
      OPMERKING: Gebruik RNase-remmer die RNase I kan remmen. Leid AU₂₆₀ af met behulp van AU₂₆₀ = (Absorptie bij 260 nm gestandaardiseerd op optische dichtheidseenheden gelijk aan 1 cm optisch pad x volume van het lysaat in μL) / 1.000.
   4. Breng de monsters onmiddellijk over op ijs.
      LET OP: Het is van cruciaal belang om zich te houden aan de aanbevolen omstandigheden van de spijsvertering en zorgvuldig de hoeveelheid van de toegevoegde RNase I te meten. De RNase I-eenheid waarnaar hier wordt verwezen, wordt gedefinieerd als de hoeveelheid van het enzym die nodig is om 1 μg zuuroplosbaar materiaal te produceren uit RNA van muizenlever RNA in 30 min bij 37 °C. RNase I-batches kunnen ongedocumenteerde variaties in activiteit hebben en kunnen experimenten vereisen om optimale verteringsomstandigheden te bereiken. Als de enzymvoorraad te geconcentreerd is, wordt aanbevolen deze te verdunnen met buffer 1 om te voorkomen dat zeer kleine volumes van de oplossing worden gepipetteerd.
   5. Laad de reactiemengsels op de 10%-40% w/v sucrosegradiënten uit stap 1.4.1.
      OPMERKING: Gebruik eindvolumes in het bereik van 150-300 μL per gradiënt. Elke zuivering vereist minimaal twee gradiënten. Gebruik verschillende ingangsvolumes van het materiaal (lagere AU_260,10-11 AU_260,voor DS en relatief hogere AU_260,13-14 AU_260,voor SSU of RS) om een optimale scheiding te bereiken.
   6. Ultracentrifugeer de buizen in een middelgroot volume zwenkbakrotor bij 4 °C met een gemiddelde g-kracht van 178.305 x g (k-factor 143,9) gedurende 3 uur en 30 min.
      LET OP: Als reservebalansbuizen nodig zijn, egaliseer dan hun massa en massaverdeling met de monsterbevattende buizen. Gebruik reserve sucrosegradiënten die bedekt zijn met een hoeveelheid buffer die gelijk is aan die van de monsteroverlay en geen buizen met een uniforme sacharoseconcentratie.
   7. Stel een gradiëntfractionator in ten minste 30 minuten voordat de ultracentrifugatiespin is voltooid, inclusief het invullen van de 0,2 μm gefilterde zware achtervolgingsoplossing (bijv. 60% sucrose in gedeïoniseerd water zoals hier gebruikt) in de verplaatsingspomp.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de leidingen en leidingen van de fractionator te verontreinigen met gedeïoniseerd water, gevolgd door 1% -2% SDS-oplossing in gedeïoniseerd water, gedeïoniseerd water en ten slotte 80% ethanol in gedeïoniseerde wateroplossing voor en na de runs.
   8. Pas de basislijn voor absorptie-uitlezing aan door het systeem eerst te vullen met gedeïoniseerd water en de optiek op nul te zetten volgens de aanbevelingen van de fabrikant, en vervolgens de basislijnverschuiving te compenseren met behulp van een reserve onbelaste sucrosegradiënt van 14 x 89 mm gemaakt met een buffer die identiek is aan de monsterbuizen (bijv. Buffer 1).
      OPMERKING: Gebruik dezelfde verplaatsingssnelheid om de aanpassingen uit te voeren als voor de monsteruitlezing, zoals 1,5 ml/min.
   9. Meet het dode volume van het verplaatsingssysteem door nauwkeurig de tijd te tellen tussen de oplossing die voor het eerst het optische pad van de detector betreedt en voor het eerst verschijnt bij de uitgang van de fractiecollector.
      OPMERKING: Met de aanbevolen snelheid van 1,5 ml/min kan de fractionering bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Het wordt aanbevolen om de verzamelde fracties onmiddellijk op ijs over te brengen.
   10. Voer fractionering uit met behulp van live absorptie-uitlezing bij 254 nm, 1,5 ml / min verplaatsingssnelheid en in-line fractiedetectie op basis van de verwachte sedimentatiepositie en het absorptieprofiel van de monsters. Gebruik collectorbuisschakeling met een tijdsvertraging die overeenkomt met het dode volume zoals eerder gemeten.
   11. Isoleer fracties die overeenkomen met de posities en mobiliteit van de SSU-, RS- en DS-complexen en verzamel ze in nieuwe lage eiwitbindende microcentrifugebuizen van 1,5 ml; breng de geïsoleerde fracties onmiddellijk over op ijs en vries ze in als ze niet meteen verder worden verwerkt.
       OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de verzamelde fracties onmiddellijk in droogijs of vloeibare stikstof te bevriezen en gedurende maximaal 6 maanden bij -80 °C of lager te bewaren.
5. De-crosslinking van de ribosomale complexen en isolatie van het RNA om RNA-seq bibliotheken te construeren
   1. Om de crosslinks te deblokkeren/omkeren en het RNA weg te isoleren van de geassocieerde eiwitten, brengt u ongeveer de helft van de gehele sucrosegradiëntfracties over in nieuwe laag-nucleïnezuurbindende nucleasevrije polypropyleen 1,5 ml microcentrifugebuizen (350 μL per buis) met dekselveiligheids-/vergrendelingsinrichtingen.
   2. Vul de mengsels aan met 40 μL 100% stopoplossing (10% SDS w/v en 100 mM EDTA), 4 μL van 1 M Tris-HCl pH 2 bij 25 °C (tot 10 mM), 1,6 μL van 2,5 M glycine (tot 10 mM) en gedeïoniseerd nucleasevrij water om het uiteindelijke volume van 400 μL te verkrijgen.
   3. Meng de inhoud van de buizen door te pipetteren en breng de buizen over bij kamertemperatuur.
   4. Voeg aan elke buis het gelijke volume van het mengsel zure fenol:chloroform:isoamylalcohol 125:24:1 (pH 4,0-5,0) toe. Schud de mengsels gedurende 2 minuten krachtig met behulp van een vortexmixer die op maximale snelheid is ingesteld.
      LET OP: Fenol en chloroform zijn corrosief en giftig. Vermijd fysiek contact met de vloeistoffen en werk in een goed geventileerde ruimte of onder een zuurkast. Gebruik altijd handschoenen, laboratoriumjas en beschermende bril of een gezichtsscherm bij het werken met fenol of chloroform.
   5. Plaats de buizen in een thermoshaker en schud continu bij 65 °C, 1.400 tpm gedurende 30 min.
   6. Faciliteer faseaggregatie door het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 12.000 x g te centrifugeren.
   7. Verzamel de bovenste waterige fasen en breng ze over in verse buizen met een laag nucleïnezuurbinding van 1,5 ml.
      OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, moet u niet proberen de waterige fasen volledig te herstellen. Een redelijk herstelvolume is 300-350 μL.
   8. Vul de verzamelde waterige fasen aan met 0,1 volumes 3 M natriumacetaat (pH 5 bij 25 °C), 20 μg glycogeen (met behulp van 5 μg/μL voorraad) en 2,5 volumes absolute ethanol. Meng de oplossingen voorzichtig door de buizen gedurende 1 min te vortexen.
   9. Precipiteer het RNA door de monsters gedurende ten minste 2 uur bij -20 °C te incuberen (aanbevolen 's nachts).
   10. Verwarm de buizen tot kamertemperatuur en meng door vortexing.
       OPMERKING: Voorverwarming van de buizen en daaropvolgende centrifugering bij kamertemperatuur (zonder geforceerd koelen) helpen om zout en fenol co-neerslag en overdracht te verminderen. Deze omstandigheden mogen niet leiden tot materiaalverlies of inefficiëntie van RNA-verzameling indien uitgevoerd zoals beschreven en met voldoende zuivere ethanol.
   11. Pellet het RNA neerslaan door de buisjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 12.000 x g te centrifugeren.
   12. Gooi het supernatant weg en was de pellet tweemaal met 80% v/v ethanol, waarbij u deze telkens verzamelt door centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   13. Droog de RNA-pellets door de buisdeksels te openen en de geopende buizen gedurende 10 minuten in een droogblokverwarmer te plaatsen die is ingesteld op 45 °C. Los de resulterende gedroogde pellet op in 20 μL 1x HE buffer.
   14. Schat de resulterende RNA-concentratie met behulp van UV-absorptiespectrummeting.
       OPMERKING: De lengte en totale hoeveelheid van het RNA-fragment kunnen verder worden beoordeeld met behulp van denaturerende gel-elektroforese, zoals in een geautomatiseerd op fluorescentie gebaseerd capillair gel-elektroforeseapparaat.
6. Selectieve co-immunozuivering van de SSU's door de gelabelde eIFs en western blot-analyse van de selectieve SSU-verrijking
   OPMERKING: Gebruik ~15 AU (260 nm) van de verteerde en sedimentatie-gescheiden SSU-fractie uit stap 1.4.11 om affiniteitszuivering uit te voeren met behulp van magnetische IgG-kralen. Bespaar ~5% van de SSU-fractie als invoerregeling (ingangsfractie, I). eIF4A-tagged (TIF1-TAP; Tandem Affinity Purification tag) giststam werd gebruikt die het ook mogelijk maakt om eIF4A te detecteren door te tasten naar de TAP-tag met behulp van anti-TAP antilichaam.
   1. Breng 100 μL magnetische IgG-kralensuspensie (1 mg van de kralen werden gebruikt voor elke 15 AE (260 nm) van het lysaat of fractie) over in een nieuwe laag eiwitbindende buis van 1,5 ml; verzamel de kralen met behulp van een magnetisch rek en zuig ze op.
   2. Was de magnetische kralen tweemaal met 1 ml buffer 1 door gebruik te maken van sequentiële resuspensie door pipetteren en opvangen met behulp van het magnetische rek.
   3. Na het wassen, verzamel en decanteer de kralen, terwijl je ze op het magnetische rek houdt.
   4. Voeg de SSU-fractie toe aan de gewassen kralen en incubeer het mengsel gedurende 4 uur met rotatie bij 4 °C in een cyclomixer ingesteld op ~ 20 rpm.
   5. Verzamel de kralen met behulp van het magnetische rek bij 4 °C en bewaar het supernatant (Flow-through fraction, FT).
   6. Was de kralen tweemaal bij 4 °C met buffer 1 aangevuld met 4 mM DTT, telkens gedurende 10 minuten draaien in de cyclomixer en deparels op het magneetrek opvangen en decanteren. Bewaar de wasbeurten (W1- en W2-fracties).
   7. Voor een analytische toepassing zoals western blotting, elueert u het gebonden materiaal onder denaturerende en reducerende omstandigheden door toevoeging van LDS (lithium dodecylsulfaat) polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) monsterbuffer met pH 8,5 tot 1x en DTT tot 2 mM.
   8. Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten bij 95 °C in een thermisch blok om de elutie af te ronden.
   9. Verzamel de kralen met behulp van het magnetische rek en recupereer het gedenatureerde eluaat (E-fractie) in een verse microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van 1,5 ml.
   10. Gebruik de E-fractie uit de vorige stap om onmiddellijk een denaturerende natriumdodecylodeylsulfaat (SDS) PAGE uit te voeren of bewaar de E-fractie bij -20 °C.
       OPMERKING: Voor een preparatieve verzameling van de TAP-tag-verrijkte translationele complexen voor elke volgende toepassing, gebruikt u een alternatieve elutiebenadering met behulp van Tobacco Etch Virus (TEV) protease. Zie de aanvullende tabel 1 voor meer informatie.
   11. Om de verdunde FT-, W1- en W2-fracties te concentreren, slaat u hun materiaal neer door 3x volumes ijskoude aceton toe te voegen. Incubeer het monster-acetonmengsel bij -20 °C gedurende 3 uur.
   12. Pelleteer het neerslag door de buizen gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 13.000 x g te centrifugeren.
   13. Gooi het supernatant weg en droog de pellet gedurende 30 minuten aan de lucht in de open buizen bij kamertemperatuur.
   14. Los de pellet op in 7 μL van 1x LDS laadbuffer aangevuld met 2 mM DTT. Verwarm de monsters in een thermisch blok dat gedurende 5 minuten is ingesteld op 95 °C.
   15. Laad alle I-, FT-, W1-, W2- en E-monsters op een acrylamidegradiënt van 4%-12% w/v, Bis-Tris polyacrylamide denatureringsgel. Laat de gel met behulp van 1x MES SDS (2- [N-mopholino]ethaansulfonzuur, natriumdodecylsulfaat) draaiende buffer op 80 V, totdat de eiwitmarker (10-250 kDa) goed oplost en de loodkleurstof de bodem van de gel bereikt.
       OPMERKING: Het wordt aanbevolen om seriële verdunningen van de WCL (hele cellysaat) (2-10 μg) op de gel te laden als controle. Het kan verschillende pogingen vergen om een vergelijkbare belasting van de gel over het fractiemateriaal te bereiken.
   16. Breng het eiwitgehalte van de gel over op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan door middel van een natte transfermethode bij 100 V gedurende 1 uur in een koude ruimte zoals aanbevolen door de fabrikant van western-blottingapparatuur.
   17. Blokkeer het membraan met behulp van een geschikte blokkeringsbuffer (op basis van fosfaatbuffered saline) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder constant schudden.
   18. Volg de instructies van de fabrikant voor antilichaamverdunning en onderzoek het membraan met anti-TAP-antilichaam voor het detecteren van het gelabelde eIF4A-eiwit, anti-Pab1p-antilichaam of anti-β-actine-antilichaam (of een ander wenselijk doelwit) door nachtelijke incubatie van het membraan met blocking buffer (PBS)-verdund antilichaam (1:1.000 verdunning) in een cyclomixer in een koude ruimte.
       OPMERKING: 1:1.000 antilichaamverdunning is een goed uitgangspunt.
   19. Was het membraan drie keer met 1x Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing, 0,2% v/v Tween 20 (PBST) gedurende 10 min elk.
   20. Sondeer het membraan met fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant door gedurende 1 uur in een cyclomixer bij kamertemperatuur te broeden.
       OPMERKING: 1:20.000 antilichaamverdunning is een goed uitgangspunt.
   21. Was het membraan drie keer met 1x PBST gedurende 10 minuten elk. Spoel het membraan kort met gedeïoniseerd water en vervolgens met absolute methanol. Droog en visualiseer het membraan in een fluorescerend beeldvormingssysteem volgens de instructies van de fabrikant.
       OPMERKING: Kleuring voor andere eiwitten kan worden bereikt door secundaire antilichamen te gebruiken met kleurstoffen die overeenkomen met verschillende fluorescerende kanalen (zoals in het eIF4A-TAP vs. β-actinepaar dat hier wordt gebruikt), door sequentiële kleuring of stripping en kleuring van hetzelfde membraan of het membraan te snijden uit een gel geladen met herhalend patroon van fracties en elk stuk afzonderlijk te onderzoeken met respectieve antilichamen (zoals in het Pab1p-voorbeeld dat hier wordt gebruikt).

2. Protocol voor zoogdiercellen

1. Zoogdiercelkweek en fixatie
   1. Kweek in 2 T-175 kolven HEK293-cellen tot 60%-70% confluentie in Dulbecco's Modified Eagle Medium en 10% v/v Foetaal Runderserum bij 37 °C en 5% v/v kooldioxide.
      OPMERKING: De volledige media worden gemaakt door 55 ml commerciële FBS toe te voegen aan een commercieel gekochte DMEM van 500 ml met hoge glucose, die L-glutamine, fenolrood en natriumbicarbonaat bevat, maar geen HEPES of natriumpyruvaat. Het aantal cellen per T-175-kolf bij 70% confluentie moet tussen 1,7-2,0 x 10^{7 liggen.}
   2. Vervang ten minste 3 uur vóór de gewenste fixatietijd de media van de T-175-kolven door precies 30 ml voorverwarmde complete media en vervang de kolven in een celincubator.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de verse media aan de andere kant van de kolf van de celmonolaag worden gepipetteerd om loslating van de cel te voorkomen. Probeer de media-uitwisseling zo snel mogelijk uit te voeren, waarbij minimale gas- en temperatuurbalansverstoring wordt geïntroduceerd.
   3. Zodra de celmedia zijn vervangen, bereidt u buffers en chemicaliën voor die nodig zijn voor fixatie. Bereid Dulbecco's Phosphate Buffered-Saline (DPBS) met 50 mM glycine door 10,2 ml 2,5 m glycinevoorraad toe te voegen aan een fles DPBS van 500 ml en te mengen.
   4. Bereid een fles DMEM aangevuld met 10% FBS zoals in stap 2.1.1 voor gebruik in niet-steriele omstandigheden en een aliquot van 100 ml van 0,25% Trypsine-EDTA. Zoek een extra fles commerciële DPBS voorgeformuleerd met calciumchloride (CaCl₂₎en magnesiumchloride (MgCl_2).
      OPMERKING: De oplossingen kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
   5. Bereid een ijskist tot de rand voor met gemalen waterijs, zodat een T-175-kolf er gelijkmatig bovenop past en samen met de voorbereide buffers in de zuurkast blijft, ook op ijs.
      OPMERKING: Vanwege de snelle reacties van vertaling op elke omgevingsverandering, moeten alle timings tussen het verwijderen van de celkolven uit de incubator en het toevoegen van de formaldehyde-oplossing tot een minimum worden beperkt.
   6. Om de cellen te koelen, verwijdert u de T-175-kolf uit de incubator en drukt u deze stevig tegen het ijs om maximaal contact met het oppervlak te garanderen. Kantel de kolf in de chemische zuurkast op zijn kant zodat de media zich verzamelen aan de kant tegenover de cellen. Pipetteer 168 μL van 37% w/v formaldehyde rechtstreeks in de gepoolde media (tot een eindconcentratie van 0,2% w/v). Meng onmiddellijk door de kolf voorzichtig heen en weer te wiegen, sluit en plaats de kolf op ijs, zorg ervoor dat deze horizontaal is en de cellen gelijkmatig worden bedekt.
      LET OP: Formaldehyde is een schadelijke stof met mogelijke nadelige effecten op lange termijn en ook irriterend voor zowel het ademhalingssysteem als de huid. Het mag alleen worden behandeld in een geschikte chemische zuurkast. Containers met formaldehyde moeten altijd worden afgesloten wanneer ze zich buiten de zuurkast bevinden.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het formaldehyde rechtstreeks in de celmedia wordt toegevoegd en niet aan de kolfwand. Stap 2.1.6 duurt minder dan 1 minuut.
   7. Incubeer de kolven nog 10 minuten op ijs. Giet de media af in een geschikte afvalcontainer via de kolfzijde tegenover de cellen.
   8. Pipetteer met behulp van een stripette 30 ml Dulbecco's Phosphate Buffered Saline zonder calcium- en magnesiumionen en bovendien 50 mM glycine, zachtjes aan de kant tegenover de cellen. Meng door de kolf te wiegen; zet de kolf terug in horizontale positie en incubeer nog 10 minuten op ijs.
   9. Giet de oplossing af via de kolfzijde tegenover de cellen en voeg voorzichtig 7 ml van de standaard 0,25% w/v Trypsin-EDTA-oplossing toe om de cellen los te maken en opnieuw te suspenderen. Incubeer de kolf bij kamertemperatuur gedurende 5-10 min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat trypsine-EDTA-oplossing alle cellen gelijkmatig bedekt. Gebruik periodiek zacht kantelen en schommelen om celloslating te bevorderen.
   10. Verplaats de kolf verticaal en verzamel met behulp van een stripette de losgemaakte cellen door de resterende cellen voorzichtig van de kolfwanden te wassen. Breng de suspensie over in een buis van 50 ml op ijs.
       OPMERKING: Vaste cellen kunnen kwetsbaarder worden; pipetteer niet intensief of meer dan nodig is om de cellen van de kolfwand los te maken.
   11. Vul de verzamelde celsuspensie onmiddellijk aan met 20 ml complete media (de niet-steriele ijskoude media met 10% FBS) en meng door de buis voorzichtig om te draaien.
       OPMERKING: De volledige celkweekmedia (inclusief 10% FBS) worden toegevoegd om het trypsine te neutraliseren, waardoor verdere schade aan de celmembranen en celdesintegratie wordt voorkomen.
   12. Pelleteer de cellen door de buis gedurende 5 minuten en 4 °C op 100 x g te centrifugeren. Celkorrel moet duidelijk zichtbaar zijn.
   13. Giet het medium af en resuspend de celkorrel voorzichtig in 10 ml ijskoude DPBS met Ca^2+,Mg²⁺en zonder glycine.
   14. Herhaal stap 2.1.12.
   15. Giet de wasbuffer af en suspend de celkorrel voorzichtig in 800 μL ijskoude DPBS met Ca^2+,Mg²⁺, zonder glycine, op ijs. Breng de geresuspendeerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van 1,5 ml.
   16. Centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 3 min en 4 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een pipettor van 1 ml. In dit stadium kan de celkorrel worden ingevroren bij -80 °C of doorgaan naar de cellysisstap.
       OPMERKING: Bevroren celkorrels kunnen tot 1 jaar worden bewaard bij -80 °C. We ontdekten dat het invriezen van celpellets de daaropvolgende lysis vergemakkelijkt en raden aan om te bevriezen, zelfs als opslag op langere termijn niet is gepland.
2. Verstoring van zoogdiercellen en cytosolverzameling
   1. Voeg in een bioveiligheidskast 300 μL van de lysisbuffer op basis van niet-ionisch, niet-dedenaturerend wasmiddel en 7 μL 40 E/μL RNase-remmer toe. Meng goed door te pipetteren met een punt van 1 ml.
   2. Bevestig voorzichtig een naald van 25 G aan een spuit van 1-3 ml en pipetteer het mengsel krachtig, met behulp van ten minste zeven langzame opwaartse inlaat en snelle neerwaartse uitlaatslagen.
   3. Gooi de spuit en naald in een naaldenbak en herhaal de procedure met een spuit van 0,3 ml die is uitgerust met een naald van 31 G.
   4. Gooi de spuit en naald in een naaldenbak. Centrifugeer de buizen bij 4 °C, 12.000 x g gedurende 5 minuten om het celafval te pelleteren.
   5. Breng het supernatant over in een nieuwe laag eiwitbindende microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar zowel het celafval (voor controledoeleinden) als het resulterende geklaarde cellysaat bij -80 °C.
      OPMERKING: De optische dichtheid van het lysaat varieert tussen 25-30 AE₂₆₀ wanneer twee T-175 kolven worden gecombineerd en de aanbevolen volumes worden gevolgd. De lysaten en celresten kunnen tot 1 jaar bewaard worden bij -80 °C.
3. Scheiding van de vaste (poly)ribosomale complexen van de niet-vertaalde fracties van het cytosol
   1. Bereid lineaire 15%-45% w/v sucrosegradiënten voor in 13 ml dunwandige polypropyleenbuizen, 14 x 89 mm, met behulp van vries-dooimethode in het algemeen zoals beschreven in stap 1.3.1 van het gistprotocol, maar met behulp van buffer 2 (figuur 2a).
      OPMERKING: Ontdooi de gradiënten 's nachts in een koude kamer bij 4 °C de nacht voorafgaand aan de fractionering.
   2. Laad 150-250 (maximaal 300) μL van het cellysaat uit de vorige stap 2.2.5 op de gebalanceerde gradiënten. Bewaar het resterende lysaat bij -80 °C en gebruik het voor controledoeleinden.
      OPMERKING: Hier wordt een voorbeeld gegeven van op sedimentatie gebaseerde segregatie in polysomale, ribosomale en 'vrije' SSU-fracties. Raadpleeg de verstrekte aanvullende tabel 1 voor een alternatieve aanpak.
   3. Ultracentrifugeer de buizen in een zwenkbakrotor met gemiddeld volume bij 4 °C, gemiddelde g-kracht 178.305 x g (k-factor 143,9) gedurende 1 uur en 45 min.
   4. 30 minuten voorafgaand aan de voltooiing van de spin, de gradiëntfractionator instellen en baselinen, zoals beschreven in de gistprotocolstappen 1.4.7-1.4.9.
   5. Fractioneer de gradiënten in het algemeen zoals beschreven in de stappen 1.4.10-1.4.11 van het gistprotocol.
      OPMERKING: Deze stap scheidt polysomale, ribosomale en 'vrije' SSU-fracties. Polysomale fracties kunnen worden gebruikt in polysoomprofileringsexperimenten.
   6. Breng de verzamelde fracties onmiddellijk over op ijs en bewaar, indien niet verder verwerkt, tot 6 maanden bij -80 °C.
      OPMERKING: Als de verandering van de fractiecollectorbuis wordt gesynchroniseerd met de online fractie-identificatie en -scheiding, raden we aan om tot 800 μL-fracties te gebruiken (verzameltijd van 32 s per fractie bij 1,5 ml / min). Als de fractionering wordt uitgevoerd zonder gebruik te maken van de in-line absorptie-uitlezing, wordt aanbevolen om fracties van 250-500 μL (10-20 s per fractie bij 1,5 ml /min) te gebruiken. Na scheiding kunnen de fracties worden gebruikt voor immunozuivering, elektronenmicroscopie, denaturering page en western blotting direct, of worden onderworpen aan crosslink-omkering voor daaropvolgende RNA- en / of proteomics-analyses.

Representative Results

Translationele complexen zijn gevoelig voor de ionische samenstelling van de buffers, wat vooral belangrijk is tijdens ultracentrifugatie waar sedimentatie-eigenschappen worden beoordeeld. We hebben daarom verschillende sedimentatiebuffers getest met behulp van geklaard lysaat geëxtraheerd uit gemalen niet-vast gistmateriaal, om omstandigheden te selecteren die het meest geschikt zijn om translationele complexen en afzonderlijke ribosomale subeenheden (SSU, LSU), monosomen (RS) en polysomen over de gradiënt op te lossen. Alle buffers waren gebaseerd op de kernsamenstelling met 25 mM HEPES-KOH pH 7,6 en 2 mM DTT. De concentraties van KCl, MgCl_2,CaCl₂en EDTA werden verder gewijzigd over de buffers (figuur 2a) en deze componenten werden toegevoegd aan de lysaten vóór gradiëntbelasting en aan de sucrosegradiëntbuffers vóór gradiëntgieten, dienovereenkomstig.

In buffers werden 1 en 2 goed opgeloste translationele complexen verkregen. Buffer 1 resulteerde in een iets betere scheiding van de kleine ribosomale subeenheden (SSU's) (figuur 2a). Omittance van MgCl₂ en toevoeging van EDTA (buffers 3,4) veroorzaakten verlies van de hoge sedimentatie-eigenschappen voor de meeste polysomen en waarschijnlijk hun gedeeltelijke demontage (Figuur 2a). Terwijl toevoeging van 2,5 mM CaCl₂ resulteerde in iets homogenere polysomale pieken, was de verbetering marginaal en nam de totale hoeveelheid van het polysomale materiaal in dit geval af (figuur 2a) in vergelijking met buffers 1 en 2. We kozen dus voor buffer 1 als werkbuffer bij uitstek.

Figuur 2: Buffervoorwaarden voor translationele complexe extractie en beoordeling van het stabiliserende effect van de fixatie. Getoond zijn UV-absorptieprofielen verzameld bij 260 nm voor het totale gistcellysaat gescheiden in 10%-40% w/v sucrose gradiënten. a)Effecten van mono- en tweewaardige zouten en magnesiumionenvastlegging op de sedimentatie van materiaal dat wordt geëxtraheerd uit niet-vaste gistcellen. Rode en grijze lijnen vertegenwoordigen een typische replicatie. (b,c) Vergelijking van lysaten afgeleid van niet-vaste (grijze lijn), 2,2% (zwarte lijn) en 4,4% (zwarte stippellijn) met formaldehyde-gefixeerde gistcellen. (d) Stabilisatie van polysomen door de geoptimaliseerde 0,2% w/v formaldehydefixatie (zwarte stippellijn) van HEK 293T-cellen, in vergelijking met het materiaal van dezelfde niet-vaste cellen (grijze lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vervolgens controleerden we het effect van polysomale stabilisatie door fixatie met verschillende formaldehydeconcentraties. Met behulp van anders hetzelfde celmateriaal, buffers, celbehandeling en timingbenaderingen, vergeleken we materiaal geëxtraheerd uit niet-vaste cellen en cellen gefixeerd met 2,2% en 4% w / v formaldehyde (Figuur 2b,c). We ontdekten dat 2,2% w / v formaldehyde beter geschikt was voor fixatie, omdat het, hoewel het de polysomen uitstekend bewaarde, zoals kan worden beoordeeld aan de hand van de polysome-tot-monosome-verhouding(figuur 2b),de totale opbrengst van het ribosomale materiaal niet verminderde in vergelijking met 4% w / v formaldehyde, die duidelijke tekenen van overfixatie vertoonde(figuur 2c).

Voor het materiaal dat is afgeleid van zoogdiercellen, vanwege de grotere lysisbuffer-tot-celvolumeverhouding die vereist is voor de extractie op basis van detergentia, werd buffer 2 (figuur 2a) gebruikt. Dit leverde goed opgeloste translationele complexen op bij sedimentatie in sucrosegradiënten (figuur 2d). Met name werd een veel lagere concentratie formaldehyde van 0,2% w/v gebruikt, omdat hogere concentraties resulteerden in aanzienlijk polysomaal en ribosomaal materiaalverlies (gegevens niet getoond). In overeenstemming met de resultaten verkregen met gistcellen, toonde crosslink-gestabiliseerd materiaal een beter behoud van de polysomen en een hogere polysome-tot-monosome ratio(figuur 2d).

Vervolgens hebben we getest of de geselecteerde formaldehyde-fixatieomstandigheden efficiënt genoeg zijn om actief vertaald mRNA in de polysomale fracties te stabiliseren als gevolg van crosslinking, en de verbeterde polysomale opbrengst is niet alleen een gevolg van het remmen van de enzymfunctie en translatie-elongatieprogressie. We gebruikten EDTA en hoog monovalent zout (KCl) om polysomen en ribosomen te destabiliseren. Deze reagentia werden toegevoegd aan de geklaarde gistcellysaten en opgenomen in alle daaropvolgende buffers en sucrosegradiënten bovenop respectievelijk de buffer 1-samenstelling.

Inderdaad, 15 mM EDTA vertoonde een minder destabiliserend effect op de polysomale fracties afgeleid van de vaste cellen (Figuur 3a), wat bevestigt dat de verknoopte complexen robuuster zijn. De destabiliserende effecten van EDTA kunnen enigszins worden ondervangen door de concentratie formaldehyde te verhogen, omdat materiaal uit de 4% w / v van formaldehyde-vaste cellen zich beter ontvouwde(Figuur 3a). Het verhogen van de EDTA-concentratie tot 50 mM resulteerde echter in destabilisatie van de meeste translationele complexen onder zowel vaste als niet-vaste omstandigheden, zoals kan worden afgeleid uit de langzamere sedimentatie van het materiaal en de afwezigheid van goed gevormde pieken (figuur 3b). Dit kan worden verklaard door de gedeeltelijke ontplooiing van structuren en het algehele verlies van compactheid, in plaats van door de volledige dissociatie van polysomale componenten van het mRNA. Zelfs in dit geval heeft het verknoopte materiaal een snellere sedimentatie aangetoond(figuur 3b).

Figuur 3: Effecten van in vivo gistformaldehydefixatie op de stabiliteit van polysomen. Buffer 1 (zie tekst en figuur 2a) werd in alle experimenten gebruikt. Gegevenstype en plotten zoals beschreven in de legenda van figuur 2. a)Vergelijking van de toevoeging van 15 mM EDTA aan de cellysaten en daaropvolgende buffers op de stabiliteit van de polysomen afgeleid van niet-vaste (grijze lijn), 2,2% (zwarte lijn) en 4% (zwarte stippellijn) met formaldehyde-vaste cellen. b) gelijk is aana), maar voor de toevoeging van 50 mM EDTA en met uitzondering van 4 gewichtspercenten formaldehyde-vaste cellen. c) gelijk is aana), maar voor de toevoeging van 500 mM KCl en met uitzondering van 2,2 gewichtspercent formaldehyde-vaste cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vergelijkbaar met de EDTA-effecten, bij 500 mM KCl, vonden we een grote verbetering van de stabiliteit met 4% w / v formaldehydefixatie (figuur 3c). Het schijnbare verlies van compactheid kan in dit geval ook worden verklaard door gedeeltelijke loslating van de bestanddelen van de ribosomale complexen, in plaats van hun volledige dissociatie van het RNA. Over het algemeen vertoonden polysomen afgeleid van formaldehyde-gefixeerde cellen een hogere weerstand tegen ontvouwende en structurele destabilisatie, consistent met het vormen van extra covalente bindingen binnen deze complexen.

Tijdens stimulerende groeiomstandigheden kunnen mRNA's snel worden geïnitieerd, wat resulteert in accumulatie van meerdere ribosomen op dezelfde mRNA-moleculen, die structuren vormen die bekend staan als polyribosomen of polysomen. Polysomen kunnen worden gescheiden door ultracentrifugatie in sucrosegradiënten, waar ze sedimenteren op basis van hun volgorde (aantal gelijktijdig gehechte ribosomen op mRNA). Wanneer vertaling wordt onderdrukt, slagen ribosomen er niet in om snel genoeg een nieuwe vertaalronde te maken, wat resulteert in (gedeeltelijke) 'demontage' van polysomen, die wordt getoond als een modal shift naar de polysomen van een lagere orde en accumulatie van monosomen^4,26.

Een model van translationele respons dat kan worden gevisualiseerd op het polysoomordeverdelingsniveau kan worden geleverd door glucose-uithongering. Glucose-uitputting lokt een van de meest dramatische en snelle translationele remmende effecten op gist^1,3,40. Eerdere studies toonden aan dat binnen 1 minuut na glucosedepletie, verlies van polysomen, accumulatie van monosomen en remming van translatie-initiatie kunnen optreden⁴. Binnen 5 minuten na glucose-re-supplement wordt de translatie snel hersteld met een duidelijke toename van polysomen^3,4. Er werd ook waargenomen dat translatie werd geremd wanneer cellen werden blootgesteld aan media met glucose van 0,5% (w / v) of lager en er werd geen effect waargenomen bij glucosespiegels van 0,6% (w / v) of hoger.

We wilden dus bepalen of onze fixatiecondities geschikt zijn voor het behoud van de translatieverschillen binnen de dynamiek van glucosestressrespons, zoals kan worden beoordeeld aan de hand van de polysome-to-monosome ratio. We vergeleken het materiaal van de cellen die in de mid-exponentiële fase op hoge glucose (2,00% w / v toegevoegd) werden gekweekt met die gedurende 10 minuten in media met geen of lage toegevoegde (respectievelijk 0,00% of 0,25% w / v) glucose. De fixatie is uitgevoerd met 2,2% w/v formaldehyde parallel in de controle (niet-uitgehongerd; snelle mediavervanging met dezelfde standaardmedia met 2% w/v toegevoegde glucose, gevolgd door incubatie gedurende 10 minuten en fixatie) en 10 min uitgehongerd (snelle mediavervanging met dezelfde media maar laag 0,25 w/v of geen toegevoegde glucose, gevolgd door incubatie gedurende 10 minuten en fixatie) cellen.

In overeenstemming met de eerdere bevindingen, zagen we dat gistcellen de translatie bij glucose-uithongeringsstress sterk onderdrukken(figuur 4a). Zowel geen toegevoegde als lage glucosecondities veroorzaakten polysoomdemontage, waarbij iets maar duidelijk meer polysomen werden vastgehouden in het geval van lage toegevoegde glucose. De gistglucoseverwijderingsreactie kan dus niet van een all-on of all-off type zijn en wordt geleidelijk afgestemd. Polysomaal materiaal uit de vaste cellen bevestigt de verwachtingen voor de stabiliserende werking van de formaldehyde-crosslinking en heeft een hoger onderscheid aangetoond tussen de uitgehongerde en niet-uitgehongerde cellen, waardoor aantoonbaar een hoger dynamisch bereik van de respons behouden blijft(figuur 4b). Intrigerend genoeg, in het geval van materiaal uit de vaste cellen, resulteerde een lage toegevoegde glucoseconcentratie in de specifieke polysomale abundantie die veel beter wordt onderscheiden van de niet-toegevoegde glucoseconditie, in vergelijking met de niet-vaste cellen (figuur 4a). Dit is een sterke indicatie van de geschiktheid van de formaldehydefixatiebenadering bij het bewaren en vastleggen van relatief kleine en voorbijgaande verschillen in het evenwicht van zeer dynamische processen, zoals tijdens translationele reacties.

Figuur 4: Het vastleggen van snelle veranderingen in de gistomzetting bij glucoseverhongering. Buffer 1 (zie tekst en figuur 2a) werd in alle experimenten gebruikt. Gegevenstype en plotten zoals beschreven in de legenda van figuur 2. (a) Cellysaten verkregen uit niet-uitgehongerde (grijze lijn), beperkte glucose-uitgehongerde (0,25% w/v toegevoegde glucose gedurende 10 min; bruine lijn) en glucose-uitgeputte (geen toegevoegde glucose gedurende 10 min; rode lijn) niet-vaste gistcellen. b) gelijk is aan (a), maar voor 2,2 % g/v formaldehyde-vaste cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het monitoren van de translationele status door de ribosomen geassocieerd met het actief vertalen van mRNA met behulp van sucrose gradedimentatie ('polysome profiling') is een veel toegepaste techniek^26,27,28. In combinatie met kwantitatieve microarray-analyse en meer recent met high throughput sequencing^28,44, biedt polysome profiling informatie over ribosoom-geassocieerde mRNA's transcriptoom-breed. Met verschillende aannames wordt op het gebied van eiwitbiosyntheseonderzoek traditioneel betoogd dat de polysomale aanwezigheid een indicatie is van actieve betrokkenheid bij de vertaling van de respectieve mRNA's. Een verdere conclusie is vaak (maar niet altijd) gerechtvaardigd, dat hoe meer ribosomen aanwezig zijn op een mRNA van een bepaalde lengte (hoe hoger de orde van de polysomen), hoe actiever dat mRNA betrokken is bij de translatie. Het scheiden van de polysomale fractie van de rest van het materiaal kan dus nuttig zijn vanuit het oogpunt van het isoleren van het actief vertaalde RNA. Binnen de footprint profiling benaderingen, en in het bijzonder TCP-seq^10,38,39 die een afzonderlijke populatie van de bevrijde SSU's genereert afgeleid van de scanning, start en stop codoncomplexen, kan het extra inzichtelijk zijn om ribosomale subeenheden te verwijderen die niet co-sedimenteren met de volledige monosomen of polysomen.

We hebben dus gebruik gemaakt van scheiding van de 'niet-vertaalde' mRNP's zoals vrije SSU's (mRNA gebonden aan enkele SSU of SSU's zonder bijgevoegd mRNA) weg van de 'actief vertalende' pool van mRNA's. Om dit te bereiken, gingen we ervan uit dat mRNA's die betrokken zijn bij interacties met één (mono-) of meerdere ribosomen (polysomen) actief kunnen worden vertaald. Dergelijke complexen kunnen van de anderen worden gescheiden door hun hogere sedimentatiecoëfficiënt. We stelden ook voor om de 'actief vertaalde' pool van mRNA's te scheiden in een sucrosekussen (50% w / v sucrose) in plaats van het materiaal direct op de buiswand te pelleteren. Door de snel sedimenterende complexen in het kussen te centrifugeren, konden we de scheiding controleren met behulp van uitlezing van het absorptieprofiel en een hogere output van het opgeloste, niet-geaggregeerde en niet-gedenatureerde materiaal bereiken, vergeleken met pelleteren en opnieuw oplosbaarheid^10,38.

Over het algemeen werden, om de individuele SSU's, ribosomen, disomen en potentieel compact verpakte polysomen van een hogere orde te zuiveren, vaste geklaarde lysaten onderworpen aan een tweetraps ultracentrifugatieproces (figuur 5). In de eerste sucrosegradiënt resulteerde de ultracentrifugatie in gescheiden vrije SSU's en LSU's in het bovenste (10%-20% w/v sucrose) deel van de gradiënt, terwijl de verknoopte vertaalde pool inclusief polysomen en mRNA's geassocieerd met één compleet ribosoom geconcentreerd waren aan de onderkant (50% w/v sucrose) van de gradiënt(figuur 5a ). De onderste 50% w/v sacharoselaag die de vertaalde mRNA-pool bevatte, werd vervolgens geconcentreerd en het RNA ervan werd verteerd met RNase I, gevolgd door een tweede sucrosegradiënt ultracentrifugatie om afzonderlijke SSU, LSU, RS, RNase-resistente disomen (DS) en kleine fractie van hogere-orde nuclease-resistente polysomen te verkrijgen (figuur 5b). Negatieve kleuring met uranylacetaat en beeldvorming met een transmissie-elektronenmicroscoop bevestigden de identiteit van de complexen die in elk sedimentatiestadium zijn geïsoleerd(figuur 5).

Figuur 5: Isolatie van de totale vertaalde RNA-fracties weg van het onvertaalde RNA. (a,c) Schematisch (links) en de respectieve representatieve resultaten (rechts; gegevenstype en plotting zoals beschreven in de figuur 2-legenda) van (a) eerste discontinue sucrosegradiëntscheiding van de niet-vertaalde cytosolfracties inclusief vrije SSU's en de vertaalde mRNA-pool geïdentificeerd door co-sedimentatie met ribosomen en polysomen; en (c) scheiding van de individuele ribosomale complexen die vrijkomen uit de vertaalde mRNA-pool door gecontroleerde RNase I-vertering en ultracentrifugatie via een tweede lineaire sucrosegradiënt in SSU-, LSU-, ribosomale (RS) en nucleaseresistente disomale (DS) fracties. Hoge (15 AU₂₆₀₎en lage (8 AU₂₆₀₎hoeveelheden van het niet-uitgehongerde verteerde materiaal werden opgenomen om een mogelijkheid aan te tonen om de ultracentrifugatiebelastingen te verhogen wanneer kleine fracties van belang zijn. Hogere-orde nuclease-resistente polysomen kunnen ook worden geïdentificeerd (bijv. Trisomen in de gegeven voorbeelden). (b,d) Representatieve TEM-afbeeldingen van uranylacetaat-contrasterende fracties van (a,c), respectievelijk zoals gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de geschiktheid van het fixatieregime voor het behoud van voorbijgaande ribosoom-geassocieerde eiwitten (met name eIF's) te controleren, hebben we getest op de co-sedimentatie van eIF4A, een labiele eIF die dynamisch gebonden is aan het ribosoom, over de ribosomale fracties. We maakten gebruik van de eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) gelabelde giststam (TIF1-TAP) en onderzochten de aanwezigheid van eIF4A in materiaal afgeleid van de vaste versus niet-vaste cellen met behulp van anti-TAP-antilichaam, vergeleken met de overvloed aan Pab1p als een extra RNA-bindende controle, met behulp van SDS-PAGE gevolgd door western blotting(Figuur 6).

Figuur 6: Stabilisatie van voorbijgaande eiwitten in de translationele complexen bij in vivo formaldehydefixatie. (a,b) (bovenste plots) Hele cellysaat (WCL) van (a) niet-gefixeerde en (b) 2,2% formaldehyde-gefixeerde eIF4A-TAP gistcellen gescheiden door ultracentrifugatie en gevisualiseerd zoals beschreven in de figuur 2-legenda. (onderste percelen) Western-blot beeldvorming van de respectieve sucrose gradiëntfracties bij scheiding van het geanalyseerde materiaal in de overeenkomstige gradiënten (bovenste plots), en WCL als controle. c)Gemiddelde verhouding tussen de abundantie van eIF4A of Pab1p in de fracties van vast en niet-vast materiaal. Relatieve verhoudingen (genormaliseerd tot het signaal van alle 2-7 fracties) van eIF4A (zwarte balken) en Pab1p (grijze balken) werden berekend over 2,3 (SSU, LSU), 4,5 (RS, lichte polysomen) en 6,7 (zware polysomen) uit de gegevens van (a,b) (onderste plots) en hun vaste tot niet-vaste verhouding genomen. Foutbalken geven de standaardafwijking aan van de verhouding tot het gemiddelde met de gepoolde fracties (gestippelde vakken) die als replicaties worden behandeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In overeenstemming met hun hoge abundantie in de cellen, zagen we een hoge intensiteit van het signaal van zowel de eiwitten in het hele cellysaat (WCL) als langzamere sedimenterende fracties afgeleid van niet-vaste cellen(figuur 6a,onderste paneel). We hebben ook aanzienlijke hoeveelheden van deze eiwitten gedetecteerd in de WCL afgeleid van de vaste cellen en het geruststellen van de efficiëntie van de crosslinked materiaalextractie en afwezigheid van onverwachte verliezen(figuur 6b,bodempaneel). In tegenstelling tot de niet-vaste cellen vertoonde materiaal uit de vaste cellen echter een verhoogde relatieve aanwezigheid van eIF4A in de sneller sedimenterende ribosomale fracties, in vergelijking met Pab1p (figuur 6c). Dit resultaat suggereert dat eIF4A steviger geassocieerd blijft met de polysomen in formaldehyde-gekruist materiaal.

Nadat we het positieve en specifieke stabilisatie-effect van crosslinking op eIF4A-aanwezigheid in de ribosomale fracties hadden bevestigd, gebruikten we het vaste materiaal van eIF4A-gelabelde (TIF1-TAP) giststam om eIF4A-bevattende complexen te vangen en te verrijken door affiniteitszuivering met magnetische IgG-kralen. We hebben affiniteitsverrijkte WCL-, vrije SSU- en polysomale (vertaalde mRNA-pool) fracties na de eerste sedimentatie door sucrosegradiënt (bijv. sectie 1.3 van het gistprotocol), evenals SSU-, LSU- en RS-fracties van de tweede sedimentatie bij de demontage van de vertaalde pool in individuele complexen met RNase I (bijv. Sectie 1.4 van het gistprotocol) (Figuur 7 ). In alle gevallen, behalve de LSU-fractie, konden we selectieve verrijking van de eIF4A in de gezuiverde fracties (eluaat, E) waarnemen, in vergelijking met de aanwezigheid van β-actine in het bronmateriaal (input, I) (Figuur 7).

Figuur 7: Selectieve immunozuivering van in vivo formaldehyde-gestabiliseerde translationele complexen door tijdelijk geassocieerde eIF4A. Het schema illustreert de bron van verschillende translationele complexen en eIF4A-epitoop, inclusief de niet-gefractioneerde geklaarde WCL van de eIF4A-TAP-gistcellen; vrije SSU's en vertaalde RNA-pool (polysomen) gescheiden in de eerste ultracentrifugatie; SSU-, LSU- en RS-fracties bevrijd van het vertaalde RNA door RNase I-vertering en gescheiden met behulp van tweede ultracentrifugatie (zie tekst). Western blot-afbeelding biedt een visualisatie van de eIF4A-abundantie in de fracties in vergelijking met de overvloed aan gelijktijdig gekleurde β-actinecontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Formaldehydefixatie is een handige en populaire methode om snelle in vivo crosslinking van biomoleculen te bereiken^{10,36,45,46,47,48.} In vergelijking met de andere potentiële biomolecuuldoelen vereist een succesvolle vangst van translationele complexen een onmiddellijke fixatie tijdens het snel koelen van de cellen of ander materiaal. Zonder de ongedelayeerde stabilisatie is er een potentieel voor verschillende translatiegerelateerde processen om door te gaan, waardoor de complexe verdeling wordt verschoven van de onverstoorbare in vivo toestand⁴⁹. Vergeleken met de andere methoden van translationele arrestatie en ribosomale complexe stabilisatie, beloven de snelheid van formaldehyde-actie over celmembranen en de willekeurige aard van de crosslinks behoud van de maximale diversiteit van de translatiecomplextussenproducten dichter bij hun oorspronkelijk gedistribueerde toestanden⁵⁰.

De hier gepresenteerde aanpak is vastgesteld en geoptimaliseerd in zowel gist- als zoogdiercellen, en methoden zijn nu door andere groepen afgeleid voor gebruik in meer divers biologisch materiaal, zoals bij hele gewervelde dieren (bijv. Zebravisembryo's)^{10,38,39,49,51,52} . Hoewel deze werken gezamenlijk de veelzijdigheid en brede toepasbaarheid van de aanpak verzekeren, kan snelle formaldehyde-crosslinking van translationele complexen als enigszins moeilijk te transponeren worden beschouwd naar nieuwe soorten biologisch materiaal vanwege de noodzaak van optimalisaties en aanpassingen.

Een belangrijke voorwaarde voor het succes van de methode is de heroptimalisatie van de concentratie van het formaldehyde en de celverzamelings- en verstoringstechniek. Minder doorlatende, kleine en ronde gistcellen vereisen een veel hogere (minstens 10-voudige) formaldehydeconcentratie en fysieke verstoring van de vaste cellen. Daarentegen kunnen grote en afgeplatte aanhangende zoogdiercellen in cultuur gemakkelijk overfixeren en moeten ze voorzichtig worden behandeld bij fixatie, terwijl de extractie van de vaste complexen chemisch kan worden uitgevoerd met membraanverstoring met behulp van detergentia. Onder-crosslinking kan minder stabiele of meer kortlevende tussenproducten in staat stellen om te dissociëren of te lekken in een latere toestand. Over-crosslinking kan het vermogen om ribosomale fracties te isoleren en te bestuderen negatief beïnvloeden en kan selectieve vooroordelen creëren, zoals diepere uitputting van zware complexen. In onze observatie kunnen zelfs kleine veranderingen, zoals het type aanhangende menselijke cellen dat wordt gebruikt, de opbrengst van de herstelde crosslinked complexen beïnvloeden en kunnen heroptimalisatie van het crosslinking-regime vereisen. We kunnen ook verwachten dat cellen met aanzienlijk verschillende permeabiliteitseigenschappen, zoals plantencellen, extra uitgebreide optimalisatie van de fixatieomstandigheden nodig hebben⁵². Toch is het moeilijk om je een soort biologisch materiaal voor te stellen dat volledig onverenigbaar zou zijn met de aanpak.

Een overweging die relevant is voor het fixatieprotocol van zoogdieren is de dichtheid en hoeveelheid celmateriaal die als input wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om de cellen gedurende ten minste 2 dagen continu te laten groeien zonder opnieuw te zaaien of andere verstoringen om externe invloeden op de cellulaire translatiedynamiek te voorkomen. Toepasbaar voor de meeste celtypen, maar voor de meerderheid van de aanhangende cellen consistent bereikte confluentieniveaus van niet meer dan 70% zullen zorgen voor afwezigheid van belangrijke contactremmingseffecten die de translatiesnelheid negatief en onvoorspelbaar kunnen beïnvloeden.

Een ander interessant en potentieel uniek handig kenmerk van formaldehydefixatie dat voortkomt uit zijn willekeurige reactiviteit is het stabilisatie-effect op translationele complexen in systemen van gemengde taxonomie. Bacteriële, en nog meer translationele complexen van mitochondriën, chloroplasten en verschillende intracellulaire parasieten, zijn notoir moeilijk te targeten met specifieke translatieremmers. In de TCP-seq-gegevens daarentegen zijn voetafdrukken die zijn toegewezen aan het mitotranscriptoom gemakkelijk waarneembaar in de gegevens^38,39,50. Een interessante latere ontwikkeling zou het gebruik van de aanpak kunnen zijn om vertaling te onderzoeken in hele microgemeenschappen, zoals in bodem-, water- of darmmonsters, waar betrouwbare snelle translationele arrestatie en complexe stabilisatie met andere middelen problematisch zouden zijn.

Er moet ook worden vermeld dat voor het meest gecompliceerde materiaal (zoals harde en / of omvangrijke weefsels) niets het gebruik van formaldehydestabilisatie onmiddellijk na celverstoring en materiaalhomogenisatie verhindert. Deze aanpak wordt al vaak gebruikt om de celinvoervertraging weg te nemen bij het stabiliseren van translationele complexen met specifieke kleine molecuulremmers^33,53,54,55. Gezien het feit dat formaldehydefixatie traditioneel wordt gebruikt met uitstekende resultaten voor ex vivo / in vitro monsterstabilisatie in toepassingen zoals elektronenmicroscopie^45,56,57,58, kunnen we in dit geval nog minder negatieve effecten verwachten, met name die geassocieerd met de slechte extractie van de translationele complexen uit de grondig gefixeerde cellen.

Onze bevindingen bevestigen de bruikbaarheid van snelle formaldehydefixatie om zeer voorbijgaande complexen te stabiliseren, zoals die met eIF4A. Het is opmerkelijk dat gist eIF4A, in tegenstelling tot zoogdieren, veel zwakker geassocieerd is met het dopbindende complex eIF4F en, als gevolg daarvan, translationele complexen in het algemeen. eIF4A gaat meestal verloren tijdens een uitgebreide zuivering van het ribosomale materiaal in gist^{29,59,60,61,62,63.} Toch is het in het in vivo-vastegistmateriaal mogelijk om een betrouwbare verrijking van eIF4A te bereiken in alle fracties van translationele complexen waar de aanwezigheid ervan zou worden verwacht. De eerder gepubliceerde Sel-TCP-seq-gegevens hebben de verrijking van eIF2 en eIF3 aangetoond die sterker associëren met de ribosomen (maar ook voorbijgaand optredende co-translationele eiwitcomplexassemblage onthulden)³⁹. De methode is dus geschikt voor de detectie van zowel sterkere als zwakkere gehechte bestanddelen van de translationele complexen.

Samenvattend hebben we een benadering gepresenteerd die nuttig is om vooral inzicht te krijgen in de veranderingen die optreden in de startfase van de translatie en wanneer minimaal verstoorde ribosomale verdeling over het mRNA vereist is. Belangrijk is dat de aanpak geschikt is voor de stabilisatie van relatief labiele en dynamische componenten van translationele complexen, zoals eIF4A, en breed kan worden gebruikt, onderworpen aan noodzakelijke optimalisaties. We hebben ook bewijs geleverd van het nut van formaldehydefixatie in de scenario's van snelle dynamische verandering van translatie, waardoor onderzoeksgebieden worden geopend, zoals snelle cellulaire reacties op omgevingsveranderingen of stressomstandigheden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast extract	Merck, Sigma-Aldrich	70161
Peptone	Merck, Sigma-Aldrich	70178
D-Glucose (Dextrose)	Merck, Sigma-Aldrich	49139
Adenine sulphate	Amresco	0607-50G
Formaldehyde solution	Merck Sigma-Aldrich	F11635-500ML	ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific	10777019
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	COEDTAF-RO Roche by Merck	11873580001
Magnesium chloride solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	M1028
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	E7889
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL	Ambion	AM2294
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific	AM2694
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)	(Merck/Sigma-Aldrich)	P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	11033
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9740
Glycogen (5 mg/ml)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9510
Ethyl alcohol, Pure	Merck; Sigma Aldrich	E7023
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF	Merck	GE10600023	PVDF membrane for western blotting
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	NW04120BOX	Protein gel
4X Bolt™ LDS Sample Buffer	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	B0007	LDS sample loading buffer
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards	BioRad	1610375	Protein ladder
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer	ThermoFischer Scientific	B0002	PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-70001	Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	92632210
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	92632211
TAP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	CAB1001
Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8227
Sucrose	(Merck/Sigma-Aldrich)	84097	BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC)
DL-Dithiothreitol solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	43816	BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
Terumo Syringe 1CC/mL	Terumo Syringe	878499
Potassium chloride	(Merck/Sigma-Aldrich)	60128
HEPES	(Merck/Sigma-Aldrich)	H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	12003C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium	Sigma-Aldrich	D8662
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Tris hydrochloride	Merck/Sigma-Aldrich	10812846001
Sodium dodecyl sulfate	Merck/Sigma-Aldrich	436143
IGEPAL CA-630	Merck/Sigma-Aldrich	I3021
Rnasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111
Stainless steel grinding jar	Retsch	02.462.0059
MM400 mixer mill	Retsch	20.745.0001
Gradient Fractionator	Brandel	BRN-BR-188
Thermomixer R	Eppendorf	Z605271
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices	Eppendorf Safe-Lock	30121023
Mini Gel Tank	(Thermo Fisher Scientific)	A25977	PAGE running tank
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm	Beckman-Coulter	344057
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk	Beckman-Coulter	331372
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices	Merck	UFC5030	Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge	Cambridge Scientific	15566
Beckman Coulter Optima L-90K	GMI	8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2	Thermofisher Scientific	159910
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermofisher Scientific	14-432-22
25 mL Serological Pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1250
10 mL Serological Pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
DNA lobind tubes	Eppendorf	30108051
Cold Centrifuge 5810 R	Eppendorf	EP022628188	for 50 mL tubes
Orbital Shaking Incubator	Ratek	OM11
Frezco 17 Microcentrifuge	Thermofisher Scientific	75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108051
Eppendorf® Protein LoBind tubes	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108116
SW 41 Ti Swinging bucket rotor	Beckman-Coulter	331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L	Thermofisher Scientific	51026282
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe	BD Medical	328822
3 mL syringe with Luer Lok tip	BD Medical	302113
25 G x 16 mm Hypodermic Needle	Terumo	TUAN2516R1