Zebrafish blastoderm explants genereres ved å isolere embryonale celler fra endogene signalsentre i det tidlige embryoet, og produserer relativt naive celleklynger lett manipulert og dyrket ex vivo. Denne artikkelen gir instruksjoner for å lage slike utvisninger og demonstrerer deres nytte ved å forhøre roller for Nodal-signalering under gastrulation.
På grunn av deres optiske klarhet og raske utvikling er sebrafiskembryoer et utmerket system for å undersøke celleadferd og utviklingsprosesser. På grunn av kompleksiteten og redundansen til embryonale signaler kan det imidlertid være utfordrende å skjelne hele rollen til et enkelt signal under tidlig embryogenese. Ved å eksplantere dyreområdet til sebrafisk blastoderm, genereres relativt naive klynger av embryonale celler som lett kan dyrkes og manipuleres ex vivo. Ved å introdusere et gen av interesse ved RNA-injeksjon før eklantasjon, kan man vurdere effekten av dette molekylet på genuttrykk, celleatferd og andre utviklingsprosesser i relativ isolasjon. Videre kan celler fra embryoer av forskjellige genotyper eller tilstander kombineres i en enkelt chimeric explant for å undersøke celle / vev interaksjoner og vevsspesifikke genfunksjoner. Denne artikkelen gir instruksjoner for å generere sebrafisk blastoderm explants og viser at et enkelt signalmolekyl – en Nodal ligand – er tilstrekkelig til å indusere bakterielagdannelse og forlengelse morfogenese i ellers naive embryonale vev. På grunn av deres evne til å rekapitulere embryonal celleatferd, morfogengradienter og genuttrykksmønstre i et forenklet ex vivo-system, forventes disse explantene å være til stor nytte for mange sebrafiskforskere.
Et flerårig mål for utviklingsbiologifeltet er å avdekke kompleksiteten ved å utvikle embryoer for å forstå opprinnelsen til dyreform og funksjon. Selv tidlige embryoer inneholder en kompleks medley av signalmolekyler, celle- og vevsinteraksjoner og mekaniske krefter, alle underlagt streng romlig og tidsmessig regulering. Av denne grunn er det ofte utfordrende å finne den nøyaktige rollen til et bestemt signal i en utviklingsprosess av interesse. Ved å fjerne embryonalt vev fra deres endogene miljø, skaper embryoutvisning en forenklet plattform der man kan skjelne utviklingsrollene til individuelle vev og molekyler i relativ isolasjon. Eklantasjonsteknikker er kanskje mest kjent i Xenopus laevis, hvor de har blitt brukt til å studere vevsinduksjon, cellesignalering, celleadhesjon og morfogenese, blant andre prosesser1,2,3,4. Såkalte dyrehette utviser, hvor dyreområdet av blastula stadium Xenopus embryoer er isolert før induktive interaksjoner5,6,7, er en utbredt og kraftig explant teknikk. Umanipulerte dyrehetter er skjebnebestemt til å bli ectoderm7,8. Likevel er de kompetente til å reagere på flere induktive faktorer, slik at de kan danne vev av alle tre bakterielagene og gjennomgå vevstilpassede morfogenetiske bevegelser9,10,11. Imidlertid forhindrer begrensede genetiske verktøy og suboptimal egnethet for levende avbildning bruk av Xenopus dyretak for mange utviklingsbiologer. Ved å eksplantere blastodermceller fra sebrafiskembryoer, kan forskere kombinere nytten av dyretakanalysen med optisk klarhet, overflod av genetiske verktøy og andre eksperimentelle fordeler ved sebrafiskmodellsystemet.
Til dags dato har forskere benyttet seg av to smaker av sebrafiskutløp: såkalte pescoider og blastoderm explants. I pescoid-modellen er hele blastodermen, inkludert marginalsonen, isolert fra eggeplommen og får lov til å utvikle ex vivo uten det ekstraembryoniske eggeplommesynkrone laget (YSL)12,13. På denne måten har pescoider en bemerkelsesverdig likhet med Fundulus-explants generert for flere tiår siden av Jane Oppenheimer og J.P. Trinkaus14,15. Disse explants recapitulate mange aspekter av embryonal mønster og morfogenese12,13. Men fordi disse isolasjonene inneholder endogene signalsentre (embryonal margin), forenkles de ikke med hensyn til deres molekylære miljø. Alternativt kan forskere generere relativt naive sebrafisk blastoderm explants ved å ekskludere marginal sone16,17,18,19,20,21. Unmanipulated sebrafish blastoderm explants uttrykker høye nivåer av bein morfogenetisk protein (BMP) morfogenes19 og gir opphav til ikke-nevralt ektoderm og innhyllende lag (EVL) når dyrket ex vivo18. Imidlertid rekapitulerer de mange aspekter av aksial mønster og morfogenese som svar på eksogene signalgradienter19,20,21, som ligner på Xenopus dyrehetter. Av denne grunn er blastoderm explants en fordelaktig modell for å studere rollen som et gitt morfogen (eller morfogener) i bakterielagsspesifikasjon, morfogenetiske cellebevegelser og signalgradienter i et forenklet signalmiljø. Videre kan blastodermer fra embryoer av forskjellige genotyper eller forhold kombineres i en enkelt chimeric explant19,21 for å undersøke celle / vev autonomi og induktive interaksjoner.
Zebrafish blastoderm explants kan brukes til å undersøke rollen som embryonale signaler (for eksempel Nodal) i morfogenese og vevsspesifikasjon under gastrulation. Ved å injisere syntetisk ndr2 RNA (koding av en Nodal-ligand) i encellet stadium aktiveres Nodal-signalisering gjennom hele blastodermen til embryoet. Explants fra disse embryoene genererer Nodal signal gradienter, danner alle tre bakterielag, og gjennomgår konvergens og forlengelse (C&E) gastrulation bevegelser som sett i intakte embryoer20. I tillegg brukes chimeric explants til å illustrere mesodermvevets evne til å indusere nevroectoderm fra uinjisert (naiv) blastoderm. Denne protokollen gir instruksjoner for å lage sebrafisk blastoderm explants og demonstrerer deres nytte i å definere rollen som Nodal signalering i vevsinduksjon og morfogenese.
Denne artikkelen har beskrevet hvordan man genererer sebrafisk blastoderm explants og diskuterte to praktiske anvendelser av disse explants i å adressere rollen som Nodal morfogen signalering i gastrulation. Denne metoden for å kutte og dyrke explants gir en blank skifer av naive celler som kan manipuleres ved hjelp av RNA-injeksjoner og behandling med små molekylforbindelser for å undersøke en molekylær vei av interesse.
Kritiske trinn
Det er fire trinn i denne protokollen som er spesielt kritiske for suksessen. Den første injiserer embryoene med riktig mengde Nodal. Denne protokollen anbefaler 10 pg ndr2 RNA, og selv om en rekke doser fremmer forlengelse, vil for mye eller for lite Nodal forhindre optimal utvisningsforlengelse20. Det andre trinnet er å dechorionating embryoene. Hvis embryoene forblir i pronase for lenge, vil eggeplommene briste, og embryoene vil ikke være levedyktige å kutte. Hvis de ikke er i pronase lenge nok, vil korionene ikke løsnes ved vask og vil i stedet kreve tidkrevende manuell dechorionation. Det tredje kritiske trinnet er å kutte uttredingene. Kutting i 3x Danieaus løsning anbefales, da det lavere saltinnholdet i 0,3x Danieaus løsning eller eggvann ikke fremmer helbredelse og overlevelse av explants.
I tillegg må uttrenglene kuttes på omtrent halvparten av blastodermens høyde for å sikre cellenes naivitet. Hvis de kuttes for nær eggeplommen, vil de inneholde signaler fra marginen (inkludert endogene Nodal) som fremmer vevsspesifikasjon og morfogenese. Det fjerde og siste kritiske trinnet er i helbredelsen av chimeric explants. To eksplanter vil ikke smelte sammen for å danne chimeras med mindre deres kuttede kanter presses forsiktig sammen umiddelbart etter at de er kuttet.
Endringer og feilsøking
De kritiske trinnene som er beskrevet ovenfor, gir muligheter for feilsøking. Noen vanlige problemstillinger og foreslåtte løsninger presenteres nedenfor.
Hvis utvisning ikke strekker seg i nærvær av Nodal-signalering, er det noen mulige løsninger. (A) Injiser embryoer i encellet stadium for å sikre at RNA er jevnt spredt gjennom hele embryoet. (B) Unngå å injisere for mye nodal RNA ved å sørge for at det injiserte volumet er riktig ved hjelp av et mikrometer for å måle injeksjonsbolusen. (C) Unngå å injisere for lite nodal RNA ved å måle konsentrasjonen for å sikre at den ikke har blitt forringet. (D) Hold noen alderstilpassede intakte søsken for å utlede det tilsvarende stadiet av uttømmelsene. Explants oppnår maksimal forlengelse når intakte søsken når 2-5 somite scenen. Hvis utløpslene samles for tidlig, vil den optimale utvidelsen ikke nås.
Hvis eggeplommene brister etter dechorionation, og embryoene ikke er levedyktige å kutte, fjern embryoene fra pronaseoppløsningen når korionene begynner å krympe og 1-2 embryoer kaster sin korion. Skyll deretter umiddelbart i eggvann.
Hvis uttømmerne vises boblende rundt kantene, er det noen løsninger. (A) Klipp utløp bare innenfor en bestemt tidsramme for utvikling. Selv om explants kuttet når som helst fra 128- til 1000-cellers stadier kan overleve og strekke seg i kultur, har de kuttet på 256- til 512-cellestadier en tendens til å være de mest robuste. (B) Påse at explants kuttes i 3x Danieaus løsning for å sikre riktig helbredelse. (C) Skjær utløpene rent, men forsiktig. Unngå å strekke eller trekke cellene fra hverandre under skjæreprosessen.
Hvis de uinninnvidde kontrollutløpene forlenges, vil det sannsynligvis bli kuttet for nær eggeplommen. For at utplanterne skal være naive, må du sørge for at kuttene gjøres halvveis mellom eggeplommen og toppen av blastodermen.
Hvis chimeric explants ikke klarer å smelte, er det sannsynlig fordi tendensen til explants i 3x Danieau løsning når kuttet er å runde opp og helbrede over kuttkanten. For å sikre at de to blastodermene helbreder til hverandre i stedet for seg selv, trykk dem sammen umiddelbart etter kutting. Bruk tang for å bruke forsiktig trykk på de nylig sammenføyde blastodermene i agarose godt for å oppmuntre dem til å helbrede sammen.
Begrensninger
Selv om disse utvisningene er et verdifullt verktøy for å studere rollen som et gitt morfogen (eller et annet molekyl av interesse) i relativ isolasjon, må observasjoner gjort i enhver ex vivo-modell tolkes med forsiktighet. Explants viser C &E morfogenese som er svært lik den observerte in vivo20, men de recapitulaterer ikke alle aspekter av gastrulation, for eksempel epiboly bevegelser. De mangler også mange andre regulatoriske faktorer og signalmolekyler som er til stede i et intakt embryo. Selv om dette er en betydelig eksperimentell fordel med explants, kan det også føre til konklusjoner som ikke holder in vivo. For eksempel, siden explants som ikke mottar eksogene Nodal ligander ikke klarer å uttrykke neuroectoderm markører, kan man konkludere fra explants alene at Nodal signalering er nødvendig for neuroectoderm spesifikasjon. Imidlertid dannes nevroectoderm i intakte embryoer som mangler all Nodal-signalering23,24, som demonstrerer den vitale rollen til andre signalmolekyler i nevral spesifikasjon32. Explants kan fortelle oss hva et morfin er i stand til i et isolert miljø. Likevel bør alle slike funn bekreftes i/sammenlignet med intakte embryoer for at resultatene skal tolkes grundig. Med andre ord, explants kan ikke ta plassen til et utviklende embryo. I stedet er de et supplerende verktøy for å identifisere rollen og forholdet til et morfogen med omgivelsene. Med disse begrensningene i tankene er sebrafisk blastoderm explants et verdifullt verktøy for mange forskningsspørsmål.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Med fornyet interesse for syntetisk embryologi brukes flere ex vivo- og in vitro-tilnærminger regelmessig for å modellere aspekter av embryonal utvikling. For eksempel kan 2- og 3-dimensjonale gastruloider som består av mus eller humane embryonale / induserte pluripotente stamceller koaksialiseres, ved bruk av eksogene signalmolekyler, for å rekapitulere noen av mønstrene og / eller morfogenetiske hendelsene i gang, segmentering og kastrering33,34,35,36,37 . Selv om de er kraftige, krever disse metodene arbeidskrevende og langvarige kulturmetoder for både kontinuerlig å opprettholde pluripotente stamceller og å dyrke gastruloider, noe som tar mange dager å nå gastrulation stadier. Til sammenligning krever sebrafiskplanter ikke vedlikehold av stamcellekulturer, da embryoer bare samles etter behov. De er relativt enkle å generere og nå gastrulation stadier i løpet av timer, det samme som sebrafisk embryoer. Dette fremhever en annen fordel med sebrafiskutløp, deres intakte utviklingsklokke. Fordi utviklingsalderen til embryonale og induserte pluripotente stamceller kan være variabel og svært omdiskutert, er embryonale explants kanskje bedre egnet til å undersøke tidsregulering av utvikling. Til slutt, mens pescoid sebrafisk utviser (som inneholder embryonal margin) strekker seg tilsvarende i kultur12,13, gjør de det som svar på endogene signalsentre. I stedet gjør utplanterne som er beskrevet her, det mulig for forskere å undersøke molekyler av interesse med relativt lite forstyrrelse fra slike embryonale signaler.
Potensielle fremtidige programmer
Her ble det brukt explants for å demonstrere at Nodal signalisering er nødvendig og tilstrekkelig for C&E morfogenese. Likevel forventes det at de kan og vil bli brukt til å skjelne rollen til mange forskjellige molekyler i mange andre utviklingsprosesser, for eksempel regulering av genuttrykk, signalgradienter og ytterligere morfogenetiske programmer. I tillegg, fordi disse explants er levedyktige til minst 24 hpf19, kan det forventes at deres nytte vil strekke seg utover gastrulation i prosesser som segmentering og organogenese, enhver prosess der forskere ønsker en utviklingsmessig blank skifer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NICHD R00HD091386 til MLKW og av NIEHS T32ES027801 til AAE.
1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
6-well plates | Fisher | FB012927 | |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
HEPES | VWR | JT4018-1 | |
Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
KCl | VWR | BDH9258-500G | |
Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
Mineral oil | VWR | MK635704 | |
NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
Tween-20 | VWR | 200002-836 |