Les explantes de blastoderme de poisson-zèbre sont générées en isolant des cellules embryonnaires des centres de signalisation endogènes au sein de l’embryon précoce, produisant des amas cellulaires relativement naïfs facilement manipulables et cultivés ex vivo. Cet article fournit des instructions pour la fabrication de telles explants et démontre leur utilité en interrogeant les rôles de la signalisation nodale pendant la gastrulation.
En raison de leur clarté optique et de leur développement rapide, les embryons de poisson-zèbre sont un excellent système pour examiner les comportements cellulaires et les processus de développement. Cependant, en raison de la complexité et de la redondance des signaux embryonnaires, il peut être difficile de discerner le rôle complet d’un signal unique au cours de l’embryogenèse précoce. En explantant la région animale du blastoderme du poisson-zèbre, des grappes relativement naïves de cellules embryonnaires sont générées qui peuvent être facilement cultivées et manipulées ex vivo. En introduisant un gène d’intérêt par injection d’ARN avant l’explantation, on peut évaluer l’effet de cette molécule sur l’expression des gènes, les comportements cellulaires et d’autres processus de développement dans un isolement relatif. En outre, les cellules d’embryons de différents génotypes ou conditions peuvent être combinées en une seule explante chimérique pour examiner les interactions cellule/tissu et les fonctions géniques spécifiques aux tissus. Cet article fournit des instructions pour générer des explantes de blastoderme de poisson-zèbre et démontre qu’une seule molécule de signalisation – un ligand nodal – est suffisante pour induire la formation de couche germinale et la morphogenèse d’extension dans des tissus embryonnaires autrement naïfs. En raison de leur capacité à récapituler les comportements des cellules embryonnaires, les gradients morphogènes et les modèles d’expression génique dans un système ex vivo simplifié, ces explants devraient être d’une grande utilité pour de nombreux chercheurs sur le poisson-zèbre.
Un objectif permanent du domaine de la biologie du développement est de démêler la complexité du développement des embryons pour comprendre l’origine de la forme et de la fonction animales. Même les embryons précoces contiennent un mélange complexe de molécules de signalisation, d’interactions cellulaires et tissulaires et de forces mécaniques, tous soumis à une régulation spatiale et temporelle stricte. Pour cette raison, il est souvent difficile d’identifier le rôle précis d’un signal particulier dans un processus de développement d’intérêt. En retirant les tissus embryonnaires de leur environnement endogène, l’explantation d’embryons crée une plate-forme simplifiée permettant de discerner les rôles développementaux des tissus et des molécules individuels dans un isolement relatif. Les techniques d’explantation sont peut-être mieux connues dans Xenopus laevis, où elles ont été utilisées pour étudier l’induction tissulaire, la signalisation cellulaire, l’adhésion cellulaire et la morphogenèse, entre autres processus1,2,3,4. Les explants dits de capuchon animal, dans lesquels la région animale des embryons de Xenopus au stade de blastula est isolée avant les interactions inductives5,6,7, sont une technique d’explantation répandue et puissante. Les capuchons d’animaux non manipulés sont destinés à devenir ectodermes7,8. Pourtant, ils sont capables de répondre à plusieurs facteurs inductifs, ce qui leur permet de former des tissus des trois couches germinales et de subir des mouvements morphogénétiques appropriés aux tissus9,10,11. Cependant, des outils génétiques limités et une aptitude sous-optimale à l’imagerie vivante empêchent l’utilisation d’explants de capuchon animal Xenopus pour de nombreux biologistes du développement. En explantant des cellules de blastoderme à partir d’embryons de poisson zèbre, les chercheurs peuvent combiner l’utilité du test de la calotte animale avec la clarté optique, l’abondance d’outils génétiques et d’autres avantages expérimentaux du système modèle du poisson-zèbre.
À ce jour, les chercheurs ont utilisé deux saveurs d’explants de poisson zèbre: les soi-disant pescoïdes et les explants de blastoderme. Dans le modèle pescoïde, l’ensemble du blastoderme, y compris la zone marginale, est isolé du jaune et autorisé à se développer ex vivo sans la couche syncytiale extraembryonnaire du jaune (YSL)12,13. De cette façon, les pescoïdes ont une ressemblance notable avec les explants fundulus générés il y a des décennies par Jane Oppenheimer et J.P. Trinkaus14,15. Ces explantes récapitulent de nombreux aspects du modelage embryonnaire et de la morphogenèse12,13. Cependant, comme ces isolats contiennent des centres de signalisation endogènes (la marge embryonnaire), ils ne sont pas simplifiés en ce qui concerne leur milieu moléculaire. Alternativement, les chercheurs peuvent générer des explants de blastoderme de poisson zèbre relativement naïfs en excluant lazone marginale16,17, 18,19,20,21. Les explants blastodermiques de poisson zèbre non manipulés expriment des niveaux élevés de morphogènes de protéine morphogénétique osseuse (BMP)19 et donnent naissance à un ectoderme non neural et à une couche enveloppante (EVL) lorsqu’ils sont cultivés ex vivo18. Cependant, ils récapitulent de nombreux aspects du modelage axial et de la morphogenèse en réponse à des gradients de signalisation exogènes19,20,21, similaires aux capuchons animaux Xenopus. Pour cette raison, les explantes de blastodermes sont un modèle avantageux pour étudier le rôle d’un morphogène (ou de morphogènes) donné dans la spécification de la couche germinale, les mouvements des cellules morphogénétiques et les gradients de signalisation dans un environnement de signalisation simplifié. En outre, les blastodermes d’embryons de différents génotypes ou conditions peuvent être combinés en une seule explante chimérique19,21 pour étudier l’autonomie cellule/tissu et les interactions inductives.
Les explantes de blastoderme de poisson-zèbre peuvent être utilisées pour étudier le rôle des signaux embryonnaires (par exemple, Nodal) dans la morphogenèse et la spécification tissulaire pendant la gastrulation. En injectant de l’ARN synthétique ndr2 (codant pour un ligand nodal) au stade unicellulaire, la signalisation nodale est activée dans tout le blastoderme de l’embryon. Les explants de ces embryons génèrent des gradients de signalisation nodale, forment les trois couches germinales et subissent des mouvements de gastrulation de convergence et d’extension (C & E) comme on le voit chez les embryons intacts20. De plus, les explantes chimériques sont utilisées pour illustrer la capacité des tissus mésodermiques à induire le neuroectoderme à partir d’un blastoderme nonjecté (naïf). Ce protocole fournit des instructions pour la création d’explants de blastoderme de poisson zèbre et démontre leur utilité dans la définition du rôle de la signalisation nodale dans l’induction tissulaire et la morphogenèse.
Cet article a décrit comment générer des explants de blastoderme de poisson zèbre et a discuté de deux applications pratiques de ces explants en abordant le rôle de la signalisation des morphogènes nodaux dans la gastrulation. Cette méthode de coupe et de culture des explants fournit une ardoise vierge de cellules naïves qui peuvent être manipulées à l’aide d’injections d’ARN et d’un traitement avec de petits composés moléculaires pour étudier une voie moléculaire d’intérêt.
Étapes critiques
Il y a quatre étapes dans ce protocole qui sont particulièrement critiques pour son succès. La première consiste à injecter aux embryons la quantité appropriée de Nodal. Ce protocole recommande 10 pg d’ARN ndr2, et bien qu’une gamme de doses favorise l’extension, trop ou trop peu de Nodal empêchera une extension optimale de l’explantation20. La deuxième étape consiste à déséchorioner les embryons. Si les embryons restent trop longtemps dans la pronase, les jaunes éclateront et les embryons ne seront pas viables à couper. S’ils ne sont pas dans la pronase assez longtemps, les chorions ne seront pas desserrés par le lavage et nécessiteront plutôt une décchorionation manuelle fastidieuse. La troisième étape critique consiste à couper les explants. Il est recommandé de couper dans 3x la solution de Danieau, car la teneur en sel plus faible de 0,3x la solution de Danieau ou l’eau d’œuf ne favorise pas la guérison et la survie des explants.
De plus, les explantes doivent être coupées à environ la moitié de la hauteur du blastoderme pour assurer la naïveté des cellules. S’ils sont coupés trop près du jaune, ils contiendront des signaux de la marge (y compris le nodal endogène) qui favorisent la spécification tissulaire et la morphogenèse. La quatrième et dernière étape critique est la guérison des explants chimériques. Deux explants ne fusionnent pas pour former des chimères à moins que leurs bords coupés ne soient doucement pressés ensemble immédiatement après leur coupe.
Modifications et dépannage
Les étapes critiques décrites ci-dessus offrent des possibilités de dépannage. Certains problèmes courants et solutions proposées sont présentés ci-dessous.
Si les explants ne s’étendent pas en présence de signalisation nodale, il existe des solutions possibles. (A) Injecter des embryons au stade unicellulaire pour s’assurer que l’ARN est uniformément dispersé dans l’ensemble de l’embryon. (B) Évitez d’injecter trop d’ARN nodal en vous assurant que le volume injecté est correct à l’aide d’un micromètre pour mesurer le bolus d’injection. (C) Évitez d’injecter trop peu d’ARN nodal en mesurant sa concentration pour s’assurer qu’il ne s’est pas dégradé. (D) Gardez des frères et sœurs intacts appariés selon l’âge pour déduire le stade équivalent des explants. Les explants atteignent une extension maximale lorsque les frères et sœurs intacts atteignent le stade de 2 à 5 somites. Si les explants sont collectés trop tôt, l’extension optimale ne sera pas atteinte.
Si les jaunes éclatent après la déschorionation et que les embryons ne sont pas viables à couper, retirez les embryons de la solution de pronase une fois que les chorions commencent à se froisser et que 1-2 embryons perdent leur chorion. Ensuite, rincez immédiatement à l’eau d’œuf.
Si les explants apparaissent pétillants sur les bords, il existe des solutions. (A) Couper les explants uniquement dans un délai de développement spécifique. Bien que les explants coupés à n’importe quel stade de 128 à 1000 cellules puissent survivre et s’étendre en culture, ceux coupés à des stades de 256 à 512 cellules ont tendance à être les plus robustes. (B) S’assurer que les explants sont coupés dans la solution de 3x Danieau pour assurer une bonne cicatrisation. (C) Couper les explantations proprement mais doucement. Évitez d’étirer ou de séparer les cellules pendant le processus de coupe.
Si les explants témoins non injectés s’étendent, les explants étaient susceptibles de couper trop près du jaune. Pour que les explantations soient naïves, assurez-vous que les coupes sont faites à mi-chemin entre le jaune et le haut du blastoderme.
Si les explants chimériques ne parviennent pas à fusionner, c’est probablement parce que la tendance des explants dans la solution de 3x Danieau une fois coupées est d’arrondir et de guérir sur le bord coupé. Pour vous assurer que les deux blastodermes guérissent l’un à l’autre plutôt qu’à eux-mêmes, pressez-les ensemble immédiatement après la coupe. Utilisez des pinces pour appliquer une légère pression sur les blastodermes nouvellement joints dans le puits d’agarose afin de les encourager à guérir ensemble.
Limitations
Bien que ces explants soient un outil précieux pour étudier le rôle d’un morphogène donné (ou d’une autre molécule d’intérêt) dans un isolement relatif, les observations faites dans tout modèle ex vivo doivent être interprétées avec soin. Les explantes présentent une morphogenèse C & E très similaire à celle observée in vivo20, mais elles ne récapitulent pas tous les aspects de la gastrulation, par exemple les mouvements épibulaires. Ils manquent également de nombreux autres facteurs régulateurs et molécules de signalisation présents dans un embryon intact. Bien qu’il s’agit d’un avantage expérimental significatif des explants, cela peut également conduire à des conclusions qui ne tiennent pas in vivo. Par exemple, étant donné que les explants qui ne reçoivent pas de ligands nodaux exogènes ne parviennent pas à exprimer les marqueurs neuroectodermiques, on pourrait conclure à partir des explants seuls que la signalisation nodale est nécessaire pour la spécification du neuroectoderme. Cependant, le neuroectoderme se forme au sein d’embryons intacts dépourvus de toute signalisation nodale23,24,démontrant le rôle vital d’autres molécules de signalisation dans la spécification neuronale32. Les explants peuvent nous dire de quoi un morphogène est capable dans un environnement isolé. Néanmoins, tous ces résultats doivent être confirmés dans / par rapport aux embryons intacts pour que les résultats soient interprétés à fond. En d’autres termes, les explants ne peuvent pas prendre la place d’un embryon en développement. Au lieu de cela, ils sont un outil supplémentaire pour identifier le rôle et la relation d’un morphogène avec l’environnement. Avec ces limitations à l’esprit, les explants de blastoderme de poisson zèbre sont un outil précieux pour de nombreuses questions de recherche.
Importance par rapport aux méthodes existantes
Avec un regain d’intérêt pour l’embryologie synthétique, plusieurs approches ex vivo et in vitro sont régulièrement utilisées pour modéliser des aspects du développement embryonnaire. Par exemple, des gastruloïdes à 2 et 3 dimensions composés de cellules souches pluripotentes embryonnaires / induites de souris ou d’humains peuvent être amadoués, par l’application de molécules de signalisation exogènes, pour récapituler certains des événements de motif et / ou de morphogénétique de la gastrulation, de la segmentation et de la neurulation33,34,35,36,37 . Bien que puissantes, ces méthodes nécessitent des méthodes de culture laborieuses et prolongées pour maintenir en permanence les cellules souches pluripotentes et pour développer des gastruloïdes, qui prennent plusieurs jours pour atteindre les stades de gastrulation. En revanche, les explants de poisson zèbre ne nécessitent aucun entretien des cultures de cellules souches, car les embryons sont simplement collectés au besoin. Ils sont relativement simples à générer et à atteindre les stades de gastrulation en quelques heures, tout comme les embryons de poisson zèbre. Cela met en évidence un autre avantage des explants de poisson zèbre, leur horloge de développement intacte. Parce que l’âge de développement des cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites peut être variable et très débattu, les explantes embryonnaires sont peut-être mieux adaptées pour étudier la régulation temporelle du développement. Enfin, alors que les explantes de poisson zèbre pescoïde (qui contiennent la marge embryonnaire) s’étendent de la même manière dans la culture12,13, elles le font en réponse à des centres de signalisation endogènes. Au lieu de cela, les explants décrits ici permettent aux chercheurs d’étudier les molécules d’intérêt avec relativement peu d’interférences de tels signaux embryonnaires.
Applications futures potentielles
Ici, les explants ont été utilisés pour démontrer que la signalisation nodale est nécessaire et suffisante pour la morphogenèse C & E. Néanmoins, on s’attend à ce qu’ils puissent et seront utilisés pour discerner le rôle de nombreuses molécules différentes dans de nombreux autres processus de développement, par exemple, la régulation de l’expression des gènes, les gradients de signalisation et d’autres programmes morphogénétiques. De plus, parce que ces explants sont viables jusqu’à au moins 24 hpf19, on peut s’attendre à ce que leur utilité s’étende au-delà de la gastrulation dans des processus tels que la segmentation et l’organogenèse, tout processus dans lequel les chercheurs souhaitent une ardoise vierge de développement.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par NICHD R00HD091386 à MLKW et par NIEHS T32ES027801 à AAE.
1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
6-well plates | Fisher | FB012927 | |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
HEPES | VWR | JT4018-1 | |
Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
KCl | VWR | BDH9258-500G | |
Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
Mineral oil | VWR | MK635704 | |
NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
Tween-20 | VWR | 200002-836 |