Summary
Zebrafish blastoderm explants genereres ved å isolere embryonale celler fra endogene signalsentre i det tidlige embryoet, og produserer relativt naive celleklynger lett manipulert og dyrket ex vivo. Denne artikkelen gir instruksjoner for å lage slike utvisninger og demonstrerer deres nytte ved å forhøre roller for Nodal-signalering under gastrulation.
Abstract
På grunn av deres optiske klarhet og raske utvikling er sebrafiskembryoer et utmerket system for å undersøke celleadferd og utviklingsprosesser. På grunn av kompleksiteten og redundansen til embryonale signaler kan det imidlertid være utfordrende å skjelne hele rollen til et enkelt signal under tidlig embryogenese. Ved å eksplantere dyreområdet til sebrafisk blastoderm, genereres relativt naive klynger av embryonale celler som lett kan dyrkes og manipuleres ex vivo. Ved å introdusere et gen av interesse ved RNA-injeksjon før eklantasjon, kan man vurdere effekten av dette molekylet på genuttrykk, celleatferd og andre utviklingsprosesser i relativ isolasjon. Videre kan celler fra embryoer av forskjellige genotyper eller tilstander kombineres i en enkelt chimeric explant for å undersøke celle / vev interaksjoner og vevsspesifikke genfunksjoner. Denne artikkelen gir instruksjoner for å generere sebrafisk blastoderm explants og viser at et enkelt signalmolekyl - en Nodal ligand - er tilstrekkelig til å indusere bakterielagdannelse og forlengelse morfogenese i ellers naive embryonale vev. På grunn av deres evne til å rekapitulere embryonal celleatferd, morfogengradienter og genuttrykksmønstre i et forenklet ex vivo-system, forventes disse explantene å være til stor nytte for mange sebrafiskforskere.
Introduction
Et flerårig mål for utviklingsbiologifeltet er å avdekke kompleksiteten ved å utvikle embryoer for å forstå opprinnelsen til dyreform og funksjon. Selv tidlige embryoer inneholder en kompleks medley av signalmolekyler, celle- og vevsinteraksjoner og mekaniske krefter, alle underlagt streng romlig og tidsmessig regulering. Av denne grunn er det ofte utfordrende å finne den nøyaktige rollen til et bestemt signal i en utviklingsprosess av interesse. Ved å fjerne embryonalt vev fra deres endogene miljø, skaper embryoutvisning en forenklet plattform der man kan skjelne utviklingsrollene til individuelle vev og molekyler i relativ isolasjon. Eklantasjonsteknikker er kanskje mest kjent i Xenopus laevis, hvor de har blitt brukt til å studere vevsinduksjon, cellesignalering, celleadhesjon og morfogenese, blant andre prosesser1,2,3,4. Såkalte dyrehette utviser, hvor dyreområdet av blastula stadium Xenopus embryoer er isolert før induktive interaksjoner5,6,7, er en utbredt og kraftig explant teknikk. Umanipulerte dyrehetter er skjebnebestemt til å bli ectoderm7,8. Likevel er de kompetente til å reagere på flere induktive faktorer, slik at de kan danne vev av alle tre bakterielagene og gjennomgå vevstilpassede morfogenetiske bevegelser9,10,11. Imidlertid forhindrer begrensede genetiske verktøy og suboptimal egnethet for levende avbildning bruk av Xenopus dyretak for mange utviklingsbiologer. Ved å eksplantere blastodermceller fra sebrafiskembryoer, kan forskere kombinere nytten av dyretakanalysen med optisk klarhet, overflod av genetiske verktøy og andre eksperimentelle fordeler ved sebrafiskmodellsystemet.
Til dags dato har forskere benyttet seg av to smaker av sebrafiskutløp: såkalte pescoider og blastoderm explants. I pescoid-modellen er hele blastodermen, inkludert marginalsonen, isolert fra eggeplommen og får lov til å utvikle ex vivo uten det ekstraembryoniske eggeplommesynkrone laget (YSL)12,13. På denne måten har pescoider en bemerkelsesverdig likhet med Fundulus-explants generert for flere tiår siden av Jane Oppenheimer og J.P. Trinkaus14,15. Disse explants recapitulate mange aspekter av embryonal mønster og morfogenese12,13. Men fordi disse isolasjonene inneholder endogene signalsentre (embryonal margin), forenkles de ikke med hensyn til deres molekylære miljø. Alternativt kan forskere generere relativt naive sebrafisk blastoderm explants ved å ekskludere marginal sone16,17,18,19,20,21. Unmanipulated sebrafish blastoderm explants uttrykker høye nivåer av bein morfogenetisk protein (BMP) morfogenes19 og gir opphav til ikke-nevralt ektoderm og innhyllende lag (EVL) når dyrket ex vivo18. Imidlertid rekapitulerer de mange aspekter av aksial mønster og morfogenese som svar på eksogene signalgradienter19,20,21, som ligner på Xenopus dyrehetter. Av denne grunn er blastoderm explants en fordelaktig modell for å studere rollen som et gitt morfogen (eller morfogener) i bakterielagsspesifikasjon, morfogenetiske cellebevegelser og signalgradienter i et forenklet signalmiljø. Videre kan blastodermer fra embryoer av forskjellige genotyper eller forhold kombineres i en enkelt chimeric explant19,21 for å undersøke celle / vev autonomi og induktive interaksjoner.
Zebrafish blastoderm explants kan brukes til å undersøke rollen som embryonale signaler (for eksempel Nodal) i morfogenese og vevsspesifikasjon under gastrulation. Ved å injisere syntetisk ndr2 RNA (koding av en Nodal-ligand) i encellet stadium aktiveres Nodal-signalisering gjennom hele blastodermen til embryoet. Explants fra disse embryoene genererer Nodal signal gradienter, danner alle tre bakterielag, og gjennomgår konvergens og forlengelse (C&E) gastrulation bevegelser som sett i intakte embryoer20. I tillegg brukes chimeric explants til å illustrere mesodermvevets evne til å indusere nevroectoderm fra uinjisert (naiv) blastoderm. Denne protokollen gir instruksjoner for å lage sebrafisk blastoderm explants og demonstrerer deres nytte i å definere rollen som Nodal signalering i vevsinduksjon og morfogenese.
Protocol
1 Klargjør reagensene og forsyningene
- Reagens forberedelse
- Forbered 500 ml 3x Danieaus løsning (løsning 1, tabell 1).
- Forbered 1 L eggvann (løsning 2, tabell 1).
- Forbered en 1,2% løsning av agarose i eggvann. Smelt agarose helt i mikrobølgeovnen, og avkjøl deretter til 55 °C i et vannbad.
- Klargjør 4 ml utvisningsmedier (løsning 3, tabell 1, endret litt fra19,21) per eksperimentell tilstand.
MERK: Husk å gjøre rede for minst én brønn med utvisning fra uinjiserte (eller kontrollinjiserte) embryoer ved beregning av ønsket volum.- Desinfiser arbeidsområdet med 70% etanol.
- Fjern cellekulturmedier fra 4 °C og spray/tørk av med 70 % etanol.
- Lag explant media og plasser i 28.5 °C inkubatoren for å varme mens embryoene injiseres.
MERK: Inkluder alltid alderstilpassede, intakte søskenembryoer for iscenesettelsesformål. Dechorionate disse embryoer og kultur dem på agarose-belagte plater i 0,3x Danieau løsning (Løsning 4, Tabell 1).
- Fjern pronase aliquots (1 ml ved 20 mg/ml) fra -20 °C og la det tine på is. Tine en 1 ml aliquot for hver tredje eksperimentelle forhold.
- Forbered agaroseplater
- Lag injeksjonsplatene.
- Fyll en 100 mm x 15 mm plast Petri-tallerken halvveis med smeltet agarose i eggvann.
- Plasser injeksjonsformen forsiktig på toppen av den smeltede agarose i en 45 ° vinkel og senk den gradvis inn i agarose, og sørg for at ingen bobler er fanget under. La det avkjøles helt.
- Fjern formen. Bruk platen umiddelbart eller spar til senere ved å tilsette 2 ml eggvann, pakke platen og lagre den ved 4 °C. Varm platen i 15-30 min i 28,5 °C inkubatoren før injeksjon.
- Lag utplantende skjæreplater.
- Tilsett 3 ml smeltet 1,2% agarose i eggvann til en 60 mm x 15 mm Petri-tallerken, og sørg for at hele bunnen av brønnen er belagt. La det avkjøles helt.
- Frakk kulturplater med agarose.
- For hver eksperimentell tilstand, dispenser 1 ml smeltet 1,2% agarose i eggvann i en brønn av en 6-brønns plate, og sørg for at hele bunnen av brønnen er belagt. La det avkjøles helt.
- For å lage chimeric explants, lag en utplantende skjærefat med små brønner ved å tilsette tolv 1 mm glassperler til smeltet agarose i en 60 mm x 15 mm Petri-tallerken. Fjern perlene med tang når agarose avkjøles helt.
- Lag injeksjonsplatene.
2 Injiser embryoer med RNA
- Bruk hansker, fjern et aliquot syntetisk ndr2 mRNA fra lagring ved -80 °C og legg det umiddelbart på is.
- Forbered injeksjonsnålen.
- Fyll en trukket glasskapillær nål med RNA. Plasser den fylte nålen i en mikromanipulator og bryt spissen av nålen med tang.
- Kalibrer injeksjonsvolumet ved hjelp av et scenemikrometer med en dråpe mineralolje, justere injeksjonstid og trykk på den pneumatiske injektoren for å oppnå en bolus av ønsket størrelse. En bolus med en diameter på 120 μm har et volum på 1 nL.
MERK: Ønsket volum av bolus vil avhenge av konsentrasjonen av RNA og ønsket dose per embryo. For eksempel, hvis RNA er aliquoted ved 10 ng / μL, injiser 1 nL for å oppnå en endelig mengde på 10 pg.- Hold RNA-nålespissen nedsenket i oljen til den er klar til å injiseres.
- Last embryoene og injiser.
- Trekk skilleveggene i avlstanker, la fisk gyte i 10-15 min, og samle embryoene ved hjelp av en tesil.
- Last embryoene inn i injeksjonsplaten ved hjelp av en Pasteur pipette og pipettepumpe, og bruk deretter en hanskefinger til å presse eggene forsiktig inn i troughs.
- Injiser 10 pg ndr2 RNA i eggeplommen av encellede embryoer til ønsket antall embryoer er nådd eller til embryoer begynner å dele seg.
MERK: Ikke injiser etter encellet stadium for å sikre jevn fordeling av RNA gjennom hele embryoet. - Vask embryoene ut av injeksjonsplaten i en merket 100 mm x 15 mm Petri-tallerken med en mild strøm av eggvann fra en klemmeflaske.
MERK: Hold alltid en gruppe alderstilpassede, uinnvidde søsken som kontroller. - Plasser embryoene i inkubatoren på 28,5 °C til de når 128-cellers stadium. Fjern unfertilized egg og døde embryoer fra parabolen.
3 Dechorionate embryoene
- Når embryoene har nådd 128-cellersstadiet, legg dem i merkede Petri-retter i glass og dekanter så mye eggvann som mulig fra dem.
- Etikett glass krystalliserende retter med lab tape (tilsvarende små tallerkennavn) og fyll 2/3 av veien med eggvann. Plasser disse rettene ved siden av dissekeringsmikroskopet for rask tilgjengelighet.
- Tilsett 1 ml pronasebestand (20 mg/ml, tint på is) til 15 ml 3x Danieaus oppløsning i et konisk rør på 50 ml.
MERK: Dette beløpet er tilstrekkelig for opptil tre eksperimentelle forhold. Øk volumet av pronase og 3x Danieaus løsning for ytterligere utvisningsforhold.
FORSIKTIG: Pronase er irriterende; Bruk derfor hansker ved håndtering. - Tilsett minst 5 ml pronaseoppløsning til hvert glass Petri-tallerken som inneholder embryoer.
- Agitate glasset retter i en sirkulær bevegelse, overvåke fremdriften av dechorionation konsekvent under en dissekering mikroskop.
- Når korionene begynner å rynke og 1-2 embryoer er ute av sine korioner, må du forsiktig dunke glass petriskålen som inneholder pronase og embryoene i den tilsvarende glasskrystalliseringsfatet som inneholder eggvann.
- Vask de dechorionated embryoer.
- Vask embryoene tre ganger med eggvann ved å forsiktig legge til og deretter dekantere eggvann fra parabolen.
- Den tredje og siste vasken er med 0,3x Danieaus løsning.
MERK: Hvis embryoene fortsatt har chorions etter vask, rør embryoene forsiktig til korionene er fjernet eller la dem sitte i vasken (eggvann eller 0,3x Danieaus løsning) i et minutt eller to og forsiktig røre med sirkulære bevegelser.
- Dekk dechorionated embryoer med et Petri parabolen lokk og returner dem til inkubatoren (28,5 °C) til de når 256-cellers stadium.
4 Kutt utplantninger
- Fyll den agarosebelagte 60 mm x 15 mm Petri-retten med 3x Danieaus oppløsning.
- Når embryoene er på 256-cellers stadium, overfør dem til den agarosebelagte platen som inneholder 3x Danieaus løsning, og fôr dem opp langs midten av parabolen.
- Klipp utløpslene med tang (figur 1).
- Bruk ett par tang, holdt lukket, for å stabilisere embryoet og bruk den andre til å skjære gjennom blastodermen i omtrent halvparten av høyden (fra margin til dyrestang) (Figur 1A).
- For å kutte, klem forsiktig blastodermcellene med ett par tang. Ta deretter de stabiliserende tangene og kjør dem langs de andre tangene for å skjære omtrent halvveis over blastodermen (figur 1B).
- Roter embryoet, plasser tangene i det eksisterende kuttet, og kutt deretter de resterende blastoderm ortogonale til det første kuttet (Figur 1C).
- Hold utplanter i 3x Danieaus løsning i minst 5 minutter for å helbrede, og overfør dem deretter til brønnen til en 6-brønns plate belagt med agarose og fylt med 4 ml explant media.
MERK: Klipp utviskninger fra uinninninnvidde (eller kontrollinnsprøytede) søsken som negative kontroller. Hvis explants utføres riktig, vil disse utvisningene verken utvide eller uttrykke markører av endoderm, mesoderm eller neuroectoderm. - Plasser de utplantelige kulturplatene i inkubatoren på 28,5 °C til ønsket tidspunkt/stadium (bestemt fra intakte søsken) er nådd.
MERK: Hvis du behandler eksplanter med en forbindelse, for eksempel en liten molekylhemmer, kan ønsket konsentrasjon legges direkte til ekslantmediet i brønnene på ønskede tidspunkter. Husk å inkludere volumet av agarose ved beregning av konsentrasjoner. (Eksempel: 1 ml agarose + 4 ml utvisningsmedier = 5 ml totalt volum per brønn).
5 Forbered chimeric explants
- I stedet for en vanlig agarosebelagt plate, kutt chimeric explants i en tallerken med agarose støpt i tolv små, grunne brønner ved hjelp av 1 mm glassperler (avsnitt 1.2.4). Fyll denne platen med 3x Danieaus løsning.
MERK: Chimeric explants genereres fra blastoderm celler av to embryoer av forskjellige genotyper eller forhold. Forsikre deg om at disse forholdene kan skille seg fra hverandre ved uttrykk for transgene eller injiserte fluorescerende markører.- Forbered ved å legge til tolv embryoer av en genotype/tilstand på venstre side av platen og tolv embryoer av den andre genotypen/tilstanden til høyre side av platen.
- Flytt ett embryo av hver tilstand inn i midten av platen, nær en av de 12 brønnene.
- Bruk tang, kutt en utvisning fra hvert embryo som beskrevet for enkelt embryoutløp (trinn 4.3).
- Trykk raskt de kuttede kantene på de to utterne sammen i den grunne brønnen ved hjelp av tang for å la de to halvdelene helbrede sammen til en enkelt utvisning.
- Fortsett med de resterende elleve brønnene innenfor platen. Når explants er helbredet, overfør dem til brønnen av en 6-brønns plate belagt med agarose og fylt med 4 ml explant media. Gjenta til ønsket antall uttjeninger er oppnådd.
6 Kultur og/eller bilde de faste uttredingene
- Kultur utviser i 28,5 °C inkubatoren til intakte søskenembryoer når ønsket stadium.
- Live explants kan monteres for kontinuerlig tidsforløpavbildning, avbildet med jevne mellomrom gjennom hele kulturperioden, eller avbildet live på det eksperimentelle endepunktet.
- Fest uttredingene hvis ønskelig. Når explants når ønsket endepunkt, noter scenen av intakte embryo søsken og plasser explants i et glass scintillation hetteglass med 1 ml 4% paraformaldehyd i PBS. Fest over natten på en shaker ved 4 °C.
FORSIKTIG: Paraformaldehyd er giftig. Bruk hansker ved håndtering av dette kjemikaliet og kast det ved hjelp av metoder som er godkjent av hver institusjon.- Etter fiksering, skyll utløp seks ganger, 15 min hver med PBS + 0,1% Tween-20, og dehydrer gradvis i metanol. Oppbevar eklanter ved -20 °C for senere analyse av helmontert in situ hybridisering, immunfluorescerende farging, etc.
Representative Results
Nodal ligander driver bakterielagsdannelse og C&E av sebrafisk blastoderm explants
Kontrollutløp kuttet fra uinjiserte wild-type (WT) embryoer eller de som injiseres med 50 pg mRNA-koding av grønt fluorescerende protein (GFP) forble avrundet gjennom kulturperioden (Figur 2A-C) og klarte ikke å uttrykke markører av mesoderm, endoderm eller neuroectoderm ( Figur3C)20. Sammen indikerer disse et fravær av morfogenese og bakterielagdannelse som karakteriserer virveldyr gastrulation. Imidlertid ble explants kuttet fra embryoer injisert med 10 pg ndr2 mRNA svært langstrakt etter 8-9 timer i kultur (Figur 2D). Live time-lapse avbildning av disse explants av differensial forstyrrende kontrast (DIC) mikroskopi avslørte at forlengelse utbrudd på eller rundt 8 h post-befruktning (HPF) (Figur 2F), samtidig som C &E morfogenese begynner i intakt sebrafish embryoer22. Explants kuttet fra MZoep-/- embryoer, som mangler den essensielle tdgf1 Nodal co-reseptor23, klarte ikke å strekke seg som svar på ndr2 injeksjon (Figur 2E), som viser at Nodal aktivitet er kritisk for denne ex vivo morphogenesis. I tillegg viste helmontert in situ hybridisering videre at ndr2-uttrykker ekspressmarkører for nevroectoderm (sox2) og flere mesoderm-undertyper (tbxta, noto, tbx16) (figur 2G), samt endoderm og den embryonalearrangøren 20.
Nodal signalering er ikke nødvendig for nevroectoderm induksjon av mesoderm
Nodal signalvirksomhet er avgjørende for induksjon av endoderm og mest mesoderm, men kan dispenseres for nevroectoderm spesifikasjon innen sebrafisk gastrulae23,24. Mens uinjiserte sebrafisk blastoderm explants ikke differensiert i nevroectoderm (Figur 3C18), utviser fra embryoer injisert med 10 pg ndr2 utvist robust uttrykk for neuroectoderm sox2 i distinkte striper langs den lange aksen av explant (Figur 2G), noe som indikerer at Nodal aktivitet er nødvendig for neuroectoderm formasjon ex vivo. Det har lenge vært kjent at mesodermalt vev kan indusere nevralt vev25,26,27,28,29, inkludert i sebrafisk blastoderm explants17. Det er imidlertid uklart om nevroectodermdannelse i dette explant-systemet krever Nodal-signalering direkte eller om eksogene Nodal-ligander induserer mesoderm som deretter induserer nevralt vev sekundært.
Chimeric explants som inneholder prospektiv mesoderm og neuroectoderm porsjoner fra to forskjellige embryoer ble generert for å teste om Nodal signalering er nødvendig vev-autonomt for neuroectoderm spesifikasjon ex vivo. Mesoderm-delen av hver explant ble kuttet fra et ellers WT-embryo som uttrykte en mesoderm-spesifikk transgen GFP-reporter, Tg[lhx1a:eGFP]30, injisert med en høy dose (100 pg) av ndr2 (Figur 3A). Den putative nevroektodermdelen av hver explant ble kuttet fra enten et kontroll WT-embryo eller Nodal som signaliserer mangelfull MZoep-/- embryo injisert bare med mRNA-koding av fluorescerende kjernefysisk markør H2B-RFP (Figur 3A). Hver chimeric explant ble generert ved å kombinere en blastoderm fra hver av disse to forholdene, som ble analysert for uttrykk for vevsspesifikke markører ved hel-mount in situ hybridisering ved 12 HPF.
Flertallet av enkelt-embryo explants fra embryoer injisert med 100 pg ndr2 uttrykt lite eller ingen sox2, og uttrykte markører av mesoderm, inkludert tbxta og lhx1a:gfp reporter-gjennom hele explant (Figur 3B,G). Uninjisert WT blastoderm (av den typen som består av den potensielle nevroectoderm delen av chimeric explants) uttrykte verken mesoderm markører eller sox2 når dyrket som en enkelt explant, noe som indikerer mangel på neuroectoderm og mesoderm spesifikasjon (Figur 3C, H). Enkelt-embryo utviser fra MZoep-/- embryoer manglet tilsvarende uttrykk for både nevroectoderm og mesoderm markører, selv når injisert med ndr2 (Figur 3D). Men når uinjiserte WT-blastodermer ble kombinert med mesoderm indusert av høye doser av Nodal-ligander, uttrykte disse chimeriske explantene både mesodermmarkører og sox2 robust (Figur 3E,I). Disse resultatene viser at, som tidligere observert17,26,27,29, mesoderm kan indusere nevral skjebne i celler som ellers ville bli ikke-nevralt ektoderm. For å teste om Nodal-signalisering er nødvendig direkte innenfor den potensielle nevroektodermdelen av disse utvisningene for deres nevrale induksjon, ble chimeriske eksletaner opprettet fra WT-blastodermer injisert med 100 pg ndr2 og blastodermer fra MZoep-/- embryoer (Figur 3J). Til tross for deres manglende evne til å motta Nodal-signaler fra den nærliggende mesodermale delen, uttrykte disse utvisningene sox2 i samme grad som WT-kontroll chimeras (figur 3F). Dette resultatet viser at i samsvar med intakte embryoer der nevrale vev er spesifisert i fravær av Nodal-aktivitet, er Nodal-signalering ikke nødvendig vev-autonomt for nevroectoderm induksjon ex vivo.
Figur 1: Prosedyre for utvisning avsebrafisk blastoderm (trinn 4.3). (A) Hold tangene i den ikke-dominerende hånden (oransje) lukket mot eggeplommen for å stabilisere embryoet mens du klemmer blastodermen i omtrent 1/2 av høyden ved hjelp av tangene i den dominerende hånden (blå). (B) Kjør de oransje tangene langs kanten av de blå tangene som griper embryoet for å skjære gjennom blastodermen slik at det første kuttet når omtrent halvveis over blastodermen. (C) Roter embryoet 90°, og plasser deretter de blå tangene inne (men ortogonale til) det opprinnelige kuttet og klem for å kutte den gjenværende blastodermen. (D) La utplantede blastodermceller leges i 3x Danieaus løsning i ca. 5 minutter før de overføres til explant media. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 (modifisert fra20): Nodal ligander fremmer C&E morfogenese og bakterielagdannelse i sebrafisk blastoderm explants. (A) Diagram over injeksjon og utvisning av sebrafisk embryoer. (B-E) Representative bright-field bilder av live blastoderm explants av de angitte forholdene / genotyper på tilsvarende 2-4 somite scenen. N = antall utprøvinger fra to til fire uavhengige forsøk. (F) Tidsforløp DIC-serie av en representativ utvisning fra et WT-embryo injisert med 10 pg ndr2 RNA. (G) Representative bilder av helmontert in situ hybridisering for transkripsjonene angitt i utvisning fra WT embryoer injisert med 10 pg ndr2 RNA. Skalastenger er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 (Modifisert fra31): Chimeric explants avslører at nevroectoderm spesifikasjon ikke krever vev-autonom Nodal signalering ex vivo. (A) Diagram over prosedyren for å generere chimeric sebrafish explants. (B-F) Helmontert in situ hybridisering for mesodermmarkøren tbxta (øverst) og neuroectoderm sox2 (bunn) i utvisning fra WT-embryoer injisert med 100 pg ndr2 RNA (B), unin WT-kontroller (C), MZoep-/- injisert med 10 pg ndr2 (D) og chimeriske utløp som inneholder nevroectoderm-deler fra WT (E) eller MZoep-/- (F ) embryoer tilsvarende 2-4 somittstadiet. Brøker angir antall uttjeninger med fenotypen vist over det totale antallet utprøvninger som er undersøkt. (G-J) Representative bilder av live Tg[lhx1a:gfp] utviser fra et enkelt embryo (G-H) eller kombinert med H2B-uttrykkende blastodermer (I-J, magenta) av forholdene som er angitt på tilsvarende 2-4 somite stadium. N = antall utvisning fra tre uavhengige forsøk. Skalastenger er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning 1 | Løsning 2 | Løsning 3 | Løsning 4 | |
| Løsning | 3x Danieau's | Egg vann | Utvisningsmedier | 0,3x Danieaus |
| Ingredienser | 174 mM NaCl | 60 μg/ml havsalter | DMEM/F12 + 2,5 mM L-Glutamin og 15 mM HEPES | 17,4 mM NaCl |
| 2,1 mM KCl | 1 L destillert vann | 3% totalt volum av newborn kalv serum eller foster bovine serum | 0,21 mM KCl | |
| 1,2 mM MgSO4. 7T2O | 1:200 Penicillin (50 enheter/ml)-Streptomycin (50 μg/ml) | 0,12 mM MgSO4•7H2O | ||
| 1,8 mM ca(NO3)2 •4H2O | 0,18 mM ca(NO3)2 •4H2O | |||
| 15 mM HEPES | Eksempel: | 1,5 mM HEPES | ||
| Destillert vann | 4 ml/tilstand x 9 Betingelser = 36 ml | Destillert vann | ||
| 1,08 ml nyfødt kalveserum (NCS, aliquoted i -20 °C (3 %) | ||||
| 0,18 ml 200x Penn-Strep (PS, aliquoted i -20 °C) (1:200) | ||||
| 35 ml DMEM/F12 |
Tabell 1.
Discussion
Denne artikkelen har beskrevet hvordan man genererer sebrafisk blastoderm explants og diskuterte to praktiske anvendelser av disse explants i å adressere rollen som Nodal morfogen signalering i gastrulation. Denne metoden for å kutte og dyrke explants gir en blank skifer av naive celler som kan manipuleres ved hjelp av RNA-injeksjoner og behandling med små molekylforbindelser for å undersøke en molekylær vei av interesse.
Kritiske trinn
Det er fire trinn i denne protokollen som er spesielt kritiske for suksessen. Den første injiserer embryoene med riktig mengde Nodal. Denne protokollen anbefaler 10 pg ndr2 RNA, og selv om en rekke doser fremmer forlengelse, vil for mye eller for lite Nodal forhindre optimal utvisningsforlengelse20. Det andre trinnet er å dechorionating embryoene. Hvis embryoene forblir i pronase for lenge, vil eggeplommene briste, og embryoene vil ikke være levedyktige å kutte. Hvis de ikke er i pronase lenge nok, vil korionene ikke løsnes ved vask og vil i stedet kreve tidkrevende manuell dechorionation. Det tredje kritiske trinnet er å kutte uttredingene. Kutting i 3x Danieaus løsning anbefales, da det lavere saltinnholdet i 0,3x Danieaus løsning eller eggvann ikke fremmer helbredelse og overlevelse av explants.
I tillegg må uttrenglene kuttes på omtrent halvparten av blastodermens høyde for å sikre cellenes naivitet. Hvis de kuttes for nær eggeplommen, vil de inneholde signaler fra marginen (inkludert endogene Nodal) som fremmer vevsspesifikasjon og morfogenese. Det fjerde og siste kritiske trinnet er i helbredelsen av chimeric explants. To eksplanter vil ikke smelte sammen for å danne chimeras med mindre deres kuttede kanter presses forsiktig sammen umiddelbart etter at de er kuttet.
Endringer og feilsøking
De kritiske trinnene som er beskrevet ovenfor, gir muligheter for feilsøking. Noen vanlige problemstillinger og foreslåtte løsninger presenteres nedenfor.
Hvis utvisning ikke strekker seg i nærvær av Nodal-signalering, er det noen mulige løsninger. (A) Injiser embryoer i encellet stadium for å sikre at RNA er jevnt spredt gjennom hele embryoet. (B) Unngå å injisere for mye nodal RNA ved å sørge for at det injiserte volumet er riktig ved hjelp av et mikrometer for å måle injeksjonsbolusen. (C) Unngå å injisere for lite nodal RNA ved å måle konsentrasjonen for å sikre at den ikke har blitt forringet. (D) Hold noen alderstilpassede intakte søsken for å utlede det tilsvarende stadiet av uttømmelsene. Explants oppnår maksimal forlengelse når intakte søsken når 2-5 somite scenen. Hvis utløpslene samles for tidlig, vil den optimale utvidelsen ikke nås.
Hvis eggeplommene brister etter dechorionation, og embryoene ikke er levedyktige å kutte, fjern embryoene fra pronaseoppløsningen når korionene begynner å krympe og 1-2 embryoer kaster sin korion. Skyll deretter umiddelbart i eggvann.
Hvis uttømmerne vises boblende rundt kantene, er det noen løsninger. (A) Klipp utløp bare innenfor en bestemt tidsramme for utvikling. Selv om explants kuttet når som helst fra 128- til 1000-cellers stadier kan overleve og strekke seg i kultur, har de kuttet på 256- til 512-cellestadier en tendens til å være de mest robuste. (B) Påse at explants kuttes i 3x Danieaus løsning for å sikre riktig helbredelse. (C) Skjær utløpene rent, men forsiktig. Unngå å strekke eller trekke cellene fra hverandre under skjæreprosessen.
Hvis de uinninnvidde kontrollutløpene forlenges, vil det sannsynligvis bli kuttet for nær eggeplommen. For at utplanterne skal være naive, må du sørge for at kuttene gjøres halvveis mellom eggeplommen og toppen av blastodermen.
Hvis chimeric explants ikke klarer å smelte, er det sannsynlig fordi tendensen til explants i 3x Danieau løsning når kuttet er å runde opp og helbrede over kuttkanten. For å sikre at de to blastodermene helbreder til hverandre i stedet for seg selv, trykk dem sammen umiddelbart etter kutting. Bruk tang for å bruke forsiktig trykk på de nylig sammenføyde blastodermene i agarose godt for å oppmuntre dem til å helbrede sammen.
Begrensninger
Selv om disse utvisningene er et verdifullt verktøy for å studere rollen som et gitt morfogen (eller et annet molekyl av interesse) i relativ isolasjon, må observasjoner gjort i enhver ex vivo-modell tolkes med forsiktighet. Explants viser C &E morfogenese som er svært lik den observerte in vivo20, men de recapitulaterer ikke alle aspekter av gastrulation, for eksempel epiboly bevegelser. De mangler også mange andre regulatoriske faktorer og signalmolekyler som er til stede i et intakt embryo. Selv om dette er en betydelig eksperimentell fordel med explants, kan det også føre til konklusjoner som ikke holder in vivo. For eksempel, siden explants som ikke mottar eksogene Nodal ligander ikke klarer å uttrykke neuroectoderm markører, kan man konkludere fra explants alene at Nodal signalering er nødvendig for neuroectoderm spesifikasjon. Imidlertid dannes nevroectoderm i intakte embryoer som mangler all Nodal-signalering23,24, som demonstrerer den vitale rollen til andre signalmolekyler i nevral spesifikasjon32. Explants kan fortelle oss hva et morfin er i stand til i et isolert miljø. Likevel bør alle slike funn bekreftes i/sammenlignet med intakte embryoer for at resultatene skal tolkes grundig. Med andre ord, explants kan ikke ta plassen til et utviklende embryo. I stedet er de et supplerende verktøy for å identifisere rollen og forholdet til et morfogen med omgivelsene. Med disse begrensningene i tankene er sebrafisk blastoderm explants et verdifullt verktøy for mange forskningsspørsmål.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Med fornyet interesse for syntetisk embryologi brukes flere ex vivo- og in vitro-tilnærminger regelmessig for å modellere aspekter av embryonal utvikling. For eksempel kan 2- og 3-dimensjonale gastruloider som består av mus eller humane embryonale / induserte pluripotente stamceller koaksialiseres, ved bruk av eksogene signalmolekyler, for å rekapitulere noen av mønstrene og / eller morfogenetiske hendelsene i gang, segmentering og kastrering33,34,35,36,37 . Selv om de er kraftige, krever disse metodene arbeidskrevende og langvarige kulturmetoder for både kontinuerlig å opprettholde pluripotente stamceller og å dyrke gastruloider, noe som tar mange dager å nå gastrulation stadier. Til sammenligning krever sebrafiskplanter ikke vedlikehold av stamcellekulturer, da embryoer bare samles etter behov. De er relativt enkle å generere og nå gastrulation stadier i løpet av timer, det samme som sebrafisk embryoer. Dette fremhever en annen fordel med sebrafiskutløp, deres intakte utviklingsklokke. Fordi utviklingsalderen til embryonale og induserte pluripotente stamceller kan være variabel og svært omdiskutert, er embryonale explants kanskje bedre egnet til å undersøke tidsregulering av utvikling. Til slutt, mens pescoid sebrafisk utviser (som inneholder embryonal margin) strekker seg tilsvarende i kultur12,13, gjør de det som svar på endogene signalsentre. I stedet gjør utplanterne som er beskrevet her, det mulig for forskere å undersøke molekyler av interesse med relativt lite forstyrrelse fra slike embryonale signaler.
Potensielle fremtidige programmer
Her ble det brukt explants for å demonstrere at Nodal signalisering er nødvendig og tilstrekkelig for C&E morfogenese. Likevel forventes det at de kan og vil bli brukt til å skjelne rollen til mange forskjellige molekyler i mange andre utviklingsprosesser, for eksempel regulering av genuttrykk, signalgradienter og ytterligere morfogenetiske programmer. I tillegg, fordi disse explants er levedyktige til minst 24 hpf19, kan det forventes at deres nytte vil strekke seg utover gastrulation i prosesser som segmentering og organogenese, enhver prosess der forskere ønsker en utviklingsmessig blank skifer.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NICHD R00HD091386 til MLKW og av NIEHS T32ES027801 til AAE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
| 6-well plates | Fisher | FB012927 | |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
| Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
| DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
| Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
| Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
| Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
| HEPES | VWR | JT4018-1 | |
| Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| KCl | VWR | BDH9258-500G | |
| Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
| MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
| Mineral oil | VWR | MK635704 | |
| NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
| Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
| Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
| Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
| Tween-20 | VWR | 200002-836 |
References
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71 (5), 731-739 (1992).
- Sudarwati, S., Nieuwkoop, P. D. Mesoderm formation in the anuranXenopus laevis (Daudin). Wilhelm Roux Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (3), 189-204 (1971).
- Gurdon, J. B., Fairman, S., Mohun, T. J., Brennan, S. Activation of muscle-specific actin genes in Xenopus development by an induction between animal and vegetal cells of a blastula. Cell. 41 (3), 913-922 (1985).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ariizumi, T., et al. Isolation and differentiation of Xenopus animal cap cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1 Unit 1D.5 (2009).
- Asashima, M., Grunz, H. Effects of inducers on inner and outer gastrula ectoderm layers of Xenopus laevis. Differentiation. 23 (3), 206-212 (1983).
- Jones, E. A., Woodland, H. R. Development of the ectoderm in Xenopus: tissue specification and the role of cell association and division. Cell. 44 (2), 345-355 (1986).
- Keller, R. E. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer. Developmental Biology. 42 (2), 222-241 (1975).
- Sokol, S., Wong, G. G., Melton, D. A. A mouse macrophage factor induces head structures and organizes a body axis in Xenopus. Science. 249 (4968), 561-564 (1990).
- Thomsen, G., et al. Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures. Cell. 63 (3), 485-493 (1990).
- Howard, J. E., Smith, J. C. Analysis of gastrulation: different types of gastrulation movement are induced by different mesoderm-inducing factors in Xenopus laevis. Mechanisms of Development. 43 (1), 37-48 (1993).
- Fulton, T., et al. Axis specification in Zebrafish is robust to cell mixing and reveals a regulation of pattern formation by morphogenesis. Current Biology. 30 (15), 3063-3064 (2020).
- Schauer, A., Pinheiro, D., Hauschild, R., Heisenberg, C. -P. Zebrafish embryonic explants undergo genetically encoded self-assembly. eLife. , 55190 (2020).
- Oppenheimer, J. M. The development of isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus. The Journal of Experimental Zoology. 72 (2), 247-269 (1936).
- Trinkaus, J. P., Drake, J. W. Exogenous control of morphogenesis in isolated Fundulus blastoderms by nutrient chemical factors. The Journal of Experimental Zoology. 132 (2), 311-347 (1956).
- Grinblat, Y., Lane, M. E., Sagerström, C., Sive, H. Analysis of zebrafish development using explant culture assays. Methods in Cell Biology. 59, 127-156 (1999).
- Sagerström, C. G., Grinblat, Y., Sive, H. Anteroposterior patterning in the zebrafish, Danio rerio: an explant assay reveals inductive and suppressive cell interactions. Development. 122 (6), 1873-1883 (1996).
- Sagerström, C. G., Gammill, L. S., Veale, R., Sive, H. Specification of the enveloping layer and lack of autoneuralization in zebrafish embryonic explants. Devolopmental Dynamics. 232 (1), 85-97 (2005).
- Xu, P. F., Houssin, N., Ferri-Lagneau, K. F., Thisse, B., Thisse, C. Construction of a vertebrate embryo from two opposing morphogen gradients. Science. 344 (6179), 87-89 (2014).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. Nodal and planar cell polarity signaling cooperate to regulate zebrafish convergence and extension gastrulation movements. eLife. 9, (2020).
- de Olivera-Melo, M., Xu, P. F., Houssin, N., Thisse, B., Thisse, C. Generation of ectopic morphogen gradients in the Zebrafish blastula. Methods in Molecular Biology. 1863, 125-141 (2018).
- Sepich, D. S., Calmelet, C., Kiskowski, M., Solnica-Krezel, L. Initiation of convergence and extension movements of lateral mesoderm during zebrafish gastrulation. Devolopmental Dynamics. 234 (2), 279-292 (2005).
- Gritsman, K., et al. The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling. Cell. 97 (1), 121-132 (1999).
- Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
- Spemann, H., Manngold, H. Uber inducktion von embryoalanlangen durch implantation artfremder organisatoren. Archiv für mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik. 100, 599-638 (1924).
- Mangold, O. Über die Induktionsfähigkeit der verschiedenen Bezirke der Neurula von Urodelen. Naturwissenschaften. 21 (43), 761-766 (1933).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Agathon, A., Thisse, C., Thisse, B. The molecular nature of the zebrafish tail organizer. Nature. 424 (6947), 448-452 (2003).
- Tacke, L., Grunz, H. Close juxtaposition between inducing chordamesoderm and reacting neuroectoderm is a prerequisite for neural induction in Xenopus laevis. Cell Death and Differentiation. 24 (1), 33-43 (1988).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (4), 731-736 (2010).
- Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. A mesoderm-independent role for Nodal signaling in convergence & extension gastrulation movements. BioRxiv. , (2019).
- Londin, E. R., Niemiec, J., Sirotkin, H. I. Chordin, FGF signaling, and mesodermal factors cooperate in zebrafish neural induction. Developmental Biology. 279 (1), 1-19 (2005).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Veenvliet, J. V., et al. Mouse embryonic stem cells self-organize into trunk-like structures with neural tube and somites. Science. 370 (6522), (2020).
- Beccari, L., et al. Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids. Nature. 562 (7726), 272-276 (2018).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582 (7812), 410-415 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids. Nature. 582 (7812), 405-409 (2020).
