هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل العدلات من الدم كله، والمعاطف بافي، أو أغشية leukapheresis، وتحقيق عائد جيد، والنقاء العالي، والحد الأدنى من تنشيط الخلية. نحن نستخدم تنقية التدرج، وترسب خلايا الدم الحمراء (RBC)، وتحلل RBC للحصول على إعداد العدلات عالية الجودة / النقاء.
العدلات (PMNs) هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدورة الدموية البشرية، وتتراوح بين 40 إلى 70٪ من مجموع الكريات البيض في الدم. وهي أول خلايا يتم تجنيدها في موقع الالتهاب عن طريق البذخ السريع من خلال الأوعية. هناك، العدلات أداء مجموعة من الوظائف لقتل مسببات الأمراض الغازية والتوسط الإشارات المناعية. العدلات النقية حديثا من دم الإنسان هي النموذج المفضل للدراسة، حيث لا يوجد خط خلايا يكرر تماما وظائف PMN والبيولوجيا. ومع ذلك، فإن العدلات هي خلايا قصيرة الأجل ومتمايزة بشكل نهائي وهي عرضة للغاية للتنشيط استجابة للمحفزات الفيزيائية (درجة الحرارة وسرعة الطرد المركزي) والبيولوجية (الإندوتوجين والكيميائي والسيتوكينات). لذلك، من المهم اتباع طريقة موحدة وموثوقة وسريعة للحصول على خلايا نقية وغير نشطة. يقدم هذا البروتوكول بروتوكولا محدثا يجمع بين الطرد المركزي المتدرجة الكثافة، وترسب خلايا الدم الحمراء (RBC)، وتحلل RBC للحصول على نقاء PMN عالي وتقليل تنشيط الخلية. وعلاوة على ذلك، يتم أيضا مناقشة طرق لتقييم جودة عزل العدلات، وقابلية البقاء، والنقاء.
يتكون الجهاز المناعي الفطري من العديد من أنواع الخلايا التي تحافظ على التوازن المناعي وإزالة مسببات الأمراض جنبا إلى جنب مع العديد من الوظائف الفسيولوجية الأخرى. العدلات تضم أكبر تجمع من خلايا الدم البيضاء في الدورة الدمويةالبشرية 1. يتم تخزين معظم العدلات الناضجة في نخاع العظام ، وهو موقع توليد العدلات الجديدة ، وتسمى أيضا الحبيبية. في نخاع العظام، تخرج السلف الحبيبية من دورة الخلية وتفرق بشكل نهائي، وتكتسب نواتها المقسمة المميزة وحبيباتها2. في ظل الظروف الالتهابية ، استجابة للكيموكينات والسيتوكينات والأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر والمسببات للأمراض ، يتم تعبئة العدلات من مجرى الدم والخروج من نخاع العظام لأداء مجموعة واسعة من الوظائف. وتشمل هذه إفراز السيتوكين، وداء البلعوم المباشر للمسببات المرضية، وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية، وإزالة البروتينات المضادة للميكروبات، وتشكيل الفخاخ خارج الخلية العدلية.
الجزيئات المستخدمة من قبل العدلات لمكافحة العدوى سامة للميكروبات والمضيف. وهكذا، فإن العمر الافتراضي والإزالة السليمة للشيخوخة / الموت العدلات هي منظمة للغاية، ولها فترة حياة محدودة في الدورة الدموية (<48 ح)3. بسبب هذا البقاء على قيد الحياة قصيرة، ينتج جسم الإنسان في المتوسط 100 مليار العدلات الجديدة كل يوم للحفاظ على التوازن السكاني4. يمكن أن يزيد الورم الحبيبي الطارئ من إطلاق العدلات ، الناضجة وغير الناضجة على حد سواء ، في الدم أثناء الالتهاب والعدوى5. يتم تسليط الضوء على أهمية العدلات في الاستجابة المناعية الفطرية من قبل المرضى الذين يعانون من قلة العدلات المكتسبة أو الخلقية ، الذين هم عرضة للالتهابات البكتيرية والفطرية6.
تنشأ العديد من التحديات عند دراسة بيولوجيا العدلات وأدوارها في الاستجابة المناعية بسبب طبيعتها ، بما في ذلك بقاءها القصير ومحتواها السام للخلايا. وقد تم تمييز خطوط الخلايا الشبيهة بالنيوتروفيل عادة عن سرطان الدم البروميلوسي البشري HL-60 الخلايا وخلايا PLB-9857،8. على الرغم من أنها يمكن أن تعرض مورفولوجيا تشبه العدلات وأداء chemotaxis، هذه الخطوط الخلية لا يمكن تلخيصها تماما بيولوجيا العدلات. كما أن المقايسات المختبرية التي تستخدم خطوط الخلايا هذه غير قادرة على تلخيص تجارب الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن تمايز هذه الخلايا يحتاج إلى تحريض ويمكن أن يتأثر سلبا بالتلاعب الجيني قبل التمايز.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير أساليب للتحايل على هذه القضايا باستخدام المروجين غير قابلة للاختزال لتعديل التعبير الجيني بعد التمايز في خلايا HL-609. وحتى مع هذه الأدوات، يطلب من النازات الأولية للرعاية الصحية البشرية التحقق من صحة الأهداف باستخدام النهج الدوائية. وبالتالي، فمن الضروري الحصول على العدلات نقية ومعطلة معزولة عن الدم للتحقق من صحة النتائج التي توصلت إليها خط الخلية والنماذج الحيوانية. تقدم هذه الورقة بروتوكول عزل PMN منقح تم فيه تقييم إيجابيات وسلبيات الأساليب الحالية10. وقد ابتكر مزيج يتألف من الطرد المركزي المتدرجة لفصل PMNs من الخلايا المناعية الأخرى، والترسب قصيرة القائمة على dextran لإزالة الجزء الأكبر من RBCs، وتحلل RBC المتبقية السريعة عن طريق الضغط التناضحي، والطرد المركزي منخفض السرعة لإزالة تلوث الصفائح الدموية.
نظرا لمدى الحياة القصير ، وحالة التمايز النهائي ، والمحتوى الليتيكي للنيوتروفيليا ، فإن دراسة هذه الخلايا كانت دائما تحديا. وبصرف النظر عن استخدام نماذج الماوس أو الخلايا من أفواج المرضى، وخطوط الخلايا هي أدوات مفيدة للمساعدة في دراسة بيولوجيا العدلات16. ومع ذلك، لا يمكن لخطوط الخلايا الشبيهة بالنيوتروف أن تكرر تماما جميع جوانب بيولوجيا العدلات، مما يضيف طبقة إضافية من الصعوبة في دراسة هذه الخلايا. النموذج الأكثر استخداما في المختبر هو خط الخلية HL-60، والتي يمكن تمييزها إلى خلايا تشبه العدلات عن طريق العلاج مع ثنائي ميثيل سلفكسيد أو حمض الريتينويك17،18. على الرغم من أن هذه الخلايا مفيدة في دراسة الهجرة وانفجار الجهاز التنفسي، فهي ليست مناسبة لدراسة النشاط الميكروبيوسيدال من العدلات. توجد خطوط الخلايا الأخرى (PLB-98, NB4) ، وهي أيضا مقترنة بمجموعة القيود الخاصة بهم19.
ومن المحوري للتحقق من صحة مع الملاحظات العدلات البشرية الأولية التي أدلى بها مع نماذج مرض الماوس وخطوط الخلايا. لا يمكن تقديم العدلات بشكل فعال وبالتالي غالبا ما تكون معزولة حديثا عن الدم الكامل أو المعاطف البرتقالية التي يتم الحصول عليها من المتبرعين ومعالجتها على الفور. مرة واحدة معزولة, الخلايا تبدأ في الخضوع لشكل معقد من الموت العفوي, ينظمها الأكسدة, caspases السيتوبلازمية, وبروتياز وجدت في حبيبات العدلات20,21. يمكن أن تؤدي طرق العزل غير السليمة أو التقنيات إلى تنشيط العدلات ، مما يؤدي فقط إلى تسريع زوال الخلايا. من الضروري أن يكون لدينا طريقة موثوقة ومتسقة للحصول على العدلات النقية وعالية الجودة من المتبرعين.
كانت هناك العديد من الطرق المنشورة على عزل العدلاتالبشرية 10،22. وهي تندرج أساسا في فئتين، مع بعض الاستراتيجيات المشتركة. الفئة الأولى هي الأجسام المضادة القائمة، ويجري إما من خلال الاختيار الإيجابي أو السلبي. اختيار إيجابي من شأنه أن تسمية العدلات مباشرة، وبالتالي توفير مجموعة خلايا نقية للغاية، على الرغم من أنه يؤدي أيضا إلى تنشيط الخلية السريع، موت الخلية، فضلا عن وضع علامات غير المرغوب فيها من العدلات23. الاختيار السلبي، على الرغم من ترك الخلايا دون تسمية وإعطاء السكان نقية جدا، والموت العدلات المتسارع، على الرغم من أن الآلية الدقيقة غير معروف(الشكل 5). ما إذا كان يتم تغيير التعبير الجيني أو البروتين أيضا بعد اختيار إيجابي أو سلبي يحتاج إلى مزيد من التحقيق. وعلاوة على ذلك، نظرا لكمية الأجسام المضادة اللازمة لاستنفاد أنواع أخرى من الخلايا، وهذه الأساليب لا يمكن إخراج كميات كبيرة من العدلات. ومع ذلك، لا يزال من الممكن استخدام المقايسات القائمة على الأجسام المضادة للثقافة والتجارب على المدى القصير على نطاق أصغر، وهي طرق اختيار للتجارب التي تتطلب نقاء خلايا عالية جدا، مثل دراسات التعبير عن الجينات والبروتين.
النوع الثاني من أسلوب العزل هو التدرج والكثافة المستندة. وعادة ما ينطوي على Percoll، Ficoll-Paque، أو غيرها من مكونات البوليساكريد / polyvinylpyrrolidone ويستخدم قوة الطرد المركزي لفصل أنواع مختلفة من خلايا الدم على أساس كثافة الخلية. وغالبا ما تستكمل هذه الأساليب مع ترسب خلايا الدم الحمراء عن طريق الدكستران. هذه الأساليب يمكن التعامل مع جداول أكبر من المواد بدءا ويمكن تحقيق نقاء عالية كذلك. تحذير واحد من العزلة القائمة على الكثافة هو الفصل غير الفعال للخلايا الحبيبية الأخرى الأقل وفرة (معظمها من الحمضات) من العدلات ، وبالتالي ، فإن القيد الرئيسي للبروتوكول المقدم ، حتى وجود تلوث الخلايا الصغيرة يمكن أن يؤثر على استجابة العدلات24.
هنا هو أسلوب موجز على أساس العزلة التدرج ، وصقل الأساليب السابقة10،22. نحن نستخدم التقليل الحالي من خصوصيات العدلات لعزل العدلات البشرية النقية بشكل موثوق مع الصفائح الدموية المتبقية المحدودة وRBCs ، ومنع تنشيط العدلات والموت المتسارع. الخطوة الأكثر أهمية هي طبقات التدرج ، والتي يتم الحصول عليها بشكل أكثر فعالية عن طريق إضافة متوسط تدرج الكثافة تحت الدم للحصول على واجهة حادة. يمكن أن يكشف الفحص السريع لحلقة PBMC والتدرج بعد الطرد المركزي عن التلوث المحتمل والتنشيط وانخفاض الغلة. عند العمل مع غشاء leukapheresis أو معطف برتقالي ، فإن تمييع الدم مهم لأن كثافة الخلايا المفرطة ستؤدي إلى تجميع الخلايا ، مما يؤدي إلى الشوائب وتنشيط الخلية.
يجب إكمال هذا البروتوكول في غضون 2 ساعة لضمان نضارة الخلية ، ويتم الخطوات التي تنطوي على متوسط تدرج الكثافة ، وdxtran ، والتحلل على الفور ، حيث يمكن أن يغير التعرض لهذه الحلول العدلات. مع هذا البروتوكول، والغلة المتوقعة من العدلات هو ما لا يقل عن ~ 10 مليون/10 مل من الدم كله وعلى الأقل ~ 60 مليون/10 مل من معطف بافي. يجب إجراء تقييم جودة العزل على النحو التالي: يجب أن تكون العدلات المنشطة أقل من 10٪، وتلوث الخلايا الليمفاوية أقل من 5٪، والحد الأدنى من الحمضات (نفس الجانب مبعثر ولكن أقل إلى الأمام مبعثر السكان)، وينبغي أن تكون صلاحية الخلية أكثر من 90٪. يمكن أن ينتج انخفاض النقاء عن طبقات غير سليمة أو تخزين متوسط تدرج الكثافة أو بسبب جودة ونضارة منتج الدم الأولي.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا المشروع من قبل P01HL095489. A.Y.H كان مدعوما من قبل T32HL066987.
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
CD41-APC | biolegend | 303710 | |
Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
Dextran | Fisher | BP1580 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium chloride | sigma | 71376 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |