प्रोटोकॉल जटिल lysate आधारित सेल मुक्त प्रणालियों में मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अपवर्तक सूचकांक या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ-साथ उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी विधियों का वर्णन करते हैं।
लक्षित बायोसिंथेसिस के लिए इंजीनियरिंग सेलुलर मेटाबोलिज्म को व्यापक डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्न (डीबीटीएल) चक्रों की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि इंजीनियर सेल की जीवित रहने की आवश्यकताओं के आसपास काम करता है। वैकल्पिक रूप से, सेल-मुक्त वातावरण में डीबीटीएल चक्र ों को ले जाने से इस प्रक्रिया में तेजी आ सकती है और मेजबान अनुकूलता के साथ चिंताओं को कम किया जा सकता है। सेल-फ्री मेटाबोलिक इंजीनियरिंग (सीएफएमई) के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण बायोमैन्यूफैक्चरिंग के लिए प्लेटफार्मों के रूप में और तेजी से खोज और संशोधित प्रोटीन और रास्तों को प्रोटोटाइप करने के लिए मेटाबोलिक रूप से सक्रिय क्रूड सेल अर्क का लाभ उठाता है। इन क्षमताओं को साकार करने और CFME प्रदर्शन का अनुकूलन करने के लिए lysate आधारित सेल मुक्त प्लेटफार्मों के मेटाबोलोम की विशेषता के लिए तरीकों की आवश्यकता है । यही है, लक्षित मेटाबोलाइट रूपांतरणों में सुधार की निगरानी के लिए विश्लेषणात्मक उपकरण और मेटाबॉलिज्म में हेरफेर करते समय मेटाबोलाइट फ्लक्स में परिवर्तन को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक हैं। यहां, ई कोलाई S30 lysates में मेटाबोलाइट उत्पादन और प्रवाह की विशेषता के लिए ऑप्टिकल या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ मिलकर उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके मेटाबोलाइट विश्लेषण लागू किया गया था। विशेष रूप से, इस रिपोर्ट में विभिन्न उच्च मूल्य वाले उत्पादों के लिए कम लागत वाले सब्सट्रेट्स (यानी ग्लूकोज) के रूपांतरण में केंद्रीय मेटाबोलिक इंटरमीडिएट और उप-उत्पादों के उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने के लिए अपवर्तक सूचकांक डिटेक्शन (आरआईड) का उपयोग करके एचपीएलसी विश्लेषणों के लिए सीएफएमई lysates से नमूनों की तैयारी का वर्णन किया गया है । सीएफएमई प्रतिक्रियाओं में मेटाबोलाइट रूपांतरण का विश्लेषण उलट-चरण तरल क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से 13सी-लेबल ग्लूकोज के साथ खिलाया जाता है, जो विशिष्ट मेटाबोलाइट पैदावार और शुरू सामग्री से मेटाबोलिक प्रवाह की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कुल मिलाकर, इन विश्लेषणात्मक तरीकों को CFME lysate मेटाबोलिज्म के लिए लागू करने से इन प्रणालियों को तेजी से या उपन्यास मेटाबोलिक इंजीनियरिंग कार्यों को निष्पादित करने के लिए वैकल्पिक प्लेटफार्मों के रूप में उन्नति में सक्षम बनाता है।
रासायनिक उत्पादन के लिए इंजीनियरिंग रोगाणुओं में सीमाओं को विट्रो में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को फिर से बढ़ाकर संबोधित किया जा सकता है जहां प्रतिस्पर्धी सेलुलर अस्तित्व कार्य अनुपस्थित हैं1। इसके अलावा, खुली प्रतिक्रिया वातावरण (यानी, कोशिका झिल्ली की अनुपस्थिति) हेरफेर के लिए अधिक उत्तरदायी है और जीवित कोशिकाओं की तुलना में निगरानी करना आसान है। सेल-फ्री मेटाबोलिक इंजीनियरिंग (CFME) की इस मूलभूत अवधारणा को हाइड्रोजन और मोनोटरपेन जैसे मूल्यवान रसायनों को उत्पादन मैट्रिक्स के साथ संश्लेषित करने के लिए मेटाबोलिक रास्तों के पुनर्गठन द्वारा सुंदर ढंग से प्रदर्शित किया गया है जो माइक्रोबियल सेल कारखानों में प्रस्तुत की तुलना में अधिक परिमाण के आदेश हैं इस प्रकार अब तक1,2,3 . हालांकि, पूरे रास्तों को शुद्ध करने के तरीके वर्तमान में समय और लागत से विवश हैं। वैकल्पिक रूप से, सेल-मुक्त मेटाबोलिक सिस्टम को कच्चे सेल अर्क से पूरे मार्ग पुनर्गठन4के सापेक्ष तेजी से और सस्ती विधियों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। सेल अर्क में बनाए गए केंद्रीय मेटाबॉलिज्म को ऊर्जा सब्सट्रेट्स (जैसे ग्लूकोज और एंजाइमेटिक कोफैक्टर) और बफर किए गए समाधानों में लवण के साथ पूरक किया जा सकता है ताकि 24 घंटे5,6से अधिक के लिए केंद्रीय मेटाबोलिक अग्रदूत उत्पन्न हो सके। लजीदने वाले सीएफएमई प्रतिक्रिया में एक्सोजेनस एंजाइमों को जोड़ने से ग्लूकोज के अधिक जटिल जैव-परिवर्तन उच्चटाइटर्स4,6, 7पर अधिक मूल्यवान रसायनों मेंहोतेहैं। यद्यपि इन प्रणालियों में उनकी कोशिका जैसी मेटाबॉलिक जटिलता के कारण उपज से समझौता किया जाता है, लेकिन अधिक उपज रूपांतरण के लिए लाइकेट प्रोटेक्स को क्यूरेट करने के अनूठे तरीके7,8विकसित किए जा रहे हैं।
lysate आधारित सेल मुक्त प्रणालियों में मेटाबॉलिक परिवर्तनों को पूरा करने में आसानी इन उत्कृष्ट प्लेटफार्मों या तो कोशिका के बाहर रासायनिक विनिर्माण पूरी तरह से ले जाने के लिए या वीवो2,9में इन डिजाइनों के निर्माण और परीक्षण से पहले उच्च थ्रूपुट के साथ नएरास्तोंप्रोटोटाइप के लिए बनाता है । या तो आवेदन के लिए, मेटाबोलिक रूपांतरणों की निगरानी या lysates में मेटाबॉलिक प्रवाह के लिए समग्र परिवर्तन देखने के लिए उपकरण CFME की उन्नति के अभिन्न अंग हैं। उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग सीएफएम प्रतिक्रियाओं के रासायनिक घटकों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन के साथ अलग करने के लिए किया जा सकता है और मेटाबोलाइट क्वांटिफिकेशन5,10के लिए ऑप्टिकल या मास-स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्टरों के साथ जोड़ा जा सकता है। एचपीएलसी का अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि एक विलायक (यानी, मोबाइल चरण) में भंग हुए और एक कॉलम के माध्यम से पंप किए गए विश्लेषण विशिष्ट कॉलम पैकिंग सामग्री (यानी स्थिर चरण)11के साथ बातचीत करेंगे। उनके रासायनिक गुणों के आधार पर, ये विश्लेषणात्मक बार-बार अलग-अलग प्रदर्शन करते हैं, इससे पहले कि वे अंततः स्थिर चरण से बाहर हो जाते हैं और मोबाइल चरण द्वारा डिटेक्टर तक ले जाते हैं। इस रिपोर्ट में एचपीएलसी आधारित तरीकों के माध्यम से ई कोलाई लिस्एट आधारित सीएफएमई प्रतिक्रियाओं की तैयारी और विश्लेषण का ब्यौरा दिया गया है।
एचपीएलसी ने अपवर्तक सूचकांक का पता लगाने के लिए मिलकर (एचपीएलसी-आरआईड) केंद्रीय मेटाबोलिक अग्रदूतों और अंत-उत्पादों की जल्दी पहचान करने के लिए एक आम तौर पर सुलभ तरीका है। संक्षेप में, छुटकारा उपाय कैसे विश्लेषणलिटे मोबाइल चरण12द्वारा प्रकाश के विक्षेप को बदल देते हैं । नमूनों में विश्लेषण को लक्षित करने के लिए संबंधित रिड सिग्नल को मानक समाधानों के आरआईड संकेतों के साथ तुलना करके निर्धारित किया जा सकता है। CFME अनुप्रयोगों में, पता लगाने के इस तरीके का सबसे अधिक उपयोग एचपीएलसी स्तंभों के साथ किया जाता है जो आकार के बहिष्कार और लिगांड विनिमय तंत्र, या आयन-मॉडरेट विभाजन क्रोमेटोग्राफी5,6,8,13के संयोजन के आधार पर अलग-अलग यौगिकों का उपयोग करता है। इस विशेष तकनीक का उपयोग ग्लूकोज जैसे चीनी सब्सट्रेट्स की खपत को जल्दी से निर्धारित करने के साथ-साथ lysate-आधारित CFMEप्रतिक्रियाओंमें संक्षेप, लैक्टेट, फोर्टमेट, एसीटेट और इथेनॉल जैसे किण्वन उत्पादों के गठन के लिए किया जाता है। एचपीएलसी के माध्यम से इन यौगिकों के एकाग्रता परिवर्तनों को रिकॉर्ड करना कच्चे सेल अर्क की क्षमता को केंद्रीय मेटाबॉलिक अग्रदूतों को पूल करने और यह समझने के लिए उपयोगी रहा है कि6,8,14में ग्लूकोज से जटिल मेटाबोलिक रूपांतरणों के दौरान किण्वित मार्ग के माध्यम से कैसे मार्ग प्रवाह को पुनः निर्देशित किया जाता है। ई. कोलाई सेल अर्क में मौलिक CFME अध्ययन इस बात की पुष्टि करते हैं कि किण्वन यौगिक ग्लूकोज कैटाबोलिज्म के अंत-उत्पादों के रूप में जमा होते हैं और यह भी होते हैं कि एक्सोजेनस एंजाइमों को अधिक बढ़ाते हैं6,15। यह सुझाव दिया जाता है कि किण्वित चयापचय ग्लाइकोलिटिक प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए कोफैक्टर (यानी, एनएडी (पी) एच और एटीपी) के रेडॉक्स समकक्ष को पुनर्जीवित करने में आवश्यक भूमिका निभाता है8। इसलिए, विभिन्न lysate-आधारित CFME कार्यों को निष्पादित करते समय किण्वन उत्पादों को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया एचपीएलसी आधारित ऑप्टिकल डिटेक्शन विधि एक उपयोगी और आमतौर पर लागू उपकरण है।
CFME मेटाबोलिक अंत उत्पादों है कि कार्बोहाइड्रेट, कार्बनिक एसिड, या शराब4नहीं कर रहे है जमा करने के लिए लागू किया जा सकता है । मध्यवर्ती का माप जिसका सेवन जितनी जल्दी होता है , उसके संश्लेषण में भी10वांछनीय हो सकतेहैं . जबकि एचपीएलसी-आरआईडी लागत और कठिनाई के मामले में सुलभ है, यह विधि प्रतिधारण समय के आधार पर केवल मेटाबोलाइट्स को अलग करने की क्षमता से विवश है। जब लिक्विड क्रोमेटोग्राफी एमएस/एमएस डिटेक्शन (एलसी-एमएस/एमएस)16से मिलकर होता है तो मेटाबोलाइट्स की व्यापक रेंज का विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि से, मोबाइल चरण में विश्लेषण आयनित और अंतर से प्रत्येक अणु के द्रव्यमान और चार्ज गुणों के आधार पर पता लगाया जाता है। कॉलम पर मेटाबोलाइट के मास-टू-चार्ज (एम/जेड) अनुपात और प्रतिधारण समय दोनों का ज्ञान इस प्रकार उच्च संकल्प16के साथ अधिकांश मेटाबोलिक मध्यवर्ती और अंत उत्पादों के पृथक्करण की सुविधा प्रदान करता है । इस डिटेक्शन तकनीक को नैनो-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी के साथ भी जोड़ा जा सकता है, जो बहुत कम प्रवाह दरों और नमूना इंजेक्शन की मात्रा प्रदान करता है, जिससे जटिल दृष्टि से सिद्धांत पृष्ठभूमि17में छोटे अणुओं का अधिक संवेदनशील पता लगाने की अनुमति मिलती है। एलसी-एमएस/एमएस को आइसोटोप लेबलिंग के साथ अतिरिक्त रूप से लागू किया जा सकता है क्योंकि इसमें शामिल लेबल एनालाइट्स के एम/जेड वैल्यूज18में बदलाव प्रदान करते हैं । 13सी6-ग्लूकोज सब्सट्रेट के साथ पूरक CFME प्रतिक्रिया से निकाले गए टाइमपॉइंट माप इस प्रकार पूरक ग्लूकोज से विशेष रूप से प्राप्त अंत या उप-उत्पादों को निर्धारित कर सकते हैं। यद्यपि यह आइसोटोप ट्रेसिंग विधि अभी तक आमतौर पर सीएफएमई अध्ययनों में लागू नहीं होती है, यह lysate-आधारित CFME सिस्टम में मेटाबोलिक रूपांतरणों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, विशेष रूप से इन प्रतिक्रियाओं में नमक प्रतिदेश (यानी, एसीटेट और ग्लूटामेट) को माध्यमिक सब्सट्रेट्स19के रूप में भी कैटाबोलाइज्ड किया जाता है। इस तकनीक का लाभ उठाने से lysates में ग्लूकोज चयापचय की एक व्यापक तस्वीर खींच सकते हैं, जो इस दिन के लिए पूरी तरह से समझ में नहीं आता है । यहां, प्रोटोकॉल नैनो-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी के लिए एक विधि का विवरण देता है, जो नैनोइलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (नैनो ईएसआई) एमएस/एमएस के साथ मिलकर ग्लूकोज मेटाबोलिज्म के संभावित मॉडल से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से ई. कोलाई lysates(चित्रा 1)में । यह मॉडल किण्वित मार्गों और पेंटोज फॉस्फेट मार्ग के ई. कोलाई में सक्रिय होने की रिपोर्टों पर आधारित है जो अमीर मीडिया 5 ,6,8,14में बढ़े उपभेदों से प्राप्त होता है । इस तकनीक का उपयोग अमीनो एसिड उत्पादन की जांच करने के लिए किया जाता है क्योंकि लाइसेट में ग्लूकोज से अमीनो एसिड एनाबोलिज्म पर वर्तमान ज्ञान कुछ उदाहरणों तक सीमित है जैसे कि सुगंधित अमीनो एसिड का संश्लेषण7। इन रास्तों (यानी ऑर्गेनिक एसिड, शुगर फॉस्फेट और अमीनो एसिड) में एंड-प्रॉडक्ट्स और इंटरमीडिएट की ज्यादातर ध्रुवीय प्रकृति को देखते हुए रिवर्स-चरणबद्ध लिक्विड क्रोमेटोग्राफी का इस्तेमाल यहां किया गया । यह तकनीक ध्रुवीय यौगिकों को एक गैर-ध्रुवीय स्थिर चरण से दूर करती है। इन यौगिकों को तब नैनो ईएसआई द्वारा नकारात्मक आयन मोड में आयनित किया गया था जो कम से कम एक नकारात्मक प्राथमिक शुल्क के साथ विश्लेषण का पता लगाने की अनुमति देता है और इस प्रकार अम्लीय यौगिकों का पता लगाने के लिए उपयोगी है। इस तकनीक को ग्लूकोज-व्युत्पन्न 13सी-शामिल मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण करने के लिए यहां नियोजित किया जाता है और lysates में ग्लूकोज चयापचय को समझने के लिए एलसी-एमएस/एमएस की उपयोगिता को दर्शाता है ।
उल्लिखित एचपीएलसी-आरआईड दृष्टिकोण का उपयोग समय के साथ lysate केंद्रीय चयापचय के प्रमुख कार्बनिक एसिड और अल्कोहल उत्पादों के लिए चीनी सब्सट्रेट खपत और बाद में रूपांतरणों को सफलतापूर्वक निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एक मोबाइल चरण का उपयोग करके एक सरल आइसोक्रेटिक विधि को नियोजित करता है, न्यूनतम नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है, और एक सरल लक्षित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की अनुमति देता है। एचपीएलसी-आरआईड विधि द्वारा मापा गया विश्लेषण पूरी तरह से उनके प्रतिधारण समय से प्रतिष्ठित होता है, और इसलिए चयनित कॉलम राल के साथ उनकी बातचीत होती है। यहां उपयोग किए गए एचपीएलसी कॉलम को विशेष रूप से आकार-अपवर्जन और लिगांड एक्सचेंज (यानी आयन-मॉडरेट विभाजन क्रोमेटोग्राफी) के संयोजन से कार्बोहाइड्रेट, कार्बनिक एसिड और अल्कोहल को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसलिए वर्णित विधि कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट्स के अधिक लक्षित विश्लेषण के लिए उपयोगी है और ग्लूकोज किण्वन मार्गों के अंतिम उत्पादों का चयन करती है जो मुख्य रूप से lysate आधारित जैव परिवर्तन8,15,21को सुविधाजनक और सक्रिय करने की उम्मीद है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में सेल अर्क में अन्य मेटाबोलिक रास्तों की सक्रियता का हिसाब नहीं है। अन्य क्रोमेटोग्राफिक पृथक्करण तकनीकों (यानी हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी), ग्रेडिएंट एल्यूशन विधियों, अधिक जटिल नमूना तैयारी (यानी, व्युत्पन्न) को नियोजित करने वाली पाइपलाइनों और विभिन्न ऑप्टिकल डिटेक्टरों (जैसे, पराबैंगनी प्रकाश या वाष्पीकरण प्रकाश बिखरने वाले डिटेक्टर) का उपयोग अमीनो एसिड और चीनी फॉस्फेट23,24 जैसे अन्य मेटाबोलाइट्स का पता लगाने के लिए किया जा सकताहै। . वैकल्पिक रूप से, एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके lysate चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक वैश्विक दृष्टिकोण लिया जा सकता है ।
वर्णित एलसी-एमएस/एमएस विधि मेटाबोलाइट्स की एक व्यापक श्रृंखला को मापने और पहचानने के लिए एक एकल कार्यप्रवाह है । एलसी-एमएस/एमएस मेटाबोलोम प्रोफाइलिंग के लिए एक अत्याधुनिक विश्लेषणात्मक उपकरण है क्योंकि इसकी संवेदनशीलता और उच्च संकल्प16के साथ प्रतिधारण समय और एम/जेड अनुपात द्वारा मेटाबोलाइट्स को अलग करने की क्षमता है । केंद्रीय कार्बन मेटाबोलिक रास्तों और अमीनो एसिड एनाबोलिज्म पर ध्यान केंद्रित करने के साथ, विशेष रूप से ध्रुवीय कार्बनिक एसिड, चीनी फॉस्फेट और अमीनो एसिड का पता लगाने के लिए नकारात्मक मोड एमएस/एमएस लागू किया गया था । नैनो-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी तकनीक के साथ मिलकर, विधि जटिल lysate पृष्ठभूमि17में छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान करती है। प्रोफाइलिंग लिस् ट-आधारित सीएफएम मेटाबोलिज्म के संदर्भ में, हालांकि, वर्णित एलसी-एमएस/एमएस प्रोटोकॉल की एक सीमा 50 मीटर/जेड की कम पहचान सीमा है, जो इथेनॉल के माप को पहले से ही निर्धारित करती है, जो ग्लूकोज चयापचय में एक प्रमुख उत्पाद है, साथ ही साथ साथी, जो अन्यथा विस्तृत एचपीएलसी-रीड विधि द्वारा आसानी से निर्धारित किया जाता है। एलसी-एमएस/एमएस की तुलना में एचपीएलसी-आरआईड को लागत और कठिनाई के मामले में सापेक्ष पहुंच का अतिरिक्त लाभ है । बाद के बिंदु पर, यहां वर्णित एलसी-एमएस/एमएस विधि का निवारण करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में विशेषज्ञता के कुछ डिग्री की आवश्यकता हो सकती है । फिर भी, एमएस डिटेक्शन में आरआईड पर विशिष्ट रूप से आकर्षक अनुप्रयोग हैं क्योंकि यह मेटाबोलोम में लेबल किए गए आइसोटोप को अलग कर सकता है, जो जटिल मेटाबोलिक नेटवर्क18के माध्यम से पूरक सब्सट्रेट्स से कार्बन आंदोलन को समझने के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक है। इस तरह के एक दृष्टिकोण 13सी6-ग्लूकोजके साथ प्रतिक्रियाओं के पूरक और डाउनस्ट्रीम 13सी के सापेक्ष बहुतायत मूल्यों का विश्लेषण करके यहां लागू किया गया था चयापचय को शामिल । विश्लेषण ने सक्रिय और निष्क्रिय रास्तों की परिभाषा की अनुमति दी, पहले रिपोर्ट की गई मान्यताओं का समर्थन किया और lysates में मेटाबोलिक प्रवाह के बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की। विशिष्ट विश्लेषणों के लिए विधि के भीतर भी संशोधन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, समय के साथ ग्लूकोज-व्युत्पन्न अणुओं के पूर्ण मात्रात्मक माप प्राप्त करने और प्रवाह वितरण के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए नमूनों के साथ 13सी-लेबल लक्ष्य यौगिकों के मानक समाधानों का विश्लेषण किया जा सकता है। सकारात्मक चार्ज किए गए यौगिकों का बेहतर पता लगाना सकारात्मक मोड डिटेक्शन के लिए समायोजित .meth फ़ाइलों के साथ दृश्यों को चलाकर वर्तमान कार्यप्रवाह के भीतर भी सक्षम किया जा सकता है।
दोनों वर्णित तरीकों में विश्लेषणात्मक नमूना आसानी से स्वचालित है, उच्च प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, जब तक उचित उपकरण हैंडलिंग प्रथाओं और रखरखाव का अवलोकन किया जाता है, तब तक चिकनी विश्लेषणात्मक रन की उम्मीद की जा सकती है। CFME प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए इन उपकरणों का उपयोग करते समय, नमूने के ऊपर और डाउनस्ट्रीम अधिक महत्वपूर्ण विचार किए जाने चाहिए। नमूना तैयारी के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि समय-पाठ्यक्रम नियंत्रण समय-शून्य के प्रतिनिधि हैं। यहां मेटाबॉलिक प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए एसिडिफिकेशन द्वारा प्रोटीन को lysates में उपजी थी । समय-शून्य नमूनों के लिए, एसिड सॉल्वेंट को ग्लूकोज युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ने से पहले lysate के साथ जोड़ा गया था। ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड के साथ एसिडिफिकेशन ने प्रभावी रूप से यह सुनिश्चित किया कि ग्लूकोज को समय-शून्य पर मेटाबोलाइज्ड नहीं किया जाता है, जैसा कि एचपीएलसी-रिड डेटा(चित्रा 2)में दिखाया गया है। जबकि ग्लूकोज चयापचय बुझाने के लिए एक समान प्रक्रिया रिपोर्ट एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण में किया गया था, 13सी लेबल मेटाबोलाइट्स समय शून्य नमूनों में पाया गया, हालांकि काफी कम बहुतायत मूल्यों पर बाद में समय बिंदुओं पर निकाले गए नमूनों के सापेक्ष । इसके अलावा, ये टिप्पणियां ग्लाितोलिसिस के मध्यवर्ती तक सीमित थीं। आंकड़ों से पता चलता है कि प्रतिक्रियाएं इस अत्यधिक संवेदनशील विधि द्वारा पता लगाए जाने वाले निष्कर्षण विलायक के साथ एसिडिफिकेशन के बाद ग्लायॉलिटिक गतिविधि के कुछ डिग्री बनाए रखती हैं। हालांकि, इस गतिविधि की सीमा को निर्धारित किया जाना चाहिए । पिछले अध्ययन में बताया गया था कि अम्लीय निष्कर्षण सॉल्वैंट्स मध्यवर्ती ग्लाइकोलिटिक प्रतिक्रियाओं को पर्याप्त रूप से नहीं बुझा सकते हैं, लेकिन ग्लूकोज की महत्वपूर्ण खपत10को रोक सकते हैं। हालांकि यह आगे यहां इस्तेमाल प्रणाली में जांच की जा रही है, समय के बीच सापेक्ष बहुतायत मूल्यों में भारी परिवर्तन-शूंय और बाद में समय बिंदु नमूनों ग्लूकोज चयापचय में प्रवृत्तियों के रूप में व्याख्या की जा सकती है । हालांकि, वैकल्पिक शमन विधियों की खोज, विशेष रूप से मेटाबोलिक मध्यवर्ती10की पूर्ण मात्रा प्राप्त करने के लिए समान अनुप्रयोगों में अनुशंसित है। इसके अलावा, डाउनस्ट्रीम सॉफ्टवेयर विश्लेषण के दौरान अच्छी प्रथाओं को भी देखा जाना चाहिए। मानवीय त्रुटि को कम करने के लिए रिड संकेतों से पीक क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से एकीकृत करने पर निरंतरता जरूरी है। जब भी नमूनों में मेटाबोलाइट सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए मैन्युअल रूप से एकीकृत शिखर क्षेत्रों का उपयोग किया जा रहा हो तो मानकों के चरम क्षेत्रों पर मैन्युअल एकीकरण भी लागू किया जाना चाहिए । लक्षित एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के दौरान, MZmine विश्लेषण से अनंतिम एनोटेशन एक एमएस गुणवत्ता ब्राउज़र का उपयोग कर मैनुअल पीक जांच द्वारा मांय किया जाना चाहिए, और m/z सुविधाओं को केवल एनोटेट किया जाना चाहिए जब गणना की गई सामूहिक त्रुटियां स्वीकार्य हों । यहां, इन विश्लेषणों को लक्ष्यों के सीमित सेट के लिए मैन्युअल रूप से किया गया था क्योंकि आइसोटोप खोज के लिए व्यापक और मजबूत सॉफ्टवेयर अभी तक स्थापित नहीं हुआ है। हालांकि, 13सी लेबल वाले मेटाबोलाइट्स की खोज के लिए इस तरह के स्वचालित तरीके वर्तमान में उभर रहे हैं और अधिक जटिल विश्लेषणों को भी सुव्यवस्थित करेंगे, जैसे केंद्रीय कार्बन मेटाबोलिज्म25से परे प्रोफाइलिंग लाइक्स।
जटिल मेटाबोलिक मिश्रण में छोटे अणुओं को अलग करने के लिए उन्नत तरल क्रोमेटोग्राफी एक मजबूत और व्यापक रूप से लागू विधिहै। वर्णित तरीके इस पृथक्करण तकनीक को रिफ्रएक्टिव इंडेक्स या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ सफलतापूर्वक लिसेट-आधारित CFME प्रतिक्रियाओं में मेटाबोलाइट रूपांतरणों का विश्लेषण करने के लिए जोड़े गए हैं। एचपीएलसी-आरआईड और एलसी-एमएस/एमएस सक्रिय रूप से चयापचय की प्रोफाइलिंग के लिए व्यक्तिगत रूप से शक्तिशाली उपकरण हैं, और प्रत्येक तकनीक की अंतर्निहित सीमाओं को संबोधित करने के लिए उनकी पूरकता का और लाभ उठाया जा सकता है । रिपोर्ट किए गए तरीके सीएफएमई के अनुप्रयोग और विकास को सक्षम करते हैं क्योंकि उनका उपयोग मेटाबोलिज्म को समझने, लक्षित मेटाबोलाइट रूपांतरणों में सुधार की निगरानी करने और लिसेट मेटाबोलिज्म में हेरफेर करते समय मेटाबॉलिक फ्लक्स में परिवर्तन को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को जीनोमिक साइंस प्रोग्राम, अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान कार्यालय द्वारा प्रायोजित किया गया था, संयंत्र माइक्रोब इंटरफेस साइंटिफिक फोकस एरिया (http://pmi.ornl.gov) के हिस्से के रूप में । ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला यूटी-बटेल, एलएलसी द्वारा अनुबंध DE-AC05-00OR22725 के तहत अमेरिकी ऊर्जा विभाग के लिए प्रबंधित किया जाता है । इस पांडुलिपि को यूटी-बटेले, एलएलसी द्वारा अनुबंध DE-AC05-00OR22725 के तहत अमेरिकी ऊर्जा विभाग के साथ लिखा गया है । संयुक्त राज्य अमेरिका की सरकार बरकरार रखती है और प्रकाशक, प्रकाशन के लिए लेख स्वीकार करके, स्वीकार करते है कि संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार एक गैर-समावेशी, भुगतान अप, अटल, दुनिया भर में इस पांडुलिपि के प्रकाशित रूप को प्रकाशित या पुन: पेश करने के लिए लाइसेंस बरकरार रखती है, या दूसरों को ऐसा करने की अनुमति, संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के प्रयोजनों के लिए । ऊर्जा विभाग डीओई सार्वजनिक पहुंच योजना (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) के अनुसार संघीय प्रायोजित अनुसंधान के इन परिणामों तक सार्वजनिक पहुंच प्रदान करेगा ।
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |