Summary
Protokollen beskriver högpresterande flytande kromatografi metoder i kombination med brytning index eller masspektrometrisk detektion för att studera metabola reaktioner i komplexa lysat-baserade cell-fria system.
Abstract
Teknisk cellulär metabolism för riktad biosyntes kan kräva omfattande DBTL-cykler (design-build-test-learn) när ingenjören arbetar kring cellens överlevnadskrav. Alternativt kan dbtl-cykler i cellfria miljöer påskynda denna process och lindra problem med värdkompatibilitet. Ett lovande tillvägagångssätt för cellfri metabolisk teknik (CFME) utnyttjar metaboliskt aktiva råcellsextrakt som plattformar för biotillverkning och för att snabbt upptäcka och prototypa modifierade proteiner och vägar. Att förverkliga dessa funktioner och optimera CFME-prestanda kräver metoder för att karakterisera metabolomen av lysatbaserade cellfria plattformar. Det vill säga analysverktyg är nödvändiga för att övervaka förbättringar i riktade metabolitkonverteringar och för att belysa förändringar i metabolitflödet vid manipulatmetabolism. Här tillämpades metabolitanalyser med högpresterande flytande kromatografi (HPLC) i kombination med antingen optisk eller masspektrometrisk detektion för att karakterisera metabolitproduktion och flöde i E. coli S30 lysater. Specifikt beskriver denna rapport beredningen av prover från CFME lysates för HPLC-analyser med hjälp av brytningsindexdetektering (RID) för att kvantifiera genereringen av centrala metaboliska intermediärer och biprodukter vid omvandling av billiga substrat (dvs. glukos) till olika värdefulla produkter. Analysen av metabolitkonvertering i CFME-reaktioner som matas med 13C-märkt glukos genom omvänd fas flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri (MS/ MS), ett kraftfullt verktyg för att karakterisera specifika metabolitutbyten och lysat metaboliskt flöde från utgångsmaterial, presenteras också. Sammantaget, tillämpa dessa analytiska metoder på CFME lysat metabolism möjliggör utvecklingen av dessa system som alternativa plattformar för att utföra snabbare eller nya metaboliska tekniska uppgifter.
Introduction
Begränsningar i tekniska mikrober för kemisk produktion kan åtgärdas genom rekapitulering av biokemiska reaktioner in vitro där konkurrerande cellulära överlevnadsfunktioner saknas1. Dessutom är den öppna reaktionsmiljön (dvs. frånvaro av ett cellmembran) mer mottaglig för manipulering och är lättare att övervaka jämfört med levande celler. Detta grundläggande koncept av cellfri metabolisk teknik (CFME) har elegant visats genom rekonstitution av metaboliska vägar för att syntetisera värdefulla kemikalier som väte och monoterpener med produktionsmått som är storleksordningar högre än vad som hittills presenterats i mikrobiella cellfabriker1,2,3 . Metoder för att rena hela vägar begränsas dock för närvarande av tid och kostnad. Alternativt kan cellfria metaboliska system härledas från råcellsextrakt genom snabba och billiga metoder i förhållande till hela vägens rekonstitution4. Den centrala metabolismen som behålls i cellextrakt kan kompletteras med energisubstrat (t.ex. glukos och enzymatiska kofaktorer) och salter i buffrade lösningar för att generera centrala metaboliska prekursorer i över 24 h5,6. Att tillsätta exogena enzymer till den lysatbaserade CFME-reaktionen möjliggör mer komplexa bioomvandlingar av glukos till mer värdefulla kemikalier vid höga titrar4,6,7. Även om utbyte tenderar att äventyras i dessa system på grund av deras cellliknande metaboliska komplexitet, har unika metoder för att kurera lysatproteomer för högre avkastningskonvertering utvecklats och utvecklas7,8.
Den enkla att utföra metaboliska omvandlingar i lysatbaserade cellfria system gör dessa utmärkta plattformar för antingen att flytta kemisk tillverkning utanför cellen helt och hållet eller för prototyper av nya vägar med hög genomströmning innan du bygger och testar dessa mönster in vivo2,9. För antingen applicering är verktyg för övervakning av metaboliska omvandlingar eller observera övergripande förändringar av metaboliskt flöde i lysater integrerade i utvecklingen av CFME. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kan användas för att separera de kemiska beståndsdelarna i CFME-reaktioner med hög upplösning och kan kopplas till optiska eller masspektrometriska detektorer för metabolitklikation5,10. Den underliggande principen för HPLC är att analyter som löses upp i ett lösningsmedel (dvs. mobil fas) och pumpas genom en kolumn kommer att interagera med det specifika kolonnförpackningsmaterialet (dvs. stillastående fas)11. Beroende på deras kemiska egenskaper uppvisar dessa analyter varierande retentionstider innan de så småningom eluteras från den stationära fasen och transporteras av den mobila fasen till en detektor. Denna rapport beskriver beredning och analys av E. coli lysat-baserade CFME reaktioner genom HPLC-baserade metoder som utnyttjar RID och MS/MS detektion.
HPLC i kombination med brytningsindexdetektering (HPLC-RID) är en allmänt tillgänglig metod för att snabbt identifiera centrala metaboliska prekursorer och slutprodukter. Kortfattat mäter RID hur analyter ändrar ljusavböjningen genom den mobila fas12. RID-signaler som motsvarar målanalyter i prover kan sedan kvantifieras genom jämförelser med RID-signaler av standardlösningar. I CFME-applikationer har detta detekteringssätt oftast använts med HPLC-kolumner som separerar föreningar baserat på en kombination av storleksuteslutning och ligand utbytesmekanismer, eller jon-modererad partitionkromatografi5,6,8,13. Denna speciella teknik används för att snabbt kvantifiera konsumtionen av sockersubstrat som glukos samt bildandet av jäsningsprodukter som succinate, laktat, format, acetat och etanol i lysatbaserade CFME-reaktioner8. Registrering av koncentrationsförändringar av dessa föreningar via HPLC har varit användbart för att både klargöra potentialen hos råcellsextrakt för att poola centrala metaboliska prekursorer och förstå hur vägflödet omdirigeras genom fermenterande vägar under komplexa metaboliska omvandlingar från glukos i lysates6,8,14. Seminal CFME studier i E. coli cell extrakt bekräftar att jäsningsföreningar ackumuleras som slutprodukter av glukoskatabolism och förekommer också som oönskade biprodukter i lysates som överuttryck exogenaenzymer 6,15. Det föreslås att fermentativ metabolism spelar en nödvändig roll för att regenerera redox motsvarigheter till kofaktorer (dvs NAD(P)H och ATP) för att upprätthålla glykolytiska reaktioner8. Därför är en HPLC-baserad optisk detektionsmetod utformad för att separera jäsningsprodukter ett användbart och vanligt tillämpat verktyg när man utför olika lysatbaserade CFME-uppgifter.
CFME kan implementeras för att ackumulera metaboliska slutprodukter som inte är kolhydrater, organiska syror eller alkoholer4. Mätningen av intermediärer som konsumeras lika snabbt som de syntetiseras kan också vara önskvärd10. Medan HPLC-RID är tillgängligt när det gäller kostnad och svårighetsgrad, begränsas denna metod av dess förmåga att endast skilja metaboliter baserat på retentionstid. Ett bredare spektrum av metaboliter kan analyseras när flytande kromatografi är kopplade till MS/MS-detektion (LC-MS/MS)16. Med denna metod joniseras analyter i den mobila fasen och detekteras differentiellt baserat på varje molekyls massa och laddningsegenskaper. Kunskap om både metabolitens massa-till-laddning (m/z) förhållande och retentionstid på kolumnen underlättar således separationen av de flesta metaboliska intermediärer och slutprodukter med hög upplösning16. Denna detektionsteknik kan också kopplas till nano-flytande kromatografi, vilket ger mycket lägre flödeshastigheter och provinjektionsvolymer, vilket möjliggör känsligare detektion av små molekyler i den komplexa lysatbakgrunden17. LC-MS/MS kan dessutom appliceras med isotopmärkning eftersom inkorporerade etiketter ger ändringar i analytvärdena m/z18. Tidspunktsmätningar som extraheras från en CFME-reaktion kompletterad med ett 13C 6-glukossubstrat kan därmed bestämma slutet- eller biprodukterna som härrör specifikt från kompletterad glukos. Även om denna isotopspårningsmetod ännu inte tillämpas ofta i CFME-studier, är det ett kraftfullt verktyg för att förstå metaboliska omvandlingar i lysatbaserade CFME-system, särskilt eftersom salt motåtgärder (dvs acetat och glutamat) i dessa reaktioner också kataboliseras som sekundära substrat19. Att utnyttja denna teknik kan således dra en omfattande bild av glukosmetabolism i lysater, vilket till denna dag inte är helt förstått. Här beskriver protokollet en metod för nano-flytande kromatografi kopplad till nanoelektrosprayjonisering (nano ESI) MS/MS som kan användas för att förhöra en möjlig modell av glukosmetabolism, särskilt i E. coli lysates (Figur 1). Modellen är baserad på rapporter om fermenterande vägar och pentosfosfatvägen är aktiv i E. coli lysater som härrör frånstammarsom odlas i rika medier 5,6,8,14. Tekniken används dessutom för att undersöka aminosyraproduktion eftersom nuvarande kunskap om aminosyraanabolism från glukos i lysater är begränsad till några exempel som syntesen av aromatiskaaminosyror 7. Med tanke på slutprodukternas och intermediärens mestadels polära karaktär i dessa vägar (dvs. organiska syror, sockerfosfater och aminosyror) användes omvänd fasad vätskekromatografi här. Denna teknik separerar polära föreningar genom eluering från en icke-polär stationär fas. Dessa föreningar joniserades sedan av nano ESI i negativt jonläge som tillåter påvisande av analyter med minst en negativ elementär laddning och är därmed användbar för att upptäcka sura föreningar. Denna teknik används här för att analysera glukos-härledda 13C-införlivande metaboliter och visar nyttan av LC-MS/MS för att förstå glukosmetabolism i lysater.
Protocol
1. Start-, stopp- och bearbetningstidskurs CFME-reaktioner för HPLC-RID-kvantifiering.
- Tina tidigare beredda E. coli-lysater och förbered resten av reaktionskomponenterna på is.
OBS: De lysater som rapporterades härleddes från E. coli BL21DE3-Star odlas i 2xYPTG (1,8% glukos) media till mitten av logfasen.- Bered en lämplig volym filtersteriliserat (0,20 μm porfilter) S30-buffert (1 M Tris-OAc justerad till pH 8,2 med glacial ättiksyra, 1,4 M Mg(OAc)2och 6 M KOAc).
- Förbered en energimix som innehåller glukos, glutamatsalter, ATP, Coenzyme A, NAD+, Bis-Tris-buffert och dipotassiumfosfat i S30-bufferten. Slutliga koncentrationer i önskad reaktionsvolym som användes för att förbereda CFME-reaktioner här var 100 mM glukos, 18 mM magnesiumglutamat, 15 mM ammoniumglutamat, 195 mM kaliumglutamat, 1 mM ATP, 0,2 mM Coenzyme A, 1 mM NAD+, 150 mM Bis-Tris och 10 mM dipotassiumfosfat.
- Kombinera komponenterna i 1,5 ml mikrocentrifugrör för att förbereda de slutliga reaktionerna med 4,5 mg/ml totalt lysatprotein. Här förbereddes CFME reaktioner med slutliga volymer på 50 μL i tre exemplar per tidpunkt. Inkubera reaktionerna vid 37 °C för deras respektive tidsramar.
OBS: Arbeta snabbt och tillsätt lysat som den sista komponenten i reaktionsblandningen för att förhindra för tidiga metaboliska reaktioner med glukos- och glutamatsalter. Minimal glukosförbrukning kan uppstå beroende på hur länge reaktionsblandningar inkuberas på is. - Avsluta reaktionerna och bearbeta proverna för HPLC-RID-analys.
- För att avsluta trelika reaktionerna vid lämpliga tidpunkter, tillsätt omedelbart en lika stor volym 5% triklorättiksyra till varje provs slutliga reaktionsvolym (dvs. 50 μL 5% triklorättiksyra till en 50 μL-reaktion). Späd varje prov med sterilt vatten vid 2x reaktionsvolymen (dvs. 100 μL).
- För att rekapitulera tid noll, blanda samma volym på 5% triklorättiksyra som den totala slutliga reaktionsvolymen (dvs. 50 μL) med lysatet innan du tillsätter resten av reaktionskomponenterna. Detta försurningssteg fäller ut lysatenzymer innan de metaboliserar glukos avsevärt.
- Virvel proverna och centrifugen på en bänkskiva mikrocentrifug vid 11,600 x g i 5 min och överför supernatater som innehåller organiska analyter till rena rör. Förvara proverna vid -20 °C om HPLC-analyser ska utföras en annan dag. Se till att tina upp de lagrade proverna på is innan du går vidare till nästa steg.
- Filtrera varje supernatant med ett 0,22 μm porfilter. Som ett alternativ till sprutor, använd centrifugrörfilter och centrifugera supernatanterna vid 16 300 x g i 1 min.
- Överför varje filtrate till en ren HPLC glasflaska. Ladda injektionsflaskan på HPLC autosamplerfacket.
- Förbered proverna för standardkurvagenerering.
- Förbered en stamlösning av alla målanalyter upplösta i S30-buffert vid equimolar-mängder över startkoncentrationen av glukos i CFME-reaktionerna. Här utarbetades en stamlösning bestående av 150 μM glukos, succinate, laktat, format, acetat och etanol. Utför 1:1 (v/v) seriella utspädningar från stamlösningen för att erhålla tre exemplariska 50 μL-lösningar med slutliga koncentrationer från 0 μM till lagerkoncentrationen (dvs. 150 μM).
- Späd varje lösning med 50 μL 5% trikloracetikasyra och 100 μL sterilt vatten. Upprepa steg 1.3.4-1.3.5.
OBS: Kör lösningar för standardkurvgenerering med varje sats av prover för att säkerställa noggrann kvantifiering av metabolitkoncentrationer.
2. Förbereda HPLC-systemet för metabolitdetektering.
- Under en rökhuv bereder du en steriliserad 5 mM svavelsyralösning från avjoniserat och filtersteriliserat vatten. Tillsätt ~550 μL av en 98% HPLC-grad svavelsyralösning till 2 L vatten för att förbereda 5 mM svavelsyra.
VARNING: Svavelsyra är en farlig kemikalie, och att arbeta under en rökhuv med korrekt labb-PPE förhindrar inandning, hudkontakt och ögonkontakt. Koncentrerad svavelsyra reagerar kraftigt med vatten och bör tillsättas direkt till vatten, inte tvärtom. Förvara i ett svalt, torrt område bort från direkt solljus och följ lämpliga avfallshanteringsåtgärder som fastställts av laboratoriet. - Förvara 2 L-flaskan med 5 mM svavelsyra inkuberad i ett vattenbad bredvid HPLC-instrumentet. Ställ vattenbadet på 35 °C. Placera slangen med ett lösningsmedelsfilter i lösningsmedelsflaskan och fäst den andra änden på en avgasningsmodul i linje med pumpmodulen.
OBS: Att rensa systemet med ett nylagat lösningsmedel innan kolonnen installeras är god instrumenthanteringspraxis. - Utrusta HPLC-instrumentet med HPLC-kolonnen i linje med RID-modulen. Placera kolonnen i vattenbadet på 35 °C om en kolonntermostat inte är tillgänglig.
- Förbered RID-modulen för analys vid 35 °C i CDS-programvara (Chromatography Data System) som är installerad på systemdatorn.
- Välj Metod och kör Kontrollvy på Visa-menyn. Högerklicka på pumpmodulens > metod. Ställ in flödeshastigheten på 0,55 mL ·min-1 och välj på-knappen för att initiera pumpen.
OBS: Om kolonnen var i lager innan den var utrustad på HPLC, öka flödeshastigheten till 0,55 ml-1 efter att ha balanserat kolumnen enligt tillverkarens instruktioner. - Högerklicka på panelen som motsvarar RID-modulen > metod. Ställ in temperaturen på RI-detektormodulen på 35 °C och välj På för att börja värma upp RI-detektormodulen.
- Högerklicka på panelen RID-modul > Control. Välj På för referenscellen för rensning i minst 15 minuter när du använder ett nytt lösningsmedel eller 1 h om olika lösningsmedel flödade genom RI-detektorn före denna inställning. Klicka på knappen På.
OBS: Håll pumpen och RI-detektorn på för att uppnå en stabil baslinje på online-tomten. Detta påverkas av temperaturfluktuationer i laboratoriet och kan ta upp till 4 timmar eller längre. Förvara systemet på natten före provinläsning.
- Välj Metod och kör Kontrollvy på Visa-menyn. Högerklicka på pumpmodulens > metod. Ställ in flödeshastigheten på 0,55 mL ·min-1 och välj på-knappen för att initiera pumpen.
3. Skapa en metod för isokratisk HPLC-separation av organiska jäsningsprodukter i CDS.
- Välj Metod för ny metod i > menyraden. Välj metod > spara metod som [Metodnamn].M. Välj metod > Redigera hela metoden > instrument/anskaffning
- Ställ in flödet på 0,55 ml min-1på fliken Binär pump. Under Lösningsmedel väljer du bokstaven som motsvarar lösningsmedelsingångenpå pumpmodulen och ställer in den på 100% för isokratisk eluering. Ställ in tryckgränserna på 0 och 400 bar och mata in 30 min som stopptid.
- Ställ in injektionsvolymen på 50 μL på fliken Provtagare. Ställ in de avancerade hjälpinställningarna för draghastighet, utmatningshastighetoch dragposition till 200 μL·min-1,200 μL·min-1och -0,5 mm.
- Ställ in optisk enhetstemperatur på 35 °C på fliken RID. Under Signalväljer du Hämta för signal och >0,2 min för Peakwidth. Välj alternativet Som pump/injektor för stopptid.
- Under Avancerat på fliken RID anger du Analog utgång till 5 % noll förskjutning och 500 000 nRIU för dämpning. Välj alternativet Positiv för signalpolaritet och alternativet På för Automatisk noll före analys.
- Spara metoden genom att välja Metod > Spara metod. Läs in metoden genom att välja metod > inläsningsmetod > [MethodName]. M.
4. Skapa en sekvenstabell för automatisksampling och starta HPLC-RID-systemet för datainsamling.
- Välj Sekvensmall i menyraden > ny sekvensmall. Välj sekvens > spara sekvensmall som [SequenceTemplateName]. S.
- Välj sekvens > sekvenstabellen. Lägg till n-rader som motsvarar n injektionsflaskan, sedan indataflaskans positioner och provnamn under Injektionsflaskans respektive provnamnet,beroende på deras placering på autosamplerfacket. Välj den metod som genereras i steg 3 på rullgardinsmenyn Metodnamn och mata in 50 μL som Injektion per injektion per flaska för varje rad.
- Klicka på Använd och spara sekvensmallen genom att välja Sekvensmall > Spara sekvensmall. Kontrollera att sekvensmallen läses in genom att > sekvenssekvensmallen > [SequenceTemplateName]. S.
- När du har uppnått en stabil baslinje på online-tomten högerklickar du på panelen RID-modul > Control > Off Recycling Valve för att rikta lösningsmedelsflödet genom RID-detektorn till avfall. Om du vill starta datainsamlingen väljer du Sekvens på menyraden, Sekvens > Kör.
5. Extrahera och analysera data efter körning.
- Välj dataanalysvy på Visa-menyn. Leta reda på sekvensfilnamnet från fillistan till vänster på skärmen. På mittenpanelen på skärmen går du till signalvymarkeringen > RID-signalen för att visa exempelkromatogrammen.
- Välj en rad som motsvarar ett prov med hög koncentrationsstandard från den övre panelen på skärmen. Notera kvarhållningstiderna för målets analyttoppar på det visade kromatogrammet. Toppar som motsvarar målanalyterna kommer att ordnas längs retentionstidsaxeln som glukos, succinate, laktat, format, acetat och etanol (Kompletterande figur 1).
OBS: Den första stora toppen på kromatogrammet motsvarar trikloracetsyra. Dess RI-enheter bör vara konsekventa över alla standardkurvprover. Validera kvarhållningstiden för varje målanalyt genom att köra varje förening som ett separat prov. - Extrahera toppområden för varje målanalyt från kromatogram av standarderna och reaktionsproverna.
- Urskilja om topparna av intresse är väl integrerade av programvaran. Rita den röda linjen som bas för varje topp för att få ett exakt integrerat område under kurvan. Om automatisk integrering misslyckas (dvs. röd linje är askew), välj knappen Manuell integration i integrationsverktygsuppsättningen och rita manuellt en toppbas för att integrera toppområdet.
OBS: Om manuell integrering måste utföras för en målanalyt i ett prov, håll konsekvent och integrera varje analyt manuellt i alla prover. - Välj markörverktyget i common tool set för att klicka på korrekt integrerade toppar. Toppområdet och motsvarande kvarhållningstid för den markerade toppen markeras som en tabellrad på skärmens nedre panel.
- Om du vill exportera toppområden väljer du > exportera > integrationsresultat.
- Urskilja om topparna av intresse är väl integrerade av programvaran. Rita den röda linjen som bas för varje topp för att få ett exakt integrerat område under kurvan. Om automatisk integrering misslyckas (dvs. röd linje är askew), välj knappen Manuell integration i integrationsverktygsuppsättningen och rita manuellt en toppbas för att integrera toppområdet.
- Kvantifiera målanalytkoncentrationerna med hjälp av standardkurvor.
- Rita topparealvärden kontra kända koncentrationer av prover i ett kalkylblad. Högerklicka på plottade data, Lägg till trendlinje > formattrendlinje > displayekvation i diagram.
- I ett separat kalkylblad använder du ekvationerna för standardkurvans trendlinjer för att konvertera toppområdesvärden till koncentrationer för varje analyt från varje prov. Beräkna genomsnittliga toppområden och standardfelvärden för trelikater för datavisualisering.
6. Start-, stopp- och bearbetningstidskurs isotopspårning av CFME-reaktioner för kvantifiering av LC-MS/MS.
- Ställ in trelika reaktioner per tidpunkt (utom tid noll) på is enligt beskrivningen i 1.1-1.2. Men istället för glukos, använd en slutlig koncentration på 100 mM 13C6-glukos i reaktionerna. Inkubera reaktionerna vid 37 °C i 1 timme, 2 timmar och 3 timmar.
- För att avsluta, blixt frysa reaktionerna i flytande kväve och lagra dem vid -80 °C. Hoppa över det här lagrings steget för analys samma dag.
OBS: Trikloroättiksyra användes inte för att stoppa reaktioner på grund av interferens från syran vid detektering av vissa centrala kolmetaboliter via LC-MS/MS. I stället användes extraktionsmedel som innehåller myrsyra (steg 6. 3) för att fälla ut metabola proteiner eftersom myrsyrans massa ligger under detektionsgränsen för den rapporterade MS/MS-metoden. - Förbered 50 ml extraktionsmedel. Kombinera och virvel 20 ml acetonitril, 20 ml metanol och 10 ml vatten (all LC-MS-klass) i ett 50 mL centrifugeringsrör tillsammans med 0,199 ml myrsyra för att göra en 0,1 M lösning. Kyl lösningsmedlet till 4 °C under extraktionen och förvara lösningsmedlet vid -20 °C när det inte används.
- Bearbetningsprover för LC-MS/MS-analys
- På analysdagen var pipetten en motsvarande volym av extraktionsmedel (dvs. 50 μL) till varje prov. Om proverna frystes, tillsätt extraktionsmedel innan proverna helt tinar ut för att förhindra återaktivering av glukosmetabolismen. Utför alla provbearbetningssteg på is.
- För att rekapitulera tid noll, pipett den slutliga volymen av extraktionsmedel (dvs. 50 μL) till en lämplig volym lysat för önskad slutlig koncentration i reaktionen (dvs. 4,5 mg/mL i 50 μL reaktionsvolym). Tillsätt resten av reaktionskomponenterna enligt steg 1.2. Detta försurningssteg fäller ut lysatenzymer innan de metaboliserar glukos avsevärt.
- Inkubera proverna i extraktionsmedel på is i 30 minuter med skonsam skakning och centrifugera sedan proverna vid 21 000 x g i 15 min vid 4 °C för att skilja supernatanten från det utfällda proteinet. Överför 50 μL av supernaten till autosamplerflaskan och lasta injektionsflaskan på brickan i 4 °C autosampler. Förvara resten av supernaten vid -20 °C för framtida analyser.
7. Ställa in LC-systemet för LC-MS/MS-analys.
- Bered 1 L lösningsmedel A genom att helt lösa upp 77, 08 mg ammoniumacetat i 950 ml vatten och 50 ml isopropanol. Bered 1 L lösningsmedel B med 650 ml acetonitril, 300 ml vatten och 50 ml isopropanol tillsammans med 77,08 mg ammoniumacetat. Se till att alla lösningsmedel är av LC-MS-klass.
- Anslut lösningsmedelsflaskorna som innehåller lösningsmedel A och B till pumpmodulen. Rensa systemet med ett högt flöde för att avlägsna/begränsa eventuell luftförorening som kan ha inträffat under lösningsmedelsutrustningen till LC-systemet.
- Utrusta systemet med en C18 omvänd faskolonn (30 cm kolonnlängd, 75 μm innerdiameter och 5 μm partikeldiameter). Villkora kolonnen till LC-MS-systemet genom att flöda 100% lösningsmedel B och långsamt flöda upp Lösningsmedel A till 100%.
OBS: Spaltspetsar förbereddes internt med hjälp av en mikropipettedragare och packades med tryckceller och helium.
8. Skapa en metod för LC-MS/ MS datainsamlings- och tolkningsprogram för LC-systemet kopplat till Fourier Transform och Ion Trap Mass Spectrometers.
- Öppna Tune Plus-programvaran för att redigera en tune-fil för MS-metoden.
- Öppna en förinstallerad tune-fil med negativt läge på menyraden.
- Välj ScanMode på menyraden och välj sedan Definiera skanningsfönster. Ställ in mikroskannatidsinställningen för MSn på 1 för både Jonfälla och FT.
- Gå till inställningar för Nano-ESI Source och ställ in Spray Voltage på 4 kV. Modulera detta tills en acceptabel elektrospray genereras; vanligtvis kan acceptabel elektrospray uppnås inom intervallet 2-5 kV.
- Spara tune-filen.
- Generera en ny LC-metod med installationsguiden för instrumentets programvara för datainsamling och tolkning. Öppna guiden > sekvens >. Eftersom dessa metoder inte kräver användning av en kolonnvärmare, hoppa över Temp Control-steget.
- Välj Multistep under Alternativ för flödesgradientpump. I nästa fönster infogar du 7 rader och ställer in flödeshastigheten för varje rad till 0,1 mL·min-1. Mata in följande parametrar för varje rad: från 0-3 min, leverera 100% lösningsmedel A; från 3-9 min, inför en gradient från 100% lösningsmedel A till 20% lösningsmedel B; från 9-19 min, introducera en ny gradient från 20% lösningsmedel B till 100% lösningsmedel B; från 19-27 min, håll vid 100% lösningsmedel B; från 27-28 min, ställ tillbaka lutningen till 100% lösningsmedel A; från 28-44 min, skölj och rekonditionera kolonnen för efterföljande körningar genom att hålla fast vid 100% lösningsmedel A. Inkludera ett sista steg för att sänka flödeshastigheten till 0,03 mL ·min-1 när körningen är klar för att spara lösningsmedlet när LC inte används.
- Använd standardinställningar för provtagarealternativ > pumptrycket som anskaffningsalternativ och använd standardinsamlingstid och använd standardalternativ för pumptryck.
- Skapa en MS/MS-metod genom att välja ikonen Orbitrap Velos Pro MS i sidofältet i fönstret Instrumentinställningar.
- Klicka på Ny metod > databeroende MS/MS. Ställ in In förvärvstid på längden på LC-körningen (dvs. 44 min), Segment till 1 och Skanna händelser till 11. För Tune File väljer du den redigerade filen från steg 8.1.
Den första händelsen är en MS1-prekursorsökning med hjälp av Fourier Transform MS (FTMS). De efterföljande 10 händelserna kommer att vara MS2-skanningar som väljer de 10 mest intensiva och unika jonerna i varje prekursorsökning för MS2-fragmentering. - För händelse 1, under Skanningsbeskrivning set Analyzer till FTMS och Polarity to Negative. Använd en upplösning på 30 000 och en normaliserad kollisionsenergi på 35 V. Ställ in skanningsintervall på 50 m/z för första massan och 1800 m/z för sista massan för att fånga små molekyler.
- För händelser 2 till och med 11, under Skanning Beskrivning set Analyzer till Ion Trap. Välj Beroende genomsökning och klicka på Inställningar > Global > Dynamic Exclusion och välj Aktivera; ställa in en upprepningstid på 30 s och 120 s uteslutningslängd för att eliminera upprepade skanningar i närheten.
- Gå till Inställningar för skanningshändelser och ställ in Mass Determined från Scan Event till 1 för alla MS2-händelser (2 till 11). Om du vill söka efter de 10 mest intensiva jonerna ställer du in varje MS2-skanningshändelse för att upptäcka en nth Most Intense Ion från1:a till10:e. Ställ därför in händelse 2 för att identifiera 1 som denn:e mest intensiva jonen, händelse 3 för att identifiera 2 och så vidare.
- Stäng inställningsfönstret och gå till Fil > Spara som [Method_Name].meth.
OBS: För allmän användning, underhåll och kalibrering av LC-instrumentet och masspektrometern, se bruksanvisningen och bruksanvisningen från tillverkaren.
- Klicka på Ny metod > databeroende MS/MS. Ställ in In förvärvstid på längden på LC-körningen (dvs. 44 min), Segment till 1 och Skanna händelser till 11. För Tune File väljer du den redigerade filen från steg 8.1.
9. Ställa in en körningssekvens och starta LC-MS/MS-körningen.
- Konfigurera en körsekvens med hjälp av LC-MS/MS-systemets programvara för datainsamling och tolkning. Högerklicka påtabellen i > sekvensinställningarför att infoga så många rader som exempel. För varje rad ställer du in Inj Vol på 5 μL och positionen till injektionsflaskans respektive position på autosamplerfacket. Mata in filnamn som exempelnamn och ange önskad filsökväg för körningsresultat.
OBS: Tomma injektionsflaskar som innehåller lösningsmedel A kan köras i början av sekvensen och mellan varje uppsättning tre exemplar (varje uppsättning tidpunkter) för att skölja kolonnen. - Om du vill starta körningen markerar du alla filnamn i sekvensen. Välj Åtgärder för att köra > sekvensen > OK på menyraden.
10. Konsolidera filer och söka efter preliminära anteckningar på MZmine 2.53.
- Öppna MZmine och importera utdatafilerna .raw från steg 9.1. Välj Rådatametoder i menyraden > importera rådata. Välj filer som motsvarar exemplen.
- Skapa en lista över toppar som skiljer mellan MS1- och MS2-skanningar. Från menyraden kan Raw Data Methods > Feature Detection > MS/MS Peaklist Builder. Relevanta inställningar inkluderar m/z Fönster inställt på 0,01 och Tidsfönster inställt på längden på körningen. Under inställda filter väljer du Negativ som polaritet och Centroided som spektrumtyp.
- Gå till Funktionslista metoder för funktions identifiering > > i menyraden. Ställ in m/z Tolerans på 0,005 m/z eller 10 ppm och minsta höjd till 1E3. Det här steget kommer att skapa helt utstjänta toppar.
- Ta bort dubbletttoppar. Gå tillbaka till funktionslistemetoder > filtrering > duplicerat toppfilter. Relevanta inställningar inkluderar m/z Tolerans inställd på 0,005 m/z eller 10 ppm och RT-toleransen inställd på 5 min.
- Om du vill justera toppar i liknande datafiler (dvs. de med trelicata reaktioner) går du tillbaka till Funktionslistemetoder > normalisering > kvarhållningstidskalibrering. Var noga med att bearbeta triplicateprover tillsammans och utelämna ämnen. Relevanta inställningar inkluderar m/z Tolerans inställd på 0,005 m/z eller 10 ppm, RT-tolerans inställd på 3 min absolut (min) och minsta standardintensitet inställd på 1E3.
- Justera toppar från alla filer efter m/z och kvarhållningstid från funktionslistmetoder > justering > RANSAC Aligner. Ställ in m/z Tolerans på 0,005 m/z eller 10 ppm, RT-tolerans och RT-tolerans efter korrigering till 44 respektive 39 min, RANSAC-iterationer till 0, minsta antal punkter till 10% och tröskelvärde till 1. Markera alternativet Kräv samma laddningstillstånd.
- Korrigera för alla datapunkter som kan ha gått förlorade i tidigare steg i funktionslistemetoder > Gap-> Peak Finder. Relevanta inställningar inkluderar intensitetstolerans inställd på 50%, m/z Tolerans inställd på 0,005 m/z eller 10 ppm och RT-tolerans inställd på 3 min. Aktivera RT-korrigering.
11. Beräkning av negativa lägesmassor på 13C-märkta glukosbaserade metaboliter och sökning efter m/z-egenskaperna hos dessa analyter i filtrerade data.
- Beräkna massorna av 13C-märkta metaboliter från glukosmetabolismen för den riktade sökningen.
- Beräkna den monoisotopiska massan av varje målförening från antalet atomer i föreningens molekylära formel och de monoisotopiska massorna av varje element20.
- Beräkna föreningens negativa lägesmassa [M-H]- genom att subtrahera massan av 1 proton (1,007276 Da) från den monoisotopiska massan. Detta är den massa som detekteras av ms-detektion i negativt läge efter att molekyler har tagits bort från en vätejon under joniseringen.
- Från den negativa lägesmassan, beräkna massan av 13C-inkorporeringsmetaboliten. Här beräknades massorna av isotopologues som maximalt innehåller glukos-härledda 13C-etiketter.
- Använd beräknade massor av 13C-märkta metaboliter för att söka och kommentera m/z-funktioner från MZmine-resultat. För varje möjlig träff beräknar du massfelet (ppm) med hjälp av följande ekvation:
OBS: Experimentella m/z värden <15 ppm massa fel ansågs som förmodade anteckningar i den aktuella analysen. - Kontrollera manuellt spektra av förmodade anteckningar i en kvalitetswebbläsare för att bekräfta anteckningar.
- Öppna > Qual Browser. Öppna Raw File i verktygsfältet för att importera rådata från MS för varje exempel.
- Rita en linje under önskat intervall av retentionstider (dvs. motsvarande den förmodade anteckningen) på det totala jonkromatogrammet (övre panelen) för att visa ett masspektrum (nedre panelen). Högerklicka på spektrumet och mata in en rad massor som omfattar målanalytens m/z. Kontrollera om de förmodade anteckningarna har distinkta toppsignaler som ligger betydligt över bullret (kompletterande figur 2).
- Beräkna de genomsnittliga toppområdena och standardfelen för positiva anteckningar över biologiska replikat för varje tidpunkt. Visualisera data (dvs. på en stapelgraf) för att observera trender i glukosmetabolismen.
Representative Results
För att kvantifiera den lysatbaserade cellfria syntesen av vanliga jäsningsprodukter från glukos matades lysater som härrör från stammar som odlats i 2xYPTG-medier 100 μM glukos som primär kolkälla8. Reaktioner stoppades under en 24 timmar lång tidskurs genom proteinförsurning. Filtrerade supernatanter som innehåller pyruvat, succinate, laktat, format, acetat och etanol som framställs av glukoskatabolism laddades på autosamplermodulen i ett HPLC-system utrustat med en RID-modul. Injektionsflaska med filtrerade blandningar av fermenterande slutprodukter och glukos vid 1,17 μM. 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM och 150 μM koncentrationer i S30-buffert laddades på instrumentet som standard. Analytes eluted isocratically från en HPLC kolumn till RID. Toppar för glukos, succinate, laktat, format, acetat och etanol inom intervallet 1 till 150 μM kunde lösas med RID. Toppområden för glukos härleddes genom manuell integrering från RID-data för tidskurs och standardkurvprover. Extraherade toppområden för succinate, laktat, format, acetat och etanol togs från automatiskt integrerade signaler. Alla standardkurvor (toppareal kontra känd koncentration) hade R2-värden >0,99 och var linjära i hela koncentrationsområdet som användes här.
Molar koncentrationer för alla mål analyter beräknades från deras respektive standard kurvor. Glukos konsumerades inom de första 3 h av reaktionen och jästes huvudsakligen till laktat(figur 2A,B). Ackumulering av etanol inträffade också signifikant inom de första 3 h av reaktionen och upphörde därefter (figur 2C). Observationen av betydande laktat- och etanolproduktion med betydande glukosförbrukning efter 3 timmar var inte oöverträffad eftersom produktionsvägar för laktat och etanol möjliggör regenerering av 1 nettomelvad NAD+ från glykolytisk NADH som krävs för fortsatt glukoskonsumtion genom glykolys (figur 1). Laktat och etanol kan därmed betraktas som de viktigaste fermenteringsslutprodukterna i lysatbaserad cellfri glukosmetabolism. Acetat var ursprungligen närvarande i reaktionerna som en komponent i S30-bufferten och ackumulerades oväntat endast på grund av metabolism efter 6 h när glukoskonsumtionen hade saktat ner (figur 2D). Detta resultat tyder på att acetatfermentering inte nödvändigtvis möjliggör snabbt glykolytiskt flöde i tidigare tidpunkter. Under tiden syntetiserades format och kortfattat som mindre jäsningsprodukter(figur 2E,F). Sammantaget möjliggjorde metoden absolut kvantifiering av sockersubstratutarmning och fermenterande produktbildning i E. coli S30-lysater.
MS detektion för att profilera lysat glukos metabolism specifikt tillämpades här. Lysates som härrör från stammar som odlas i 2xYPTG-media matades 13C6-glukos som kolkälla. CFME reaktioner hölls i tre exemplar för 0 h, 1 h, 2 h och 3 h. Prover från varje tidspunkt laddades på ett LC-system utrustat med en omvänd faskolonn och kopplades till Fourier transform- och jonfällasmasspektrometrar. Negativa jonlägesspektra erhölls och bearbetades för att analysera organiska syror, sockerfosfater och aminosyror. Beräknade teoretiska massor av 13C-märkta arter som tillhör centrala kol metabolism söktes för att identifiera specifikt glukos-härledda föreningar. Baserat på de utnyttjade odlingsförhållandena för källstammar och tidigare rapporter om aktiva vägar i E. coli CFME antas det här att lysatproteomen består av ett metaboliskt nätverk som matar glukos till glykolytisk jäsning, pentofosfatvägen och eventuellt aminosyraanabolism5,6,7,8,14 ( figur1). Därför begränsades sökningen till medlemmar av dessa vägar, varav 16 metaboliter som innehåller glukos-härledda 13C-etiketter var otvetydigt kommenterade (kompletterande tabell 1).
13 (på 13) C6-glukos konsumerades observably genom glykolys, vilket framgår av fluktuationerna i glykolytiska mellanliggande överflöd(figur 3A-E). I överensstämmelse med HPLC-RID-data ackumulerades glukos till 13C3-laktatoch fermenterades också till 13C3-kortfattad inom de första 3 h av reaktionen ( Figur4A, B). Bildandet av 13C3-kortfattadisotopologue stöder den föreslagna modellen av lysatglukosmetabolism (Figur 1), där succinate sannolikt kommer att genereras av karboxylering av 3-kolfosfenolpyruvatmolekyl (PEP) och inte från inträdet av en 2-kol acetyl-CoA-molekyl till TCA-cykeln. Aktivering av TCA-cykeln har antagits i tidigare CFME-studier, men andra 13C-märkta intermediärer av TCA upptäcktes inte här8,19,21. 13 (på 13) C3-aspartate syntes inträffade dock inom första h och konsumerades, vilket förstärker tanken att PEP är direkt omvandlas till oxaloacetat (Figur 1, Figur 6C). Data återspeglar en lysatproteom från källstammar som skördats under fermenterande tillväxt på glukosrika medier (2xYPTG). Detta skulle dessutom innebära att resten av de TCA-enzymer som inte deltar i kortfattad produktion bildar en oxidativ TCA-gren (figur 1). Ingen av metaboliterna i denna väg upptäcktes dock, möjligen på grund av att höga koncentrationer av glutamat läggs till CFME-reaktionen som en salt mottion förhindrar utvecklingen av denna gren.
HPLC-RID-data kompletteras dessutom av bristen på 13C 2-acetatdetektering inom tidsramen för 3 h reaktion som tyder på ingen uppbyggnad av acetat från glukos upp till 3 h (figur 2B). Den direkta föregångaren till acetat, acetylfosfat (acetyl-P), ackumuleras dock, vilket tyder på att Pta-armen på Pta-AckA-vägen för acetatsyntes från acetyl-coA är aktiv (Figur 4C,D). AckA katalyserad defosforylering av 13C2-acetyl-P till 13C 2 -acetat förekommer sannolikt inte inom denna tidsram på grund av att acetat är en viktig komponent i S30-bufferten som används i reaktionerna (figur 1, figur 2B).
Införlivandet av 13C6-glukos-härledda kol till sockerfosfater 6-fosfoglukolakton (6PGL), 6-fosfoglukonat (6PG), ribulosa-5-fosfat (Ru5P) och sedoheptulosa-7-fosfat (S7P) observerades också (figur 5). Dessa resultat bekräftar deltagandet av pentofosfatvägen i lysat glukosmetabolism och ger sannolikt 13C 9-tyrosinsyntes, vilket har föreslagits tidigare av en proteomisk studie, samtidigt som det ger en föregångare för 13C5-histidinproduktion (Figur 6A, B)7. Märkt fenylalanin och tryptofan observerades inte här, och inte heller de flesta av de essentiella aminosyrorna. Detta är dock inte helt förvånande eftersom aminosyra anabolat sannolikt kommer att berikas i lysater som härrör från celler som odlas i näringssvultna förhållanden eller vid den stationära fas7,22. Dessutom bör Data hittills tyder på att intermediärer av glykolys och fermentering kanaliseras mot kofaktorregenererande ändreaktioner, vilket måste förhindra syntesen av många aminosyror som härrör från glyceraldehyd-3-fosfat, pyruvat och acetylkoamid (dvs. glycin, cystein, serin, alanin, valin, leucin och lysin) (Figur 1). Som nämnts producerades 13C3-aspartat inom den första timmen, medan aspartat härlett 13C-inkorporering av aminosyror (dvs. treonin, isoleucin, metionin och sparris) inte observerades möjligen på grund av att glukos-härlett aspartat deltar i jäsning (figur 1, figur 6C). Slutligen kan flödet mot märkt glutamat och aminosyror som härrör från glutamat ha hämmats av höga halter av glutamat i reaktionsmiljön (figur 1).
Figur 1:En försättsbaserad metabolisk modell av lysater som härrör från E. coli BL21DE3-Star växer exponentiellt i höga glukoskoncentrationer. Intermediärer och slutprodukter av glykolys (grön), pentofosfatvägen (mörkorange) och fermenterande vägar (blå) från acetyl-CoA har rapporterats i lysatbaserad CFME. Närvaron av kortfattad jäsning innebär aktivering av den oxidativa TCA-grenen (grå). Aminosyra anabolat (guld) i lysates är inte väldefinierad och undersöks här. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:HPLC-RID-data för glukoskonsumtion och fermenterande slutproduktsyntes i CFME-reaktioner beredda med E. coli-råextrakt. (A) Glukosförbrukning och ( B )laktat,(C) etanol, (D) acetat, (E) format och (F) kortfattad produktion i CFME-reaktioner övervakades över 24 timmar. Genomsnittliga mM-koncentrationer och felstaplar (SE) kvantifierade med standardkurvor presenteras (n = 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Tidskurstrender på 13C6-glukos och 13C-märkta glykolytiska intermediärer i E. coli lysat CFME. Relativa överförekomster av( A) 13C6-glukos,B) 13C6-glukos-6-fosfat/fruktos-6-fosfat,(C) 13C6-fruktos-1,6-bisfosfat,(D) 13C3-glyceraldehyd-3-fosfat/dihydroxyacetonfosfat, och (E) 13C6 -pyruvat i CFME reaktioner över 3 h. Råa toppområden som extraherats av mzMINE-programvara användes för att beräkna medelvärden och felstaplar (SE) för positiva anteckningar (n = 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Tidskurstrender för intermediärer och slutprodukter i 13C 6-glukosfermentering i E. coli lysat CFME. Relativa överförekomster av (A) 13C3-laktat, (B) 13C 3-succinate, (C) 13C2-acetyl-fosfat och (D) 13C2-acetyl-CoA i CFME reaktioner över 3 h. Råa toppområden som extraherats av mzMINE-programvara användes för att beräkna medelvärden och felstaplar (SE) för positiva anteckningar (n = 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Tidskurstrender på 13C6-glukos härledd pentosfosfatväg intermediärer i E. coli lysat CFME. Relativa överförekomster av (A) 13C6-6-fosphogluconolactone, (B) 13C6-6-fosfoglukonat, (C) 13C5-ribulos-5-fosfat och (D) 13C7-sedoheptulosa-7-fosfat över 3 h. Råa toppområden som extraherats av mzMINE-programvara användes för att beräkna medelvärden och felstaplar (SE) för positiva anteckningar (n = 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Tidskurstrender för upptäckta 13C6-glukoshärledda aminosyror i E. coli lysat CFME. Relativa överflöd av (A) 13C9-tyrosin,(B) 13C5-histidin och (C) 13C3-aspartate över 3 h. Råa toppområden som extraherats av mzMINE-programvara användes för att beräkna medelvärden och felstaplar (SE) för positiva anteckningar (n = 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1:Representativ HPLC-RID-kromatogram som visar toppar för större fermenterande produkter i en CFME-reaktion inkuberad vid 37 °C i 24 timmar. Glukos-, succinata-, laktat-, format-, acetat- och etanoltoppar kan särskiljas tillräckligt genom deras retentionstider på en HPLC-kolumn under isokratisk eluering med 5 mM svavelsyralösningsmedel. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Representativt masspektra för 13C-märkta metaboliter, särskilt (A) laktat,(B) glukos, och (C) 6-fosfoglukonat (6PG) i en CFME-reaktion inkuberad vid 37 °C i 1 h. Klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande tabell 1:Förteckning över upptäckta 13C-märkta metaboliter, retentionstider (justerade över prover med MZmine), teoretiska helt 13C-märkta m/z-värden i negativt läge, m/z-värden för upptäckta funktioner och beräknade massfel. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Den skisserade HPLC-RID-metoden kan användas för att framgångsrikt kvantifiera sockersubstratkonsumtion och efterföljande omvandlingar till stora organiska syra- och alkoholprodukter av lysatcentral metabolism över tid. Dessutom använder detta protokoll en enkel isokratisk metod med en enda mobil fas, kräver minimal provberedning och möjliggör en enkel riktad nedströmsanalys. Analyter mätta med HPLC-RID-metoden utmärks endast av deras retentionstider och därmed deras interaktioner med det valda kolumnhartset. HPLC-kolumnen som användes här var särskilt utformad för att separera kolhydrater, organiska syror och alkoholer genom att kombinera storleksuteslutning och ligand utbyte (dvs jon-modererad partition kromatografi). Den beskrivna metoden är därför användbar för mer riktad analys av kolhydratsubstrat och utvalda slutprodukter av glukosfermenteringsvägar som främst förväntas underlätta och ge energi åt lysatbaserade bioomvandlingar8,15,21. Detta protokoll tar dock inte hänsyn till aktivering av andra metaboliska vägar i cellextrakt. Rörledningar som använder andra kromatografiska separationsmetoder (dvs. hydrofil interaktionskkromatografi), gradient elueringsmetoder, mer komplicerade provberedningar (dvs. derivatisering) och olika optiska detektorer (t.ex. ultraviolett ljus eller avdunstningsljusspridningsdetektorer) kan användas för att upptäcka andra metaboliter såsom aminosyror och sockerfosfater23,24 . Alternativt kan ett globalt tillvägagångssätt för att studera lysatmetabolism tas med hjälp av LC-MS/MS.
Den beskrivna LC-MS/MS-metoden är ett enda arbetsflöde för att mäta och identifiera ett bredare spektrum av metaboliter. LC-MS/MS är ett toppmodernt analysverktyg för metabolomprofilering på grund av dess känslighet och förmåga att skilja metaboliter genom retentionstid och m/z-förhållanden med hög upplösning16. Med fokus på centrala kol metaboliska vägar och aminosyra anabola, negativt läge MS/MS genomfördes för att specifikt upptäcka polar organiska syror, socker fosfater och aminosyror. Tillsammans med en nano-flytande kromatografiteknik ger metoden hög känslighet för att upptäcka små molekyler i komplex lysatbakgrunden17. När det gäller profilering av lysatbaserad CFME-metabolism är dock en begränsning av det beskrivna LC-MS/MS-protokollet dess nedre detektionsgräns på 50 m/z, vilket utesluter mätning av etanol, en viktig produkt i lysat glukosmetabolism, liksom format, som båda annars lätt kvantifieras med den detaljerade HPLC-RID-metoden. Jämfört med LC-MS/MS har HPLC-RID den extra fördelen av relativ tillgänglighet när det gäller kostnader och svårigheter. Till den senare punkten kan felsökning av LC-MS/MS-metoden som beskrivs här kräva viss grad av expertis inom masspektrometri. Icke desto mindre har MS-detektion unikt tilltalande applikationer över RID eftersom det dessutom kan skilja märkta isotoper i metabolomer, en utmärkt teknik för att förstå kolrörelse från kompletterade substrat genom det komplexa lysatmetaboliska nätverket18. Ett sådant tillvägagångssätt tillämpades här genom att komplettera reaktioner med 13C6-glukosoch analysera de relativa överflödsvärdena för nedströms 13C-införlivande metaboliter. Analysen tillät definitionen av aktiva och inaktiva vägar, stödja tidigare rapporterade antaganden och ge nya insikter om metaboliskt flöde i lysates. Ändringar kan också göras inom ramen för metoden för specifika analyser. Till exempel kan standardlösningar av 13C-märkta målföreningar analyseras tillsammans med prover för att uppnå absoluta kvantitativa mätningar av glukosbaserade molekyler över tid och dra slutsatser om flödesfördelningar. Bättre identifiering av positivt laddade föreningar kan också aktiveras i det aktuella arbetsflödet genom att köra sekvenser med .meth-filer justerade för identifiering av positivt läge.
Analytisk provtagning i båda beskrivna metoder är bekvämt automatiserad, vilket säkerställer hög reproducerbarhet. Dessutom kan smidiga analytiska körningar förväntas så länge som lämpliga instrumenthanteringsmetoder och underhåll observeras. När du använder dessa verktyg för att analysera CFME-reaktioner bör mer kritiska överväganden göras uppströms och nedströms provtagning. Under provberedningen är det viktigt att tidskurskontrollerna är representativa för time-zero. Här fälldes proteiner ut i lysater genom försurning för att stoppa metabola reaktioner. För time-zero prover kombinerades syra lösningsmedlet med lysat innan tillsätta reaktion blandningen som innehåller glukos. Försurning med triklorättiksyra säkerställde effektivt att glukos inte metaboliseras vid nollpunkten, vilket visas i HPLC-RID-data (figur 2). Medan ett liknande förfarande som släcker glukosmetabolism utfördes i den rapporterade LC-MS/MS-analysen, upptäcktes 13C-märkta metaboliter i time-zero-prover, om än vid betydligt låga över överflödsvärden i förhållande till prover som extraherats vid senare tidpunkter. Dessutom var dessa observationer begränsade till intermediärer av glykolys. Data tyder på att reaktionerna behåller en viss grad av glykolytisk aktivitet efter försurning med extraktionsmedel som detekteras med denna mycket känsliga metod. Omfattningen av denna verksamhet bör dock kvantifieras. En tidigare studie rapporterade att sura extraktionsmedel kanske inte tillräckligt släcker mellanliggande glykolytiska reaktioner men kan stoppa betydande glukosförbrukning10. Även om detta återstår att undersöka i det system som används här, kan drastiska förändringar i relativa överflödsvärden mellan tid-noll och senare tidpunktsprover tolkas som trender i glukosmetabolism. Att utforska alternativa släckningsmetoder rekommenderas dock i liknande tillämpningar, särskilt för att erhålla absoluta mängder metaboliska intermediärer10. Vidare bör god praxis under programvaruanalyser nedströms också följas. Konsekvens är absolut nödvändigt när man manuellt integrerar toppområden från RID-signaler för att minska den mänskliga faktorn. Manuell integrering bör också tillämpas på toppområden med standarder när manuellt integrerade toppområden används för att kvantifiera metabolitkoncentrationer i prover. Under hela den riktade LC-MS/MS-analysen bör preliminära anteckningar från MZmine-analysen valideras genom manuell toppkontroll med hjälp av en webbläsare av MS-kvalitet, och m/z-funktioner bör endast kommenteras när beräknade massfel är acceptabla. Här utfördes dessa analyser manuellt för en begränsad uppsättning mål eftersom omfattande och robust programvara för isotopsökning ännu inte har fastställts. Sådana automatiserade metoder för att söka 13C-märkta metaboliter håller dock för närvarande på att växa fram och skulle också effektivisera mer komplicerade analyser, som profilering av lysater utöver centralkolmetabolism 25.
Avancerad vätskekromatografi är en robust och allmänt tillämpad metod för att separera små molekyler i komplexa metaboliska blandningar11. De beskrivna metoderna parar denna separationsteknik med brytningsindex eller masspektrometriska detektion för att framgångsrikt analysera metabolit omvandlingar i lysat-baserade CFME reaktioner. HPLC-RID och LC-MS/MS är individuellt kraftfulla verktyg för profilering av aktiv lysatmetabolism, och deras komplementaritet kan ytterligare utnyttjas för att hantera varje tekniks inneboende begränsningar. De rapporterade metoderna möjliggör tillämpning och utveckling av CFME eftersom de kan användas för att förstå lysatmetabolism, övervaka förbättringar i riktade metabolitomvandlingar och klargöra förändringar i metabolitflödet vid manipulatmetabolism.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning sponsrades av Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del av Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory förvaltas av UT-Battelle, LLC, för U.S. Department of Energy enligt kontrakt DE-AC05-00OR22725. Detta manuskript har författats av UT-Battelle, LLC under Kontrakt DE-AC05- 00OR22725 med U.S. Department of Energy. Förenta staternas regering behåller och utgivaren, genom att acceptera artikeln för publicering, erkänner att Usa:s regering behåller en icke-bindande, betald, oåterkallelig världsomspännande licens för att publicera eller reproducera den publicerade formen av detta manuskript, eller tillåta andra att göra det, för amerikanska regeringens ändamål. Energidepartementet kommer att ge allmänheten tillgång till dessa resultat av federalt sponsrad forskning i enlighet med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
| 13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
| 500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
| Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
| Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
| Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
| Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
| Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
| Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
| D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
| Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
| Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
| LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
| Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
| Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
| Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
| Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
| OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
| Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
| Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
| Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
| Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |
References
- Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
- Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
- Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
- Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).
- Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
- Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
- Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
- Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).
- Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
- Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).
- Coskun, O. Separation Tecniques: Chromatography. 3, Kare Publishing. Istanbul. (2016).
- Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
- Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
- Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
- Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
- Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
- Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
- Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
- Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
- Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).
- Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
- Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
- Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).
