Protokollen beskriver högpresterande flytande kromatografi metoder i kombination med brytning index eller masspektrometrisk detektion för att studera metabola reaktioner i komplexa lysat-baserade cell-fria system.
Teknisk cellulär metabolism för riktad biosyntes kan kräva omfattande DBTL-cykler (design-build-test-learn) när ingenjören arbetar kring cellens överlevnadskrav. Alternativt kan dbtl-cykler i cellfria miljöer påskynda denna process och lindra problem med värdkompatibilitet. Ett lovande tillvägagångssätt för cellfri metabolisk teknik (CFME) utnyttjar metaboliskt aktiva råcellsextrakt som plattformar för biotillverkning och för att snabbt upptäcka och prototypa modifierade proteiner och vägar. Att förverkliga dessa funktioner och optimera CFME-prestanda kräver metoder för att karakterisera metabolomen av lysatbaserade cellfria plattformar. Det vill säga analysverktyg är nödvändiga för att övervaka förbättringar i riktade metabolitkonverteringar och för att belysa förändringar i metabolitflödet vid manipulatmetabolism. Här tillämpades metabolitanalyser med högpresterande flytande kromatografi (HPLC) i kombination med antingen optisk eller masspektrometrisk detektion för att karakterisera metabolitproduktion och flöde i E. coli S30 lysater. Specifikt beskriver denna rapport beredningen av prover från CFME lysates för HPLC-analyser med hjälp av brytningsindexdetektering (RID) för att kvantifiera genereringen av centrala metaboliska intermediärer och biprodukter vid omvandling av billiga substrat (dvs. glukos) till olika värdefulla produkter. Analysen av metabolitkonvertering i CFME-reaktioner som matas med 13C-märkt glukos genom omvänd fas flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri (MS/ MS), ett kraftfullt verktyg för att karakterisera specifika metabolitutbyten och lysat metaboliskt flöde från utgångsmaterial, presenteras också. Sammantaget, tillämpa dessa analytiska metoder på CFME lysat metabolism möjliggör utvecklingen av dessa system som alternativa plattformar för att utföra snabbare eller nya metaboliska tekniska uppgifter.
Begränsningar i tekniska mikrober för kemisk produktion kan åtgärdas genom rekapitulering av biokemiska reaktioner in vitro där konkurrerande cellulära överlevnadsfunktioner saknas1. Dessutom är den öppna reaktionsmiljön (dvs. frånvaro av ett cellmembran) mer mottaglig för manipulering och är lättare att övervaka jämfört med levande celler. Detta grundläggande koncept av cellfri metabolisk teknik (CFME) har elegant visats genom rekonstitution av metaboliska vägar för att syntetisera värdefulla kemikalier som väte och monoterpener med produktionsmått som är storleksordningar högre än vad som hittills presenterats i mikrobiella cellfabriker1,2,3 . Metoder för att rena hela vägar begränsas dock för närvarande av tid och kostnad. Alternativt kan cellfria metaboliska system härledas från råcellsextrakt genom snabba och billiga metoder i förhållande till hela vägens rekonstitution4. Den centrala metabolismen som behålls i cellextrakt kan kompletteras med energisubstrat (t.ex. glukos och enzymatiska kofaktorer) och salter i buffrade lösningar för att generera centrala metaboliska prekursorer i över 24 h5,6. Att tillsätta exogena enzymer till den lysatbaserade CFME-reaktionen möjliggör mer komplexa bioomvandlingar av glukos till mer värdefulla kemikalier vid höga titrar4,6,7. Även om utbyte tenderar att äventyras i dessa system på grund av deras cellliknande metaboliska komplexitet, har unika metoder för att kurera lysatproteomer för högre avkastningskonvertering utvecklats och utvecklas7,8.
Den enkla att utföra metaboliska omvandlingar i lysatbaserade cellfria system gör dessa utmärkta plattformar för antingen att flytta kemisk tillverkning utanför cellen helt och hållet eller för prototyper av nya vägar med hög genomströmning innan du bygger och testar dessa mönster in vivo2,9. För antingen applicering är verktyg för övervakning av metaboliska omvandlingar eller observera övergripande förändringar av metaboliskt flöde i lysater integrerade i utvecklingen av CFME. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kan användas för att separera de kemiska beståndsdelarna i CFME-reaktioner med hög upplösning och kan kopplas till optiska eller masspektrometriska detektorer för metabolitklikation5,10. Den underliggande principen för HPLC är att analyter som löses upp i ett lösningsmedel (dvs. mobil fas) och pumpas genom en kolumn kommer att interagera med det specifika kolonnförpackningsmaterialet (dvs. stillastående fas)11. Beroende på deras kemiska egenskaper uppvisar dessa analyter varierande retentionstider innan de så småningom eluteras från den stationära fasen och transporteras av den mobila fasen till en detektor. Denna rapport beskriver beredning och analys av E. coli lysat-baserade CFME reaktioner genom HPLC-baserade metoder som utnyttjar RID och MS/MS detektion.
HPLC i kombination med brytningsindexdetektering (HPLC-RID) är en allmänt tillgänglig metod för att snabbt identifiera centrala metaboliska prekursorer och slutprodukter. Kortfattat mäter RID hur analyter ändrar ljusavböjningen genom den mobila fas12. RID-signaler som motsvarar målanalyter i prover kan sedan kvantifieras genom jämförelser med RID-signaler av standardlösningar. I CFME-applikationer har detta detekteringssätt oftast använts med HPLC-kolumner som separerar föreningar baserat på en kombination av storleksuteslutning och ligand utbytesmekanismer, eller jon-modererad partitionkromatografi5,6,8,13. Denna speciella teknik används för att snabbt kvantifiera konsumtionen av sockersubstrat som glukos samt bildandet av jäsningsprodukter som succinate, laktat, format, acetat och etanol i lysatbaserade CFME-reaktioner8. Registrering av koncentrationsförändringar av dessa föreningar via HPLC har varit användbart för att både klargöra potentialen hos råcellsextrakt för att poola centrala metaboliska prekursorer och förstå hur vägflödet omdirigeras genom fermenterande vägar under komplexa metaboliska omvandlingar från glukos i lysates6,8,14. Seminal CFME studier i E. coli cell extrakt bekräftar att jäsningsföreningar ackumuleras som slutprodukter av glukoskatabolism och förekommer också som oönskade biprodukter i lysates som överuttryck exogenaenzymer 6,15. Det föreslås att fermentativ metabolism spelar en nödvändig roll för att regenerera redox motsvarigheter till kofaktorer (dvs NAD(P)H och ATP) för att upprätthålla glykolytiska reaktioner8. Därför är en HPLC-baserad optisk detektionsmetod utformad för att separera jäsningsprodukter ett användbart och vanligt tillämpat verktyg när man utför olika lysatbaserade CFME-uppgifter.
CFME kan implementeras för att ackumulera metaboliska slutprodukter som inte är kolhydrater, organiska syror eller alkoholer4. Mätningen av intermediärer som konsumeras lika snabbt som de syntetiseras kan också vara önskvärd10. Medan HPLC-RID är tillgängligt när det gäller kostnad och svårighetsgrad, begränsas denna metod av dess förmåga att endast skilja metaboliter baserat på retentionstid. Ett bredare spektrum av metaboliter kan analyseras när flytande kromatografi är kopplade till MS/MS-detektion (LC-MS/MS)16. Med denna metod joniseras analyter i den mobila fasen och detekteras differentiellt baserat på varje molekyls massa och laddningsegenskaper. Kunskap om både metabolitens massa-till-laddning (m/z) förhållande och retentionstid på kolumnen underlättar således separationen av de flesta metaboliska intermediärer och slutprodukter med hög upplösning16. Denna detektionsteknik kan också kopplas till nano-flytande kromatografi, vilket ger mycket lägre flödeshastigheter och provinjektionsvolymer, vilket möjliggör känsligare detektion av små molekyler i den komplexa lysatbakgrunden17. LC-MS/MS kan dessutom appliceras med isotopmärkning eftersom inkorporerade etiketter ger ändringar i analytvärdena m/z18. Tidspunktsmätningar som extraheras från en CFME-reaktion kompletterad med ett 13C 6-glukossubstrat kan därmed bestämma slutet- eller biprodukterna som härrör specifikt från kompletterad glukos. Även om denna isotopspårningsmetod ännu inte tillämpas ofta i CFME-studier, är det ett kraftfullt verktyg för att förstå metaboliska omvandlingar i lysatbaserade CFME-system, särskilt eftersom salt motåtgärder (dvs acetat och glutamat) i dessa reaktioner också kataboliseras som sekundära substrat19. Att utnyttja denna teknik kan således dra en omfattande bild av glukosmetabolism i lysater, vilket till denna dag inte är helt förstått. Här beskriver protokollet en metod för nano-flytande kromatografi kopplad till nanoelektrosprayjonisering (nano ESI) MS/MS som kan användas för att förhöra en möjlig modell av glukosmetabolism, särskilt i E. coli lysates (Figur 1). Modellen är baserad på rapporter om fermenterande vägar och pentosfosfatvägen är aktiv i E. coli lysater som härrör frånstammarsom odlas i rika medier 5,6,8,14. Tekniken används dessutom för att undersöka aminosyraproduktion eftersom nuvarande kunskap om aminosyraanabolism från glukos i lysater är begränsad till några exempel som syntesen av aromatiskaaminosyror 7. Med tanke på slutprodukternas och intermediärens mestadels polära karaktär i dessa vägar (dvs. organiska syror, sockerfosfater och aminosyror) användes omvänd fasad vätskekromatografi här. Denna teknik separerar polära föreningar genom eluering från en icke-polär stationär fas. Dessa föreningar joniserades sedan av nano ESI i negativt jonläge som tillåter påvisande av analyter med minst en negativ elementär laddning och är därmed användbar för att upptäcka sura föreningar. Denna teknik används här för att analysera glukos-härledda 13C-införlivande metaboliter och visar nyttan av LC-MS/MS för att förstå glukosmetabolism i lysater.
Den skisserade HPLC-RID-metoden kan användas för att framgångsrikt kvantifiera sockersubstratkonsumtion och efterföljande omvandlingar till stora organiska syra- och alkoholprodukter av lysatcentral metabolism över tid. Dessutom använder detta protokoll en enkel isokratisk metod med en enda mobil fas, kräver minimal provberedning och möjliggör en enkel riktad nedströmsanalys. Analyter mätta med HPLC-RID-metoden utmärks endast av deras retentionstider och därmed deras interaktioner med det valda kolumnhartset. HPLC-kolumnen som användes här var särskilt utformad för att separera kolhydrater, organiska syror och alkoholer genom att kombinera storleksuteslutning och ligand utbyte (dvs jon-modererad partition kromatografi). Den beskrivna metoden är därför användbar för mer riktad analys av kolhydratsubstrat och utvalda slutprodukter av glukosfermenteringsvägar som främst förväntas underlätta och ge energi åt lysatbaserade bioomvandlingar8,15,21. Detta protokoll tar dock inte hänsyn till aktivering av andra metaboliska vägar i cellextrakt. Rörledningar som använder andra kromatografiska separationsmetoder (dvs. hydrofil interaktionskkromatografi), gradient elueringsmetoder, mer komplicerade provberedningar (dvs. derivatisering) och olika optiska detektorer (t.ex. ultraviolett ljus eller avdunstningsljusspridningsdetektorer) kan användas för att upptäcka andra metaboliter såsom aminosyror och sockerfosfater23,24 . Alternativt kan ett globalt tillvägagångssätt för att studera lysatmetabolism tas med hjälp av LC-MS/MS.
Den beskrivna LC-MS/MS-metoden är ett enda arbetsflöde för att mäta och identifiera ett bredare spektrum av metaboliter. LC-MS/MS är ett toppmodernt analysverktyg för metabolomprofilering på grund av dess känslighet och förmåga att skilja metaboliter genom retentionstid och m/z-förhållanden med hög upplösning16. Med fokus på centrala kol metaboliska vägar och aminosyra anabola, negativt läge MS/MS genomfördes för att specifikt upptäcka polar organiska syror, socker fosfater och aminosyror. Tillsammans med en nano-flytande kromatografiteknik ger metoden hög känslighet för att upptäcka små molekyler i komplex lysatbakgrunden17. När det gäller profilering av lysatbaserad CFME-metabolism är dock en begränsning av det beskrivna LC-MS/MS-protokollet dess nedre detektionsgräns på 50 m/z, vilket utesluter mätning av etanol, en viktig produkt i lysat glukosmetabolism, liksom format, som båda annars lätt kvantifieras med den detaljerade HPLC-RID-metoden. Jämfört med LC-MS/MS har HPLC-RID den extra fördelen av relativ tillgänglighet när det gäller kostnader och svårigheter. Till den senare punkten kan felsökning av LC-MS/MS-metoden som beskrivs här kräva viss grad av expertis inom masspektrometri. Icke desto mindre har MS-detektion unikt tilltalande applikationer över RID eftersom det dessutom kan skilja märkta isotoper i metabolomer, en utmärkt teknik för att förstå kolrörelse från kompletterade substrat genom det komplexa lysatmetaboliska nätverket18. Ett sådant tillvägagångssätt tillämpades här genom att komplettera reaktioner med 13C6-glukosoch analysera de relativa överflödsvärdena för nedströms 13C-införlivande metaboliter. Analysen tillät definitionen av aktiva och inaktiva vägar, stödja tidigare rapporterade antaganden och ge nya insikter om metaboliskt flöde i lysates. Ändringar kan också göras inom ramen för metoden för specifika analyser. Till exempel kan standardlösningar av 13C-märkta målföreningar analyseras tillsammans med prover för att uppnå absoluta kvantitativa mätningar av glukosbaserade molekyler över tid och dra slutsatser om flödesfördelningar. Bättre identifiering av positivt laddade föreningar kan också aktiveras i det aktuella arbetsflödet genom att köra sekvenser med .meth-filer justerade för identifiering av positivt läge.
Analytisk provtagning i båda beskrivna metoder är bekvämt automatiserad, vilket säkerställer hög reproducerbarhet. Dessutom kan smidiga analytiska körningar förväntas så länge som lämpliga instrumenthanteringsmetoder och underhåll observeras. När du använder dessa verktyg för att analysera CFME-reaktioner bör mer kritiska överväganden göras uppströms och nedströms provtagning. Under provberedningen är det viktigt att tidskurskontrollerna är representativa för time-zero. Här fälldes proteiner ut i lysater genom försurning för att stoppa metabola reaktioner. För time-zero prover kombinerades syra lösningsmedlet med lysat innan tillsätta reaktion blandningen som innehåller glukos. Försurning med triklorättiksyra säkerställde effektivt att glukos inte metaboliseras vid nollpunkten, vilket visas i HPLC-RID-data (figur 2). Medan ett liknande förfarande som släcker glukosmetabolism utfördes i den rapporterade LC-MS/MS-analysen, upptäcktes 13C-märkta metaboliter i time-zero-prover, om än vid betydligt låga över överflödsvärden i förhållande till prover som extraherats vid senare tidpunkter. Dessutom var dessa observationer begränsade till intermediärer av glykolys. Data tyder på att reaktionerna behåller en viss grad av glykolytisk aktivitet efter försurning med extraktionsmedel som detekteras med denna mycket känsliga metod. Omfattningen av denna verksamhet bör dock kvantifieras. En tidigare studie rapporterade att sura extraktionsmedel kanske inte tillräckligt släcker mellanliggande glykolytiska reaktioner men kan stoppa betydande glukosförbrukning10. Även om detta återstår att undersöka i det system som används här, kan drastiska förändringar i relativa överflödsvärden mellan tid-noll och senare tidpunktsprover tolkas som trender i glukosmetabolism. Att utforska alternativa släckningsmetoder rekommenderas dock i liknande tillämpningar, särskilt för att erhålla absoluta mängder metaboliska intermediärer10. Vidare bör god praxis under programvaruanalyser nedströms också följas. Konsekvens är absolut nödvändigt när man manuellt integrerar toppområden från RID-signaler för att minska den mänskliga faktorn. Manuell integrering bör också tillämpas på toppområden med standarder när manuellt integrerade toppområden används för att kvantifiera metabolitkoncentrationer i prover. Under hela den riktade LC-MS/MS-analysen bör preliminära anteckningar från MZmine-analysen valideras genom manuell toppkontroll med hjälp av en webbläsare av MS-kvalitet, och m/z-funktioner bör endast kommenteras när beräknade massfel är acceptabla. Här utfördes dessa analyser manuellt för en begränsad uppsättning mål eftersom omfattande och robust programvara för isotopsökning ännu inte har fastställts. Sådana automatiserade metoder för att söka 13C-märkta metaboliter håller dock för närvarande på att växa fram och skulle också effektivisera mer komplicerade analyser, som profilering av lysater utöver centralkolmetabolism 25.
Avancerad vätskekromatografi är en robust och allmänt tillämpad metod för att separera små molekyler i komplexa metaboliska blandningar11. De beskrivna metoderna parar denna separationsteknik med brytningsindex eller masspektrometriska detektion för att framgångsrikt analysera metabolit omvandlingar i lysat-baserade CFME reaktioner. HPLC-RID och LC-MS/MS är individuellt kraftfulla verktyg för profilering av aktiv lysatmetabolism, och deras komplementaritet kan ytterligare utnyttjas för att hantera varje tekniks inneboende begränsningar. De rapporterade metoderna möjliggör tillämpning och utveckling av CFME eftersom de kan användas för att förstå lysatmetabolism, övervaka förbättringar i riktade metabolitomvandlingar och klargöra förändringar i metabolitflödet vid manipulatmetabolism.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning sponsrades av Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del av Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory förvaltas av UT-Battelle, LLC, för U.S. Department of Energy enligt kontrakt DE-AC05-00OR22725. Detta manuskript har författats av UT-Battelle, LLC under Kontrakt DE-AC05- 00OR22725 med U.S. Department of Energy. Förenta staternas regering behåller och utgivaren, genom att acceptera artikeln för publicering, erkänner att Usa:s regering behåller en icke-bindande, betald, oåterkallelig världsomspännande licens för att publicera eller reproducera den publicerade formen av detta manuskript, eller tillåta andra att göra det, för amerikanska regeringens ändamål. Energidepartementet kommer att ge allmänheten tillgång till dessa resultat av federalt sponsrad forskning i enlighet med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |