Omfattende in vitro-modeller , der trofast generobrer den relevante menneskelige sygdom, mangler. Den nuværende undersøgelse præsenterer tre-dimensionelle (3D) tumor spheroid skabelse og kultur, en pålidelig in vitro værktøj til at studere tumor-stromal interaktion i human hepatocellulær karcinom.
Aggressivitet og mangel på veltolereret og bredt effektive behandlinger for avanceret hepatocellulær karcinom (HCC), den fremherskende form for leverkræft, rationalisere sin rang som den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede død. Prækliniske modeller skal tilpasses for at generobre de menneskelige forhold for at vælge de bedste terapeutiske kandidater til klinisk udvikling og støtte leveringen af personlig medicin. Tre-dimensionelle (3D) cellulære spheroid modeller viser lovende som en spirende in vitro alternativ til to-dimensionelle (2D) monolayer kulturer. Her beskriver vi en 3D tumor spheroid model, der udnytter de enkelte cellers evne til at samle, når de vedligeholdes i hængende dråber, og er mere repræsentativ for et in vivo-miljø end standardmonomer. Desuden kan 3D-spheroider produceres ved at kombinere homotypice eller heterotypice celler, mere reflekterende af den cellulære heterogenitet in vivo, potentielt muliggør undersøgelse af miljømæssige interaktioner, der kan påvirke progression og behandling svar. Den nuværende forskning optimerede celletætheden til at danne 3D homotypic og heterotypic tumorspheroider ved at immobilisere celleaffjedring på lågene på standard 10 cm3 Petriskåle. Langsgående analyse blev udført for at generere vækstkurver for homotypic versus heterotypic tumor / fibroblaster spheroids. Endelig blev de proliferative virkninger af fibroblaster (COS7-celler) og levermyofibroblaster (LX2) på homotypic tumor (Hep3B) spheroider undersøgt. En såningstæthed på 3.000 celler (i 20 μL-medier) gav med succes Huh7/COS7 heterotypic spheroids, som viste en støt stigning i størrelse op til kultur dag 8, efterfulgt af væksthæmning. Dette fund blev bekræftet ved hjælp af Hep3B homotypic spheroids dyrkes i LX2 (human hepatisk stellate celle linje) betinget medium (CM). LX2 CM udløste spredningen af Hep3B spheroids sammenlignet med kontrol tumorspheroider. Afslutningsvis har denne protokol vist, at 3D tumorspheroider kan bruges som et simpelt, økonomisk og prescreen in vitro-værktøj til at studere tumor-stromale interaktioner mere omfattende.
Den globale forekomst og dødelighed fra leverkræft er fortsat med at stige, på trods af fremskridt i behandlinger for leversygdom og de fleste andre former for kræft. I 2018 overgik leverkræft kolorektal og mavekræft for at blive den næsthyppigste årsag til kræftrelateret død globalt1. I 2020 var der mere end 9.00.000 nye diagnoser, der tegner sig for 4,7% af de samlede kræfttilfælde på verdensplan1. Dette er især skuffende, da de væsentlige risikofaktorer for udviklingen af HCC, den mest almindelige form for leverkræft, er godt karakteriseret2. Skrumpelever er den mest almindelige risikofaktor for udviklingen af HCC, med 80% af tilfældene udvikler sig på baggrund af etablerede skrumpelever2. Kroniske leversygdomme, som udvikler sig til skrumpelever, og dermed HCC, omfatter Hepatitis B-virus (HBV), Hepatitis C-virus (HCV), alkohol-relaterede leversygdom (ARLD), ikke-alkoholiske fedtlever sygdomme (NAFLD) – sidstnævnte tilskrives fedme og type 2 diabetes mellitus (T2DM)2,3. De nuværende forvaltningsprotokoller for HCC er faseafhængige og begrænsede for dem med fremskreden kræft, som oftest har et dårligt resultat4. Der har været betydelige fremskridt ved hjælp af kinase hæmmere og, for nylig, immun-onkologi behandlinger, men realistisk, gavner kun et mindretal af patienter med fremskreden leverkræft5. Desuden er der bekymring for, at HCCs opstår hos patienter med NAFLD – den hurtigst voksende underliggende årsag, der tegner sig for mere end 50% af nydiagnosticerede HCC tilfælde i vestlige nationer, kan være mere resistente over for programmeret død 1 (PD1) checkpoint hæmmer terapi6.
Der har været en massiv investering i kliniske forsøg for patienter med HCC, herunder betydelige forbedringer i kliniske forsøg og deres endpoints7. Efter et årti med fiaskoer er disse investeringer begyndt at ændre patienternes muligheder. Virkeligheden er imidlertid, at den samlede andel af respondenter fortsat er relativt dårlig, med patienter rekrutteret til forsøg ofte dårligt repræsenterer dem, der passes i klinikkerne. Faren er, at fremskridtene er dyre og gavner de få snarere end de mange. Efterhånden som der opstår flere kandidatbehandlinger til engangsbrug eller kombination, er det vigtigt at have prækliniske modeller mere prædiktive for in vivo-reaktioner. Disse vil sandsynligvis være modeller, der inkorporerer yderligere faktorer, der bidrager til variationen set i patientens reaktioner, der bedre afspejler menneskelig HCC-heterogenitet og patologisk kompleksitet8. Systemer, der genskaber de in vivo patofysiologiske tilstande i HCC er nødvendige for at hjælpe med at forstå biologi tumor evolution, vækst og progression. De eksisterende eksperimentelle modeller for kroniske leversygdomme og HCC falder normalt ind under tre hovedkategorier: in vivo dyrebaserede modeller (gennemgået i 9), in vitro-kulturer10 og ex vivo11,12 modeller. Dyrebaserede tilgange anvendes i vid udstrækning til at studere kroniske leversygdomme, herunder HCC; Den genetiske variation, høje driftsomkostninger og de forskellige immunsystemer mellem arter er imidlertid blandt de vigtigste begrænsninger for anvendelsen af sådanne modeller9. Mens nogle ex vivo modeller giver et glimrende værktøj til at fokusere på humane væv i forhold til andre in vitro celle linje modeller, væv tilgængelighed og den begrænsede eksperimentelle tid kursus hindre deres udnyttelse i stor skala.
På den anden side er in vitro-cellelinjemodellerne fortsat en god mulighed for forskere, der arbejder med begrænsede ressourcer, med et mindre behov for at have en konstant forsyning af frisk humant væv10. Disse modeller giver også et værktøj, der kan bruges som en første skærm til at hjælpe med mål validering af lægemiddelvalg, før du går videre til mere komplekse in vivo modeller. Den nylige ændring af de traditionelle 2D monolayer kulturer i 3D-kulturer har forbedret effekten af disse in vitro-modeller13,14.
3D in vitro-modeller kan generobre kritiske funktioner, der ses under menneskelige normale og patologiske forhold. Under fysiologiske forhold indledes signaltransduktion gennem cellulær krydstale og interaktion med andre bindevævsmolekyler, nemlig de ekstracellulære matrixproteiner (ECM), der danner et 3D-interaktionsnetværk15,16. Tumoren udvikler sig i en 3D sfærisk form under ondartet transformation, for hvilken ilt og næringsstoffer er let rigelige i ikke-tumor / tumor interfase. Samtidig dominerer hypoxiske tilstande ved tumorkernen. Denne heterogenitet i næringsstof tilgængelighed resulterer i aktivering af rumligt forskellige signalering og metaboliske veje, der regulerer tumorigenese. Disse betingelser er dårligt rekapituleret i de konventionelle 2D monolayer kulturer14, hvor celler vokser på stiv kultur plast på en fysiologisk irrelevant måde. Kræftceller kommunikerer også med andre ikke-parenkymale celler, den primære kilde til ECM, vækst, og invasion signalering inden for tumor mikromiljø. I modsætning til 2D-kulturer kan 3D in vitro-modeller give en mere passende platform til at studere denne tumor-stromal interaktion17.
3D-modeller er meget udbredt i HCC-feltet, og de varierer i den måde, mikrovævet dannes18,19,20,21,22,23. De fleste af disse modeller brugte enten de ultralave bindingsplader18,19,20,21,22 eller trans-brønde23 i processen med spheroid dannelse. Protokollen beskrevet introducerer hængende dråbe teknik som en alternativ, plast-fri, og omkostningseffektiv in vitro 3D tumor spheroid model. Dette kan lette vurderingen af parakrine og autokrine roller fibroblaster på spredningen af tumorceller i et 3D-format.
Den sammenhæng, hvori de eksperimentelle cellelinjer vokser, påvirker deres genekspressionsprofil, vejanalyse og funktionelle kriterier. For eksempel, i brystkræftceller, koordineringen mellem forskellige onkogne veje bevares kun, hvis kræftceller dyrkes i 3D kropsbygning27. Deregulerede gener i 3D melanom og brystkræft spheroider, men ikke i monolayer celler, er mere relevante for in vivo menneskelige tumor28,29. For eksempel var β1 integrinniveauer i bryst epitelceller og tumormodstykker lavere end niveauer dyrket i et 2D-format29. Desuden har fibroblaster i 3D-strukturer tendens til at migrere tydeligt med hensyn til morfologi og hastighed sammenlignet med dem, der dyrkes på plast30. Derudover aktiverer vækstsubstratets mekaniske stivhed specifikke veje, der fremmer ondartet transformation af normale epitelceller via deregulering af den ekstracellulære signalregulerede kinase (ERK) / Rho i epitelceller31. Disse faktorer favoriserer overgangen fra konventionel 2D-kultur til 3D spheroid modeller, som 3D-kulturer er mere i overensstemmelse med menneskers sygdom.
Den nuværende undersøgelse brugte konventionelle laboratorieværktøjer og forsyninger til at producere en 3D tumor spheroid model. De dannede spheroids reagerede på spredningssignalerne fra fibroblaster, som det fremgår af deres signifikant øgede vækst. Denne model tilhører kategorien flercellede tumorspheroider. Der er tre andre kategorier af 3D tumor spheroids, herunder tumorosfærer32, væv-afledt tumor kugler33,34, og organotypic multicellulære spheroids35. I flercellede tumorspheroider suspenderes tumorceller under lav vedhæftningsforhold, så de kan samles sammen for at danne kugler uden at røre bunden af kulturbeholderen36. Flere tilgange er blevet anvendt til at levere denne forankring-uafhængig teknik, lige fra roterende systemer, flydende overlay teknikker, og ubestrøget ultra-lav vedhæftet fil U-formede plader37. I HCC bruger de fleste in vitro spheroid-kulturer de ultralave fastgørelsesplader 24- eller 96-brøndplader til at danne afrundede spheroids18,19,20,21,22. Denne teknik er dog ikke omkostningseffektiv og udelukker ikke nogen utilsigtet celleplastkontakt. Andre systemer bruger trans-brønde23 eller lever skiver12 til at producere lever mikro-væv. Brug af humane væv i translationelt arbejde er guldstandarden, men ikke altid tilgængelig eller tilgængelig for mange forskningsgrupper. Den nuværende tilgang nydt godt af den hængende dråber teori. Celle suspension er tilføjet, således at tumor spheroids er dannet i en tilgængelig flydende luft interface til at danne enkelt afrundede kugler38. Fordele ved at bruge denne teknik er manglen på enhver celle-plast kontakt og den lethed at studere autokrine og parakrine krydstale mellem tumor og fibroblast celler. Denne model blev yderligere valideret i en anden undersøgelse, der tydede betydningen af den ikke-parenkymale TREM2 for at beskytte leveren mod HCC-udvikling39. Dette arbejde viste, at mængden af både Hep3B og PLC/PRF5 spheroids var højere i kontrol LX2 CM versus TREM2-overekspressing LX2 CM i en Wnt-afhængig måde39.
I den nuværende undersøgelse blev fibroblaster blandet med tumorceller før spheroid dannelse for at undersøge de proliferative virkninger af denne co-kultur. Andre har tilføjet fibroblaster, endotelceller, og immunceller med tumorcelle suspension efter at have dannet en tumor spheroid at studere stromal celle migration i tumor40,41. Den nuværende heterotypic spheroid model viste et lignende vækstmønster til de tidligere rapporterede modeller og den oprindelige in vivo tumor; spheroids viser eksponentiel vækst efterfulgt af en forsinket vækstfase, sandsynligvis på grund af udtømning af næringsstoffer og udvidelse af den nekrotiske kerne42. I stedet for at tilføje vækstfaktorer og mitogener for at hjælpe spheroid dannelse, denne undersøgelse brugt en mere fysiologisk tilgang ved at have disse vækstfaktorer fra direkte kontakt med fibroblaster eller deres sekretom i fibroblast CM. Det er vigtigt at nævne, at LX2-celler kan aktiveres yderligere ved behandling med TGFβ1 eller PDGF43. LX2-celler er blevet behandlet med 10 ng/mL TGFβ1 i 48 timer, før mediet fjernes til forskellige eksperimentelle indstillinger. LX2-celler blev vasket tre gange med PBS (for at udelukke enhver direkte TGFβ1-effekt), og derefter blev der tilføjet friske medier i yderligere 24 timer, før CM blev indsamlet. CM indsamlet fra TGFβ1-stimuleret LX2 induceret Hep3B spheroids vækst i en højere hastighed end CM fra kontrol LX2 (data ikke vist). Dette fleksible system kan egne sig til co-kulturer af forskellige kræftceller plus / minus fibroblaster, samt patient-afledte linjer. Det kan også tilbyde en medium-throughput screening assay for lægemidler, der hurtigt kunne vedtages og indsættes i en translationel drug discovery pipeline til at informere dosering for in vivo undersøgelser.
En begrænsning af den nuværende undersøgelse er brugen af de udødeliggjorte cellelinjer i spheroid dannelse snarere end frisk isolerede HCC tumorceller og kræft-associerede fibroblaster. En anden begrænsning er at sammenligne den homotypic Hep3B spheroid vækst mellem CM fra LX2 og i friske medier i stedet for CM fra andre ikke-fibroblast cellelinjer. Sidstnævnte begrænsning kunne løses ved genetisk modifikation af et gen af interesse i fibroblaster efterfulgt af anvendelse af CM fra vilde type versus genetisk manipuleret fibroblast til homotypic spheroids.
The authors have nothing to disclose.
MYWZ er finansieret af Ministeren for Erhverv, Energi og Industriel Strategi og Newton-prisen 2020 som en del af Storbritanniens officielle udviklingsbistand “ODA” og Newton-fond. SS er støttet af Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist stipendium C53575/A29959. SS, FO og HR modtager støtte som en del af HUNTER, finansieret gennem et partnerskab mellem Cancer Research UK, Fondazione AIRC og Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.
1x Trypsin | Sigma Aldrich | 59429C | |
2 mL tubes | Eppendorf | ||
Biorender | Biorender.com | Online | |
Class II laminar flow BioMAT2 hood | Medair Technologies | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Biosera | M-D1107 | |
Excel sofware | Microsoft office 365 | ||
Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS) | life tech | 105000064 | |
Image J software | Fiji | ||
L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513-100ml | |
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
Petri dish 90 mm, triple vented | Greiner | 633175 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket | Rely+On™ | SCI-129999 | |
Ziess inverted microscope | Ziess |