रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान में एक शक्तिशाली उपकरण हैं, जो रोग की आनुवंशिक और फेनोटाइपिक विषमता और व्यक्तिगत कैंसर विरोधी उपचारों की प्रतिक्रिया दोनों को दर्शाते हैं। यहां, फेनोटाइपिक विश्लेषण और दवा प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन की तैयारी में मानव प्राथमिक मूत्राशय के कैंसर पीडीओ उत्पन्न करने के लिए एक समेकित प्रोटोकॉल विस्तृत है।
वर्तमान इन विट्रो चिकित्सीय परीक्षण प्लेटफार्मों में ट्यूमर पैथोफिजियोलॉजी के लिए प्रासंगिकता की कमी है, आमतौर पर ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर दो आयामी (2 डी) संस्कृतियों के रूप में स्थापित कैंसर सेल लाइनों को नियोजित किया जाता है। ट्यूमर जटिलता के अधिक प्रतिनिधि मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जो चिकित्सीय प्रतिक्रिया और संवेदनशीलता की सटीक भविष्यवाणी कर सकती है। ताजा ट्यूमर ऊतकों से व्युत्पन्न रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) के तीन आयामी (3 डी) पूर्व विवो संस्कृति के विकास का उद्देश्य इन कमियों को दूर करना है। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग नियमित नैदानिक प्रबंधन के समानांतर ट्यूमर सरोगेट्स के रूप में किया जा सकता है ताकि संभावित प्रभावी हस्तक्षेपों की पहचान करके चिकित्सीय निर्णयों को सूचित किया जा सके और उन उपचारों को इंगित किया जा सके जो व्यर्थ हो सकते हैं। यहां, इस प्रक्रिया का उद्देश्य ताजा, व्यवहार्य नैदानिक ऊतक से मूत्राशय के कैंसर पीडीओ को स्थापित करने के लिए रणनीतियों और एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। हमारे अच्छी तरह से स्थापित, अनुकूलित प्रोटोकॉल रोगियों या रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) ट्यूमर सामग्री से सीधे सीमित और विविध शुरुआती सामग्री का उपयोग करके प्रयोगों के लिए 3 डी संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए व्यावहारिक हैं। इस प्रक्रिया को मानक ऊतक संस्कृति उपकरणों से सुसज्जित अधिकांश प्रयोगशालाओं द्वारा भी नियोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पूर्व विवो सरोगेट के रूप में किया जा सकता है ताकि यूरोलॉजिकल कैंसर पैथोलॉजी को रेखांकित करने वाले आणविक तंत्र दोनों को समझा जा सके और नैदानिक प्रबंधन को सूचित करने के लिए उपचार का मूल्यांकन किया जा सके।
मूत्राशय का कैंसर सबसे प्रचलित मूत्र पथ का कैंसर है और दुनिया भर में दसवां सबसे आम मानव दुर्दमताहै। इसमें रोग 2 के आनुवंशिक रूप से विविध और फेनोटाइपिक रूप से जटिल स्पेक्ट्रम शामिलहैं। मूत्राशय के कैंसर (NMIBC) के यूरोथेलियल गैर-मांसपेशी-आक्रामक रूप सबसे आम मूत्राशय के कैंसर का निदान (70% -80%) हैं, और ये कैंसर काफी जैविक विषमता और परिवर्तनीय नैदानिक परिणाम 2,3,4 प्रदर्शित करते हैं। एनएमआईबीसी वाले रोगियों को आमतौर पर रोग पुनरावृत्ति (50-70%) के उच्च जोखिम का अनुभव होता है और एक तिहाई कैंसर प्रगति करेगा और काफी अधिक आक्रामक मांसपेशियों-आक्रामक मूत्राशय के कैंसर (एमआईबीसी) 2 में विकसित होगा। हालांकि NMIBC के लिए 5 साल की जीवित रहने की दर उच्च (>90%) है, इन रोगियों को दीर्घकालिक नैदानिक प्रबंधनसे गुजरना चाहिए। दूसरी ओर, स्थानीय रूप से उन्नत (अपरिवर्तनीय) या मेटास्टैटिक एमआईबीसी को आमतौर पर लाइलाज6 माना जाता है। नतीजतन, मूत्राशय के कैंसर में कैंसर की देखभाल के भीतर उच्चतम आजीवन उपचार लागतों में से एक है और यह व्यक्ति और स्वास्थ्य देखभाल प्रणालीदोनों के लिए एक महत्वपूर्ण बोझ है। उन्नत बीमारी में अंतर्निहित आनुवंशिक विपथन मूत्राशय के कैंसर के चिकित्सीय प्रबंधन को एक नैदानिक चुनौती प्रदान करता है, और इनवेसिव यूरोथेलियल ट्यूमर के लिए चिकित्सीय विकल्प हाल ही में उन्नत और उच्च जोखिम वाले एनएमआईबीसी 8,9 दोनों के लिए इम्यूनोथेरेपी के अनुमोदन के बाद से सुधार हुआ है। वर्तमान में, नैदानिक निर्णय लेने को पारंपरिक नैदानिक और हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं द्वारा निर्देशित किया गया है, व्यक्तिगत मूत्राशय के कैंसर के ट्यूमर के बावजूद रोग आक्रामकता और चिकित्सा10 की प्रतिक्रिया में बड़े अंतर दिखाते हैं। व्यक्तिगत रोगी के पूर्वानुमान और प्रभावी उपचारों की पहचान की भविष्यवाणी में सुधार करने के लिए नैदानिक रूप से उपयोगी मॉडल में अनुसंधान में तेजी लाने की तत्काल आवश्यकता है।
त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड्स ट्यूमर मॉडल के रूप में महान क्षमता दिखाते हैं क्योंकि विवो आर्किटेक्चर और फार्माकोजीनोमिक प्रोफाइल में मूल ट्यूमर के आंतरिक को आत्म-व्यवस्थित और पुन: व्यवस्थित करने और पुन: प्राप्त करने की उनकी क्षमता, और मूल ऊतक की मूल सेलुलर कार्यक्षमता को दर्पण करने की उनकी क्षमता जिसमें से उन्हें व्युत्पन्न किया गया था11,12,13 . यद्यपि स्थापित मूत्राशय कैंसर सेल लाइनें आसानी से उपलब्ध हैं, अपेक्षाकृत लागत प्रभावी, स्केलेबल और हेरफेर करने के लिए सरल हैं, इन विट्रो सेल लाइनें काफी हद तक नैदानिक मूत्राशय के कैंसर12,14 में देखे गए विविध आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों के स्पेक्ट्रम की नकल करने में विफल रहती हैं और सभी 2 डी, अनुयायी संस्कृति स्थितियों के तहत स्थापित और बनाए रखी गई थीं। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक और मेटास्टैटिक मूत्राशय ट्यूमर से व्युत्पन्न सेल लाइनें मूल ट्यूमर सामग्री से महत्वपूर्ण आनुवंशिक विचलन को आश्रय देती हैं। 8,15.
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर और कार्सिनोजेन-प्रेरित माउस मॉडल का उपयोग करना है। हालांकि, जबकि ये मॉडल मानव नियोप्लासिया में शामिल कुछ प्राकृतिक ऑन्कोजेनिक कैस्केड (संदर्भ16,17,18 में समीक्षा की गई) को दोहराते हैं, उनमें ट्यूमर विषमता की कमी है, महंगे हैं, खराब आक्रामक और मेटास्टैटिक मूत्राशय के कैंसर का प्रतिनिधित्व करते हैं, और तेजी से अवधि के दवा परीक्षण के लिए व्यवहार्य नहीं हैं क्योंकि ट्यूमरको 14,19 विकसित करने में कई महीने लग सकते हैं। . कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न मॉडल (ऑर्गेनोइड्स सहित, सशर्त रूप से पुन: प्रोग्राम किए गए प्राथमिक सेल संस्कृति, और20) नैदानिक उपचार से पहले दवा उपचार के प्रभावों को समझने के लिए अमूल्य अवसर प्रदान करते हैं। इसके बावजूद, कुछ समूह नियमित रूप से ताजा प्राथमिक रोगी ऊतक तक सीमित पहुंच के कारण इन रोगी-समीपस्थ मॉडल का उपयोग करते हैं और रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीओ) संस्कृति की स्थिति को पुन: उत्पन्न करने के लिए आवश्यक व्यापक अनुकूलन। एक इन विवो सेटिंग में, ऑन्कोजेनिक कोशिकाएं आसपास के घटकों की विभिन्न रचनाओं के साथ बातचीत और संवाद कर सकती हैं, जिसमें स्ट्रोमल कोशिकाएं, ऊतक घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाएं और मैट्रिक्स12 शामिल हैं। इसी तरह, 3 डी प्रारूप में उगाए गए पीडीओ के लिए, सेलुलर / मैट्रिक्स जटिलता को अन्य प्रासंगिक घटकों को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। पीडीओ को तेजी से उत्पन्न किया जा सकता है और अक्सर21,22,23 परिमित जीवनकाल होने के बावजूद, बाद में उपयोग के लिए बड़े पैमाने पर पारित या क्रायोप्रिजर्व्ड किया जा सकता है। फार्माकोडायनेमिक्स (यानी, एक दवा की प्रतिक्रिया) का मूल्यांकन कई रीड-आउट का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें ऑर्गेनोइड व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री लक्ष्यों या ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के लक्षण वर्णन शामिल हैं।
यहां, मूत्राशय के ट्यूमर (TURBT) के ट्रांसयूरेथ्रल लकीर या मूत्राशय (कट्टरपंथी सिस्टेक्टोमी) के सर्जिकल हटाने से एकत्र रोगी सामग्री से मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। पीडीओ उत्पन्न करने की विधि को आसानी से उपलब्ध गीली प्रयोगशाला सामग्री और उपकरणों का उपयोग करके सचित्र किया गया है। समापन बिंदु में सेल रूपात्मक विशेषताओं और व्यवहार्यता में परिवर्तन शामिल हैं। इन्हें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, इन विट्रो व्यवहार्यता (चयापचय और कोशिका झिल्ली अखंडता) assays, और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण का उपयोग करके मापा गया था। चित्रा 1 वैकल्पिक सर्जरी के दौरान प्राप्त नैदानिक सामग्री से मानव मूत्राशय के कैंसर पीडीओ की स्थापना के लिए वर्कफ़्लो दिखाता है।
जबकि मूत्राशय के कैंसर के ऊतकों से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल अभी भी अपने बचपन में हैं, वे सक्रिय अनुसंधान और नैदानिक जांच का एक क्षेत्र हैं। यहां, मूत्राशय के कैंसर पीडीओ को सफलतापूर्वक स्थापित ?…
The authors have nothing to disclose.
हम Translational Research Institute Histology core और Biological Resource Facility की तकनीकी सहायता को स्वीकार करते हैं। इस शोध को राजकुमारी एलेक्जेंड्रा रिसर्च फाउंडेशन पुरस्कार (I.V., E.D.W.), और मेडिकल रिसर्च फ्यूचर फंड (MRFF) रैपिड एप्लाइड रिसर्च ट्रांसलेशन प्रोग्राम (कैंसर के व्यक्तिगत विश्लेषण के लिए केंद्र (CPAC) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था; E.D.W., I.V.)। ट्रांसलेशनल रिसर्च इंस्टीट्यूट को ऑस्ट्रेलियाई सरकार से समर्थन प्राप्त होता है।
1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
37°C incubator | |||
37°C water bath | |||
50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
70% (w/w) ethanol | |||
-80°C freezer | |||
96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
Computer system | |||
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
Dry and wet ice | |||
Esky | |||
Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
Liquid nitrogen | |||
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
Scale | |||
Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
Urine specimen jar | |||
Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |