Detta protokoll beskriver en metod för att effektivt extrahera levande nematoder från naturliga substrat i fältet.
Förutom att vara robusta experimentella modellorganismer är Caenorhabditis elegans och dess släktingar också riktiga djur som lever i naturen. Studier av vilda nematoder i deras naturliga miljöer är värdefulla för att förstå många aspekter av biologi, inklusive de selektiva regimer där distinkta genomiska och fenotypiska tecken utvecklas, den genetiska grunden för komplex dragvariation och den naturliga genetiska mångfalden som är grundläggande för alla djurpopulationer. Detta manuskript beskriver en enkel och effektiv metod för att extrahera nematoder från deras naturliga substrat, inklusive ruttande frukter, blommor, svampar, lövskräp och jord. Baermann-trattmetoden, en klassisk nematologiteknik, isolerar selektivt aktiva nematoder från sina substrat. Eftersom det återvinner nästan alla aktiva maskar från provet, möjliggör Baermann trattteknik återhämtning av sällsynta och långsamt växande genotyper som samexisterar med rikliga och snabbväxande genotyper, som kan missas i extraktionsmetoder som involverar flera generationer av reproduktion. Tekniken är också väl lämpad för att ta itu med metagenetiska, populationsgenetiska och ekologiska frågor. Det fångar hela befolkningen i ett prov samtidigt, vilket möjliggör en opartisk bild av den naturliga fördelningen av åldrar, kön och genotyper. Protokollet möjliggör distribution i stor skala på fältet, vilket snabbt omvandlar substrat till maskplattor, och författarna har validerat det genom fältarbete på flera kontinenter.
Värdefulla biologiska insikter växer fram när forskare som studerar C. elegans i labbet utökar sitt fokus till C. elegans och relaterade rabditid nematoder i naturen. Studier av vilda nematoder placerar gener och genom i sitt naturliga sammanhang, vilket avslöjar funktioner som potentiellt skyms av laboratorieförhållanden1,2,3,4,5. Dessa studier genererar insikter om förutsättningarna för själva evolutionen, genetisk variation6,7,8,9,10. Den naturliga genetiska variationen som fångas av vilda prover ger också inbrytningar i den genetiska grunden för många komplexa egenskaper11,12,13.
Vid utformning av studier som kräver isolering av naturliga populationer av nematoder, särskilt när man utför distansarbete, kommer praktiska överväganden fram. Detta protokoll syftar till att rent isolera hela populationer av aktiva nematoder som kan odlas på OP50 från bete eller vilda substrat. Metoden är väl lämpad för att extrahera frilevande rabditid och diplogasterid nematoder, inklusive Caenorhabditis, Oscheius och Pristionchus.
Det finns många tekniker för att isolera nematoder från deras substrat14,15. Det mest grundläggande tillvägagångssättet är att placera substratet direkt på en nematod-mediumplatta och plocka djur när de kryper ut8,15. Den här metoden kräver stora mängder tid och arbete om målet är att isolera alla nematoder från ett prov. Mer sofistikerade tekniker drar nytta av djurens vikt, storlek, rörlighet eller någon kombination av dessa14. Varje metod har sina fördelar och nackdelar när det gäller installation och dataflöde. De skiljer sig också åt i sina provtagningsförskjutningar och kan välja för vissa nematoder om djuren i provet varierar längs axeln i metodens separationsprincip.
Baermann-trattmetoden beskrevs först 1917 av den holländska läkaren G. K. T. F. Baermann, som uppfann enheten på Java medan han studerade jordlevande nematoder, inklusive den parasitiska hakmasken16. Baermanntratten fungerar som bygger på principen om rörlighet. Substratet placeras i en tratt fodrad med ett tyg- eller pappersfilter (en “Kimwipe” används för denna studie, kallad “luddfri våtservett” i det aktuella protokollet) och förseglas i botten. Tratten fylls sedan med vatten och dränks i provet medan filtret separerar det från det förseglade utloppet. Aktiva nematoder i provet släpper sig i vattnet och simmar genom filtret och sätter sig så småningom längst ner i tratten. Trattutloppet öppnas och en droppe nematoder utvisas på en tallrik (figur 1).
Figur 1: Sammanfattning av Baermanntratttekniken. B) Dränka provet i en Baermanntratt och vänta på att maskar ska slingra sig ut och sjunka. (C) Släppa en enda droppe från tratten. D) Flytta enstaka hermafroditer eller parade honor till separata plattor. Illustration skapad av Ramin Rahni. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Baermann-tratten fungerar inte för alla typer av nematod (se diskussionsavsnitt för specifika alternativ) och passar bäst för dem som är aktiva former i storleksintervallet caenorhabditis eller mindre14. Men om en studie kan använda Baermann-tratten finns det många fördelar. Metoden är praktisk på fältet och kräver begränsad installation, praktisk tid och kostnad. Forskaren lämnas med ett rent prov utan obstruktion av substratet på plattan, vilket gör det enkelt att plocka. Användning av ett filter förhindrar också förorening av plattan av insektslarver eller kvalster, som tuggar upp plattor eller byte på nematoder i provet. Viktigast av allt är att Baermann-tratten effektivt extraherar nästan hela populationen från substratet14, vilket kan krävas beroende på studiens design. Till exempel kan forskare som är intresserade av att räkna vilda populationers stadium eller könsfördelning, hitta långsamt växande eller sällsynta genotyper eller provtagning av nematoder som inte lockas till OP50 dra nytta av denna metod. Detta är lämpligt för forskare som studerar ekologiska17-, populationsgenetiska18– eller metagenetiska19-frågor eftersom provtagningssystemet tar en ögonblicksbild av populationen vid provtagningstiden.
Det nuvarande manuskriptet beskriver ett komplett protokoll för att isolera populationer av nematoder med hjälp av Baermann-tratten och upprätta isofemale- och isohermafroditlinjer i fältet, med hjälp av utrustning som valts för enkel transport. För forskare som utför fältarbete nära sina laboratorier kan många av dessa steg utelämnas eller förenklas.
Den centrala principen för denna metod är att nematoder kommer att passera genom vävnaden nedsänkt i vatten, medan deras substrat och större ryggradslösa föroreningar inte kommer att göra det. De kritiska stegen i protokollet är (1) insamling av ett lämpligt substrat, (2) nedsänkning av substratet, insvept i ett filtreringsmaterial, i vatten, (3) samla maskar som har passerat genom filtret och sjunkit till botten av vattnet och (4) isolera enskilda maskar för att skapa isofemale- eller isohermafroditelinjer. Alla andra delar av metoden är mottagliga för modifiering vid behov beroende på tillgängliga resurser, substratens art eller fältarbetesmålen. Vissa ändringar som är värda att överväga är följande.
Bete maskarna genom att plantera frukt
Om det inte finns gott om bakterierikt ruttande material på fältområdet, kan man vilja ta med ett prov, till exempel en bit äpple eller tomat, för att lämna att ruttna. Fäst betet bra med några insatser så att större djur inte tar bort dem och så att det lätt kan hittas senare för insamling. Undvik direkt solljus, där betet kan torka innan det ruttnar.
Konstruera trattapparat av alla tillgängliga material
Alla strukturer med hål som är tillräckligt stora för att rymma slangklämman och tillräckligt stabil för att stödja en topptung tratt fungerar. För en enda tratt är ett dricksglas en lämplig hållare. Alla typer av vävnader – ansiktsvävnad, toalettpapper eller pappershanddukar – kan användas.
Att lägga mindre material i trattar, eller justera väntetiden, för att förhindra hypoxi eller infektion
Om provet har en mycket hög koncentration av maskar eller bakterier kan nematoder börja dö av hypoxi eller infektion innan inkubationen på 12 timmar är klar. Om detta är ett problem kan forskaren kontrollera trattar tidigare eller förbereda en extra tratt med ett mycket litet delprov av det mycket befolkade substratet.
Anpassning av NGM-plåtpreparatet till experimentella behov och begränsningar
NGM-plattor kan beredas med vilken media och livsmedelskälla som helst som är lämplig för experimentet. Fältprotokollet som beskrivs ovan är utformat för att minimera bagagevikten. Beroende på bagagebegränsningar och fältarbetestid kan det vara att föredra att ta med redan hällda NGM-plattor – antingen förberedda i labbet eller köpta kommersiellt – än att hälla tallrikar på fältet.
Utföra trattisoleringen i laboratoriet
Protokollet beskriver genomförandet av hela proceduren under fältförhållanden för att fånga nematodpopulationen så som den förekommer i naturen. För vissa forskningsmål kan det vara tillräckligt att isolera nematoder senare, efter att ha rest tillbaka till labbet med prover i förseglade påsar. Även då ger Baermann-trattmetoden ett renare och komplett prov av de överlevande nematoderna än andra isoleringsmetoder. Prover i förseglade påsar kan dock uppleva urval under resan, eftersom de utsätts för potentiella extrema temperaturer och hypoxi. Detta kan minimeras genom att utföra isoleringar så snart som möjligt efter provsamling.
En vanlig alternativ metod till Baermann-tratten innebär att placera substratet direkt på en NGM-platta och vänta på att maskar ska krypa ut, vilket antingen är mycket arbetsintensivt eller resulterar i ofullständig insamling av befolkningen. Det ger också plattor förorenade med kvalster och insektslarver. Baermann-trattmetoden är en billig, lågteknologisk strategi med låg arbetskraft för att snabbt separera hela populationen av aktiva maskar från deras substrat.
Baermann-trattmetoden är inte allmänt tillämplig för insamling av alla typer av vilda nematoder. Vissa växtlevande nematoder tar mycket längre tid än 12 timmar att komma ut från sitt substrat och kommer att vara frånvarande från en droppe som släpps för tidigt, medan vissa insektsparasiter kommer att krypa till toppen av tratten snarare än botten, vilket också undviker insamling14. Alternativ till Baermann-tratten kräver antingen mer specialiserad utrustning eller mer arbete för att återställa maskarna. De kan dock fortfarande föredras om förbehållen ovan är ett problem för experimentet. Alternativa alternativ, som granskats av van Bezooijen14, inkluderar trattspraymetoden, som ger en konstant dimma av vatten till trattar, tillsätter syre och tillåter överflöd av bakterier i suspension. Detta möjliggör en mer förlängd extraktionsperiod av nematoder från växter. Mixercentrifufustens flotationsmetod återvinner långsamma, inaktiva eller uppåtkrypande nematoder genom att separera dem med deras specifika gravitation, Oostenbrink elutriator applicerar en underström på separat sediment från suspenderade nematoder, och Cobbs metod använder en serie siktar för att isolera nematoder efter deras storlek, form och sedimenteringshastighet14. För att samla rabditider producerar Baermann-tratten effektivt rena prover snabbt och med minimal ansträngning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R35GM141906 och R21ES031364 och Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |