हम कैंसर यूरोथेलियल कोशिकाओं से उत्पन्न बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) के अलगाव और फ्रीज-फ्रैक्चरिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक ने ईवी के व्यास और आकार का खुलासा किया और एक अनूठी विशेषता के रूप में- ईवी झिल्ली के आंतरिक संगठन। ये समझने में बहुत महत्वपूर्ण हैं कि ईवी प्राप्तकर्ता झिल्ली के साथ कैसे बातचीत करते हैं।
बाह्य पुटिकाएं (ईवीएस) कोशिकाओं से बाह्य अंतरिक्ष में जारी झिल्ली-सीमित संरचनाएं हैं और अंतरकोशिकीय संचार में फंसी हुई हैं। ईवीएस में पुटिकाओं की तीन आबादी होती है, अर्थात् माइक्रोवेसिकल्स (एमवी), एक्सोसोम और एपोप्टोटिक निकाय। ईवीएस की सीमित झिल्ली महत्वपूर्ण रूप से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के साथ बातचीत में शामिल होती है, जिससे प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में जैविक रूप से सक्रिय अणुओं का हस्तांतरण हो सकता है और परिणामस्वरूप, उनके व्यवहार को प्रभावित किया जा सकता है। फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग जैविक झिल्ली के आंतरिक संगठन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यहां, हम सुसंस्कृत कैंसर यूरोथेलियल कोशिकाओं से एमवी अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और तेजी से ठंड, फ्रैक्चरिंग, प्रतिकृतियां बनाने और साफ करने और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ उनका विश्लेषण करने के चरणों में एमवी के फ्रीज-फ्रैक्चर। परिणाम बताते हैं कि अलगाव के लिए प्रोटोकॉल ईवीएस की एक समरूप आबादी पैदा करता है, जो एमवी के आकार और आकार के अनुरूप होता है इंट्रामेम्ब्रेन कण मुख्य रूप से सीमित झिल्ली के प्रोटोप्लाज्मिक चेहरे में पाए जाते हैं। इसलिए, फ्रीज-फ्रैक्चर एमवी के व्यास, आकार और झिल्ली प्रोटीन के वितरण को चिह्नित करने के लिए पसंद की तकनीक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल ईवीएस की अन्य आबादी पर लागू होता है।
बाह्य पुटिकाएं (ईवीएस) कोशिकाओं से बाह्य अंतरिक्ष में जारी झिल्ली-सीमित पुटिकाएं हैं। ईवीएस की तीन मुख्य आबादी एक्सोसोम, माइक्रोवेसिकल्स (एमवी), और एपोप्टोटिक निकाय हैं, जो उनकी उत्पत्ति, आकार और आणविक संरचना 1,2,3 में भिन्न हैं। ईवीएस की संरचना दाता कोशिका की आणविक प्रोफ़ाइल और इसकी शारीरिक स्थिति (यानी, स्वस्थ या रोगग्रस्त) 4,5 को दर्शाती है। यह मानव रोगों के निदान, रोग का निदान और चिकित्सा में ईवीएस को अपार क्षमता देता है, और उनके पास व्यक्तिगत चिकित्सा 6,7,8 में उपयोग के लिए आशाजनक चिकित्सा अनुप्रयोग हैं।
ईवीएस अंतरकोशिकीय संचार के मध्यस्थ हैं। उनमें जैविक रूप से सक्रिय प्रोटीन, लिपिड और आरएनए होते हैं, जो प्राप्तकर्ता कोशिका में जैविक प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप करते हैं और इसके व्यवहार 9,10 को बदल सकते हैं। हालांकि, प्राप्तकर्ता कोशिका झिल्ली के साथ बातचीत के लिए ईवी सीमित झिल्ली की संरचना महत्वपूर्ण है।
ईवीएस के स्रोत शरीर के तरल पदार्थ और वातानुकूलित संस्कृति मीडिया हैं। एक ईवी आबादी को अलग करने के लिए, एक उपयुक्त अलगाव तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन एमवी में समृद्ध एक अंश पैदा करता है, जबकि ≥100,000 × ग्राम के केन्द्रापसारक बल एक्सोसोम11,12 में समृद्ध एक अंश उत्पन्न करते हैं। ईवीएस के पृथक अंश को शुद्धता, आकार और आकार के संदर्भ में मान्य किया जाना चाहिए। उस उद्देश्य के लिए, इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स 2018 ने उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों के तीन वर्गों की सिफारिश की: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और प्रकाश माइक्रोस्कोपी-आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी13. इनमें से कोई भी तकनीक ईवी झिल्ली इंटीरियर के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकती है।
फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अपनी आंतरिक संरचनाओं को प्रकट करने के लिए जमे हुए नमूनों को तोड़ने की एक तकनीक है, विशेष रूप से झिल्ली इंटीरियर का दृश्य देना। नमूना तैयार करने के चरण (1) तेजी से ठंड, (2) फ्रैक्चरिंग, (3) प्रतिकृति बनाना, और (4) प्रतिकृति14 की सफाई करना है। चरण 1 में, नमूना (वैकल्पिक रूप से) रासायनिक रूप से तय किया जाता है, ग्लिसरॉल के साथ क्रायोप्रोटेक्टेड होता है, और तरल फ्रीऑन में जमे हुए होता है। चरण 2 में, जमे हुए नमूने को फ्रीज-फ्रैक्चर इकाई में फ्रैक्चर किया जाता है, जो झिल्ली बाइलेयर के इंटीरियर को उजागर करता है। चरण 3 में, उजागर खंडित चेहरों को प्रतिकृतियों का उत्पादन करने के लिए प्लैटिनम (पीटी) और कार्बन (सी) के साथ छाया हुआ है। चरण 4 में, कार्बनिक पदार्थ हटा दिया जाता है। प्रतिकृति का विश्लेषण ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) में किया जाता है। माइक्रोग्राफ की सटीक व्याख्या के लिए, किसी को अपने उचित अभिविन्यास14,15 के लिए दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए। संक्षेप में, माइक्रोग्राफ में छाया की दिशा माइक्रोग्राफ को उन्मुख करने के लिए एक संदर्भ है (यानी, पीटी शैडोइंग की दिशा निर्धारित करने के लिए) और परिणामस्वरूप, उत्तल और अवतल आकार (चित्रा 1) निर्धारित करने के लिए। झिल्ली बाइलेयर के खंडित चेहरे नामक दो आंतरिक दृश्यों को फ्रीज-फ्रैक्चरिंग द्वारा झिल्ली को विभाजित करने के परिणामस्वरूप देखा जा सकता है: प्रोटोप्लाज्मिक चेहरा (पी-फेस) और एक्सोप्लाज्मिक फेस (ई-फेस)। पी-फेस सेल प्रोटोप्लाज्म से सटे झिल्ली पत्रक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ई-फेस बाह्य अंतरिक्ष से सटे झिल्ली पत्रक का प्रतिनिधित्व करता है। इंटीग्रल झिल्ली प्रोटीन और उनके संघों को इंट्रामेम्ब्रेनकणों 14,15 के रूप में देखा जाता है।
यहां, लक्ष्य आकार, आकार और उनकी सीमित झिल्ली की संरचना के संदर्भ में एमवी को चिह्नित करने के लिए फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक को लागू करना है। यहां, हम मानव आक्रामक मूत्राशय के कैंसर यूरोथेलियल कोशिकाओं से उत्पन्न एमवी के अलगाव और फ्रीज-फ्रैक्चरिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
एमवी, या पृथक ईवीएस की किसी भी अन्य आबादी का लक्षण वर्णन, “ओमिक्स” अध्ययन या कार्यात्मक अध्ययन11,18 जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण शुरू करने से पहले शुरू करने के लिए प्रमुख महत्व का है। इसमें, मानव आक्रामक मूत्राशय के कैंसर यूरोथेलियल टी 24 कोशिकाओं से ईवीएस को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था, और फ्रीज-फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने प्रदर्शित किया कि पृथक अंश एमवी11,13 में समृद्ध था। एमवी का अलगाव सेल मलबे या ऑर्गेनेल से रहित था, जो एक सफल अलगाव और शुद्धिकरण प्रोटोकॉल की पुष्टि करता था।
रासायनिक निर्धारण और ठंड का संयोजन, जो प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण हैं, ने ईवीएस12 के गोलाकार आकार को बनाए रखा। हालांकि, फ्रीज-फ्रैक्चरिंग17 द्वारा ईवी व्यास का आकलन करते समय सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है। चूंकि फ्रैक्चर बेतरतीब ढंग से नमूने से गुजरता है, इसलिए एमवी झिल्ली को उनके भूमध्यरेखीय और गैर-भूमध्यरेखीय विमानों में विभाजित किया जाता है। फ्रीज-फ्रैक्चर और छायादार नमूनों की छवियों का विश्लेषण करने के लिए एक कठोर विधि प्रदान करने के लिए, हैलेट एट अल ने दिखाया कि औसत पुटिका व्यास छवि17 पर पुटिका व्यास के वास्तविक आकार का 4/π गुना है। इसके लिए लेखांकन, टी 24 कोशिकाओं से ईवीएस की गणना 304 एनएम के व्यास के लिए की गई थी, जो एमवी के सैद्धांतिक आकार वितरण सीमा 100-1000 एनएम19 में फिट बैठती है।
फ्रीज-फ्रैक्चरिंग नकारात्मक धुंधला पूरक हो सकता है, ईवीएस की कल्पना करने के लिए सबसे बड़े पैमाने पर इस्तेमाल की जाने वाली टीईएम तकनीक। नकारात्मक धुंधला होने से, नमूना आमतौर पर रासायनिक रूप से तय, सूखा और टीईएम ग्रिड से जुड़ा होता है, और यूरेनियल समाधान के विपरीत होता है। मीडिया का समर्थन किए बिना, ईवीएस ढह जाते हैं, जो उन्हें कप के आकार की उपस्थिति देता है। फ्रीज-फ्रैक्चरिंग द्वारा, हम दिखाते हैं कि एमवी गोले हैं, जो बाह्य रिक्त स्थान और शरीर के तरल पदार्थ12 में उनके आकार को दर्शाता है। इसके द्वारा, हमारे परिणाम क्रायो-अल्ट्राथिन धारा20 में ईवीएस की टिप्पणियों के साथ समझौते में भी हैं।
फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक का एक महत्वपूर्ण लाभ सीमित झिल्ली के आंतरिक संगठन को हल करने की शक्ति है, जो यह समझने में एक महत्वपूर्ण कारक है कि ईवीएस को प्राप्तकर्ता झिल्ली के साथ कैसे लक्षित और बातचीत की जाती है। यहां, हमने एमवी की झिल्ली का विश्लेषण किया, फिर भी फ्रीज-फ्रैक्चरिंग ईवीएस की किसी भी अन्य आबादी के झिल्ली संगठन को प्रकट कर सकता है। एमवी प्लाज्मा झिल्ली नवोदित द्वारा बनते हैं; इसलिए, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन और प्रोटीन क्लस्टर एमवी झिल्ली में पाए जाने की उम्मीद है। हमारे परिणामों ने समर्थन किया कि टी 24 कोशिकाओं के एमवी में इंट्रामेम्ब्रेन कण होते हैं, जो अभिन्न झिल्ली प्रोटीन पेश करते हैं। ई-फेस और पी-फेस के बीच कण वितरण के आधार पर, यह उम्मीद करना उचित है कि एमवी में देखे गए कण ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन यूरोप्लाकिन्स हैं, जो यूरोथेलियल सेल विशिष्ट 21,24 हैं। मनाया कण विरल थे, जो पिछले अध्ययनों के अनुसार यूरोथेलियल कार्सिनोजेनेसिस21,22,23 के दौरान यूरोप्लाकिन्स में कमी की सूचना देता है। हालांकि, एमवी झिल्ली की प्रोटीन संरचना की आगे की जांच करने के लिए, फ्रीज-फ्रैक्चर प्रतिकृति प्रतिरक्षा-लेबलिंग (एफआरआईएल) तकनीक के उपयोग की सिफारिश की जाती है। एफआरआईएल प्रस्तुत फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक का एक उन्नयन है और एंटीबॉडी मान्यता24,25 द्वारा प्रतिकृतियों में प्रोटीन की पहचान का खुलासा करने के लिए समर्पित है। संक्षेप में, फ्रीज-फ्रैक्चर तकनीक एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो ईवी सीमित झिल्ली के लक्षण वर्णन के साथ-साथ पृथक ईवी अंशों के आकार, आकार और शुद्धता के लिए उपयुक्त है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग पृथक ईवी की अन्य आबादी के मूल्यांकन के लिए भी किया जा सकता है; इसलिए, फ्रीज-फ्रैक्चरिंग तकनीक ईवी सीमित झिल्ली के संगठन की खोज करने वाले अध्ययनों के लिए इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स दिशानिर्देशों में शामिल होने के योग्य है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी द्वारा वित्त पोषित किया गया था (अनुसंधान कोर फंडिंग सं। पी 3-0108 और परियोजना जे 7-2594) और एमआरआईसी उल आईपी -0510 इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम। यह काम कॉस्ट एक्शन सीए 17116 इंटरनेशनल नेटवर्क फॉर ट्रांसलेटिंग रिसर्च ऑन पेरिनेटल डेरिवेटिव्स को चिकित्सीय दृष्टिकोण (स्प्रिंट) में अनुवाद करने के लिए योगदान देता है, जो लागत (विज्ञान और प्रौद्योगिकी में यूरोपीय सहयोग) द्वारा समर्थित है। लेखक लिंडा स्ट्रस, संजा अबराजा, नाडा पावलिका डुबारिक और सबीना जेलेज़निक को सेल संवर्धन और नमूने तैयार करने में तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं और मार्को वोग्रिंक, ओटा सिर्का रोस और नेजक डेबेवेक वीडियो तैयार करने में तकनीकी सहायता के लिए।
A-DMEM | ThermoFisher Scientific, USA | 12491015 | |
Balzers freeze-fracture device | Balzers AG, Liechtenstein | Balzers BAF 200 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | model 5810R | |
CO2 incubator HeraCell | Heraues, Germany | ||
Copper carriers | Balzers | BB 113 142-2 | 100+ mesh |
Copper grids | SPI, United States | 2010C | |
Culture flask T75 | TPP, Switzerland | growing surface 75 cm2 | |
F12 (HAM) | Sigma-Aldrich, Germany | 21765029 | |
FBS | Gibco, Life Technologies, USA | 10500064 | |
Glazed Porcelain Plate 6 Well | Fischer Sientific, United States | 50-949-072 | |
Glycerol | Kemika, Croatia | 711901 | final concentration 30 % (v/v) |
Glutaradehyde | Serva, Germany | 23114.01 | final concentration 2.5 % (v/v) |
GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 35050-079 | final concentration 4 mM |
Penicillin | Gibco, Life Technologies | 15140163 | final concentration 100 U/ml |
Phase-contast inverted microscope | Nikon, Japan | model Eclipse | |
Rotor | Eppendorf, Germany | A 4-44 | |
Rotor | Eppendorf, Germany | F-34-6-38 | |
Serological pipetts | TPP, Switzerland | 50mL volume | |
Sodium hypochloride solution in water | Carlo Erba, Italy | 481181 | |
Stereomicroscope | Leica, Germany | ||
Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 35050038 | final concentration 100 mg/mL |
Transmission electron microscope | Philips, The Netherlands | model CM100 | working at 80 kV |
Tweezers | SPI, United States |