प्रोटोकॉल म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग प्रयोगों के लिए डाइमिथाइल सल्फेट के साथ आरएनए को संशोधित करने के लिए निर्देश प्रदान करता है। इसमें दो वैकल्पिक पुस्तकालय तैयारी विधियों के साथ इन विट्रो और विवो जांच शामिल है।
वस्तुतः किसी भी जैविक प्रक्रिया में आरएनए संरचना की भूमिका तेजी से स्पष्ट हो गई है, खासकर पिछले दशक में। हालांकि, आरएनए संरचना को हल करने के लिए शास्त्रीय दृष्टिकोण, जैसे कि आरएनए क्रिस्टलोग्राफी या क्रायो-ईएम, तेजी से विकसित क्षेत्र और उच्च-थ्रूपुट समाधान की आवश्यकता के साथ रहने में विफल रहे हैं। डाइमिथाइल सल्फेट (डीएमएस) एमएपीसेक का उपयोग करके अनुक्रमण के साथ म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग डीएमएस के साथ आधार की प्रतिक्रिया से आरएनए संरचना का अनुमान लगाने के लिए एक अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण है। डीएमएस एडेनोसिन में एन 1 नाइट्रोजन और साइटोसिन में एन 3 को उनके वाटसन-क्रिक चेहरे पर मिथाइलेट करता है जब आधार अप्रकाशित होता है। थर्मोस्टेबल समूह II इंट्रॉन रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (टीजीआईआरटी-III) के साथ संशोधित आरएनए को रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट करने से मिथाइलेटेड बेस को सीडीएनए में उत्परिवर्तन के रूप में शामिल किया जाता है। परिणामी सीडीएनए को अनुक्रमित करते समय और इसे संदर्भ प्रतिलेख में वापस मैप करते समय, प्रत्येक आधार के लिए सापेक्ष उत्परिवर्तन दर आधार की “स्थिति” को युग्मित या अप्रकाशित के रूप में इंगित करती है। भले ही डीएमएस प्रतिक्रियाओं में विट्रो और कोशिकाओं दोनों में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है, यह विधि हैंडलिंग प्रक्रियाओं में पूर्वाग्रह के प्रति संवेदनशील है। इस पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, यह पेपर कोशिकाओं में डीएमएस के साथ और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड आरएनए के साथ आरएनए उपचार के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
इस खोज के बाद से कि आरएनए में संरचनात्मक 1,2 और उत्प्रेरक3 गुण दोनों हैं, जैविक प्रक्रियाओं की अधिकता में आरएनए और इसके नियामक कार्य के महत्व को धीरे-धीरे उजागर किया गया है। दरअसल, जीन विनियमन पर आरएनए संरचना के प्रभाव ने बढ़ते ध्यान को प्राप्तकिया है। प्रोटीन की तरह, आरएनए में प्राथमिक, द्वितीयक और तृतीयक संरचनाएं होती हैं, जो क्रमशः न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम, बेस-पेयरिंग इंटरैक्शन के 2 डी मैपिंग और इन बेस-युग्मित संरचनाओं के 3 डी फोल्डिंग का उल्लेख करती हैं। जबकि तृतीयक संरचना का निर्धारण आरएनए-निर्भर प्रक्रियाओं के पीछे सटीक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, द्वितीयक संरचना आरएनए फ़ंक्शन के बारे में भी अत्यधिक जानकारीपूर्ण है और आगे 3 डी फोल्डिंग5 का आधार है।
हालांकि, आरएनए संरचना का निर्धारण पारंपरिक दृष्टिकोणों के साथ आंतरिक रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। जबकि प्रोटीन के लिए, क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), और क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) ने संरचनात्मक रूपांकनों की विविधता को निर्धारित करना संभव बना दिया है,अकेले अनुक्रम 6 से संरचना की भविष्यवाणी की अनुमति देता है, ये दृष्टिकोण आरएनए पर व्यापक रूप से लागू नहीं होते हैं। दरअसल, आरएनए बिल्डिंग ब्लॉक (न्यूक्लियोटाइड) के साथ लचीले अणु होते हैं जिनके पास अपने अमीनो एसिड समकक्षों की तुलना में बहुत अधिक संवहन और घूर्णी स्वतंत्रता होती है। इसके अलावा, बेस-पेयरिंग के माध्यम से बातचीत अमीनो एसिड अवशेषों की तुलना में अधिक गतिशील और बहुमुखी है। नतीजतन, शास्त्रीय दृष्टिकोण केवल अच्छी तरह से परिभाषित, अत्यधिक कॉम्पैक्ट संरचनाओं के साथ अपेक्षाकृत छोटे आरएनए के लिए सफल रहेहैं।
आरएनए संरचना को निर्धारित करने का एक और तरीका अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के साथ संयुक्त रासायनिक जांच के माध्यम से है। यह रणनीति एक आरएनए अनुक्रम (यानी, इसकी द्वितीयक संरचना) में प्रत्येक आधार की बाध्यकारी स्थिति के बारे में जानकारी उत्पन्न करती है। संक्षेप में, एक आरएनए अणु में आधार जो बेस-पेयरिंग में संलग्न नहीं हैं, उन्हें छोटे रासायनिक यौगिकों द्वारा अलग-अलग संशोधित किया जाता है। विशेष रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (आरटी) के साथ इन आरएनए को रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट करने से उत्परिवर्तन के रूप में पूरक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (सीडीएनए) में संशोधन शामिल होते हैं। इन सीडीएनए अणुओं को पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा प्रवर्धित किया जाता है और अनुक्रमित किया जाता है। बाध्य या अनबाउंड के रूप में उनकी “स्थिति” के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, रुचि के आरएनए में प्रत्येक आधार पर उत्परिवर्तन आवृत्तियों की गणना की जाती है और बाधाओं के रूप में संरचना पूर्वानुमान सॉफ्टवेयर में दर्जकिया जाता है। निकटतम पड़ोसी नियम9 और न्यूनतम मुक्त ऊर्जा गणना10 के आधार पर, यह सॉफ्टवेयर संरचना मॉडल उत्पन्न करता है जो प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा11,12 को सबसे अच्छा फिट करता है।
डीएमएस-मासेक डीएमएस का उपयोग करता है, जो एडेनोसिन में एन 1 नाइट्रोजन और साइटोसिन में एन 3 नाइट्रोजन कोउनके वाटसन-क्रिक चेहरे पर अत्यधिक विशिष्ट तरीके से मिथाइलेट करता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में थर्मोस्टेबल ग्रुप II इंट्रॉन रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (टीजीआईआरटी-III) का उपयोग अभूतपूर्व सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ म्यूटेशनल प्रोफाइल बनाता है, यहां तक कि दो या दो से अधिक वैकल्पिक अनुरूपता14,15 द्वारा उत्पन्न ओवरलैपिंग प्रोफाइल के डीकन्वोल्यूशन की अनुमति देता है। इसके अलावा, डीएमएस कोशिका झिल्ली और पूरे ऊतकों में प्रवेश कर सकता है, जिससे शारीरिक संदर्भों के भीतर जांच संभव हो जाती है। हालांकि, अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा की पीढ़ी चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि हैंडलिंग प्रक्रिया में भिन्नता परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, हम पूर्वाग्रह को कम करने और नए लोगों को उन कठिनाइयों के माध्यम से विधि के लिए मार्गदर्शन करने के लिए इन विट्रो और इन-सेल डीएमएस-एमएपीसेक दोनों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से हाल ही में सार्स-सीओवी 2 महामारी के प्रकाश में, आरएनए वायरस पर उच्च गुणवत्ता वाला डेटा जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने और संभावित चिकित्सीय खोजने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
यहां प्रोटोकॉल बताता है कि डीएमएस म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग प्रयोगों का उपयोग करके विट्रो और कोशिकाओं में आरएनए की जांच कैसे करें। इसके अलावा, यह जीन-विशिष्ट डेटा उत्पन्न करने और प्राप्त .fastq फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए इलुमिना अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को तैयार करने के निर्देश देता है। इसके अतिरिक्त, जीनोम-वाइड लाइब्रेरी दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, जीन-विशिष्ट आरटी-पीसीआर उच्चतम गुणवत्ता और सबसे मजबूत डेटा का उत्पादन करता है। इसलिए, यदि नमूनों के बीच तुलना की जाती है, तो यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि वे समान अनुक्रमण रणनीतियों के साथ तैयार हैं, क्योंकि पुस्तकालय पीढ़ी कुछ पूर्वाग्रह का कारण बनती है। प्रजनन क्षमता को हमेशा प्रतिकृति का उपयोग करके मापा जाना चाहिए।
कई सावधानियां
आरएनए एक अस्थिर अणु है जो ऊंचे तापमान और आरएनएस दोनों के माध्यम से गिरावट के प्रति संवेदनशील है। इसलिए, विशेष उपायों – व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई), आरएनएस-मुक्त सामग्री और आरएनएस अवरोधकों का उपयोग – की सिफारिश की जाती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, आरएनए को जब भी संभव हो बर्फ पर रखा जाना चाहिए। यह विशेष रूप से मिथाइलेटेड आरएनए पर लागू होता है, जो उच्च तापमान के प्रति और भी अधिक संवेदनशील है।
यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि ब्याज की आरएनए संरचना डीएमएस एकाग्रता और बफर स्थितियों के प्रति संवेदनशील नहीं है। पीएच 7-7.5 पर 100 एमएम ट्राइस, 100 एमएम एमओपीएस और 100 एमएम एचईपीईएस जैसे बफर एक उच्च संकेत देते हैं लेकिन प्रतिक्रिया21 के दौरान पीएच को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकते हैं। जैसा कि डीएमएस पानी में हाइड्रोलाइज करता है, जो पीएच को कम करता है, संशोधन प्रतिक्रिया के दौरान तटस्थ पीएच बनाए रखने के लिए एक मजबूत बफर महत्वपूर्ण है। बाइसीन के अतिरिक्त पीएच को थोड़ा बुनियादी 21 के रूप में बनाए रखने में मदद करने के लिए दिखाया गया है, लेकिनइसके परिणामस्वरूप जीएस और यूएस पर कम डीएमएस संशोधन होता है, जो सूचनात्मक हो सकता है लेकिन एएस और सीएस की तुलना में बहुत कम सिग्नल के उत्पादन के कारण अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए और इस प्रोटोकॉल में आगे चर्चा नहीं की गई है।
जीन-विशिष्ट आरटी-पीसीआर में, संशोधित आरएनए को डीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट किया जाता है और पीसीआर द्वारा टुकड़ों में प्रवर्धित किया जाता है। जबकि आरएनए का आकार सैद्धांतिक रूप से असीमित हो सकता है, इन पीसीआर टुकड़ों को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के दौरान पूर्वाग्रह को रोकने के लिए 400-500 बेस जोड़े (बीपी) की लंबाई से अधिक नहीं होना चाहिए। आदर्श रूप से, टुकड़े अनुक्रमण रन के दायरे में होने चाहिए (यानी, यदि अनुक्रमण 150 x 150 चक्र युग्मित-अंत अनुक्रमण कार्यक्रम का उपयोग करके आयोजित किया जाता है, तो एक एकल टुकड़ा 300 बीपी से अधिक नहीं होना चाहिए)। कम चक्रों के साथ अनुक्रमण कार्यक्रमों का उपयोग करते समय, पीसीआर उत्पादों को डीएसडीनेस का उपयोग करके खंडित किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि प्राइमर अनुक्रमों के भीतर अनुक्रम कोई संरचनात्मक जानकारी नहीं रखते हैं, इसलिए जब जांच किए गए आरएनए में >1 टुकड़ा होता है तो टुकड़े ओवरलैप होना चाहिए। आरटी प्रतिक्रियाओं में विभिन्न टुकड़ों (10 अलग-अलग आरटी प्राइमरों तक) के लिए कई आरटी प्राइमर हो सकते हैं। अनुक्रमों के आधार पर, आरटी प्राइमरों को पूल करना रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को कम कुशल बना सकता है लेकिन आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया अलग से आयोजित की जानी चाहिए।
डीएमएस के साथ आरएनए की जांच करते समय, प्रयोगात्मक स्थितियां एक अतिरिक्त भूमिका निभाती हैं, क्योंकि कई आरएनए थर्मोडायनामिक रूप से अस्थिर होते हैं और तापमान जैसे पर्यावरणीय कारकों के आधार पर अपनी रचना को बदलते हैं। अनियमितताओं से बचने के लिए, प्रयोगात्मक स्थितियों को यथासंभव स्थिर रखा जाना चाहिए, प्रतिक्रिया समय के संबंध में भी। बफर स्थितियां 17,20,22,23 की एक निश्चित डिग्री तक विनिमेय प्रतीत होती हैं जब बुनियादी स्थितियों को बनाए रखा जाता है – बफरिंग क्षमता और मोनोवेलेंट (एनए) और डाइवेलेंट आयनों (एमजी) की उपस्थिति – आरएनए24 की उचित तह सुनिश्चित करने के लिए।
संशोधित आरएनए की पुस्तकालय तैयारी के संबंध में, कई पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, संशोधित आरएनए अपने असंशोधित समकक्षों की तुलना में कम स्थिर हैं, जिसका अर्थ है कि उन्हें इष्टतम टुकड़ा आकार वितरण के लिए विखंडन समय के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, कुछ आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट, साथ ही कई अन्य आरएनएसेक दृष्टिकोण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट में यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करते हैं। इससे संदर्भ का कम कवरेज हो सकता है, विशेष रूप से जीन के 3 ‘ में, और, अंततः, अपर्याप्त कवरेज गहराई तक। यदि किसी निश्चित क्षेत्र का कवरेज बहुत कम है, तो संरचना की भविष्यवाणी से उन आधारों को हटाना आवश्यक हो सकता है। आरटी-पीसीआर और पूरे जीनोम आरएनएसेक किट के अलावा, अन्य पुस्तकालय तैयारी दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल जिसमें आरएनए के लिए 3 ‘ और / या 5 ‘ एडाप्टर का बंधाव शामिल है, आरएनए के छोटे टुकड़ों का उपयोग करते समय फायदेमंद होते हैं या जब प्राइमर क्षेत्रों में जांच जानकारी के नुकसान से बचा जाना चाहिए।
अंत में, रासायनिक जांच प्रयोगों के विश्लेषण को हमेशा सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए। वर्तमान में, ऐसा कोई सॉफ्टवेयर नहीं है जो उच्च सटीकता के साथ अकेले अनुक्रम से किसी भी आरएनए की आरएनए संरचना की भविष्यवाणी करता है। यद्यपि रासायनिक जांच बाधाएं सटीकता में काफी सुधार करती हैं, लंबे आरएनए (>500 एनटी) के लिए अच्छे मॉडल उत्पन्न करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है। इन मॉडलों को अन्य दृष्टिकोणों और / या म्यूटेनेसिस द्वारा आगे परीक्षण किया जाना चाहिए। आरएनए पूर्वानुमान सॉफ्टवेयर बेस जोड़े की अधिकतम संख्या के लिए अनुकूलन करता है, इस प्रकार खुले अनुरूपण को काफी दंडित करता है, जो आरएनए फोल्डिंग5 का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इस प्रकार, प्राप्त संरचना मॉडल का परीक्षण अंतर्निहित रासायनिक जांच डेटा (जैसे, AUROC द्वारा) और प्रतिकृतियों (जैसे, एमएफएमआई द्वारा) के साथ भविष्यवाणी समझौते को निर्धारित करके किया जाना चाहिए, जैसा कि लैन एट अल.20 द्वारा उदाहरण दिया गया है।
आदर्श रूप से, प्राप्त संरचना मॉडल को चुनौती देने के लिए विभिन्न प्रणालियों में कई प्रयोगों का उपयोग किसी की परिकल्पना को मजबूत करने के लिए किया जाना चाहिए। इनमें इन विट्रो और इन-सेल दृष्टिकोण, प्रतिपूरक उत्परिवर्तन और विभिन्न सेल लाइनों और प्रजातियों का उपयोग शामिल हो सकता है। इसके अलावा, कच्ची प्रतिक्रियाएं अक्सर संरचना की भविष्यवाणियों की तुलना में अधिक या अधिक जानकारीपूर्ण होती हैं, क्योंकि वे आरएनए फोल्डिंग पहनावा के “जमीनी सच्चाई” स्नैपशॉट को रिकॉर्ड करते हैं। जैसे, विभिन्न स्थितियों के बीच संरचना परिवर्तनों की तुलना करने के लिए कच्ची प्रतिक्रियाएं बहुत उपयुक्त और सूचनात्मक हैं। महत्वपूर्ण रूप से, कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणी के साथ रासायनिक जांच बाधाओं का उपयोग करके गणना की गई सबसे कम मुक्त ऊर्जा संरचनाओं का उपयोग केवल एक पूर्ण संरचना मॉडल की ओर एक प्रारंभिक परिकल्पना के रूप में किया जाना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
कोई नहीं
1 Kb Plus DNA Ladder | 10787018 | Thermo | |
2-mercaptoethanol | M6250-250ML | Sigma | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 | AM9720 | Thermo | |
Advantage PCR | 639206 | Takara | |
CloneAmp HiFi PCR Premix | 639298 | Takara | |
DMS | D186309 |
Sigma | |
dNTPs 10 mM each | U151B | Promega | |
E-Gel EX Agarose Gels, 2% | G402022 | Thermo | precast agarose gels |
Ethanol (200 proof) | E7023-4X4L | Sigma | |
Falcon tubes, 15 mL, 50 mL | |||
GlycoBlue | co-precipitant | ||
HCT-8 cells | ATCC #CCL-244 | ||
Invitrogen MgCl2 (1 M) | AM9530G | fisherscientific | |
Isopropanol | 278475 | Sigma | |
Megascript T7 transcription | AM1334 | Thermo | |
NanoDrop spectrophotometer | |||
Novex TBE Gels, 8%, 10 well | EC6215BOX | Thermo | |
OC43 | ATCC #VR-1558 | ||
RiboRuler Low Range RNA Ladder | SM1831 | Thermo | |
RNAse H | M0297L | NEB | |
Sodium Cacodylate, 0.4 M, pH 7.2 | 102090-964 | VWR | |
Sodium hydroxide solution | S8263-150ML | Sigma | |
SuperScript II Reverse Transcriptase for FSB and DTT | 18064014 | Thermo | |
TGIRT-III Enzyme | TGIRT50 | Ingex | |
The Oligo Clean & Concentrator | D4060 | Genesee | |
The RNA Clean & Concentrator kits are RNA clean up kits | R1016 | Genesee | |
TRIzol Reagents | 15596018 | Thermo | RNA isolation reagent |
Water, (For RNA Work) (DEPC-Treated, DNASE, RNASE free/Mol. Biol.) | BP561-1 | fisherscientific | |
xGen Broad-range RNA Library Prep 16rxn | 10009865 | IDT | |
Zymo RNA clean and concentrator columns |