Summary

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin vivoで高解像度のサブコンパートメントカルシウムイメージングのための非レシオメトリックアプローチを説明しています

Abstract

カルシウム(Ca2+)イメージングは、主に神経活動を調べるために使用されてきましたが、細胞内Ca2+の取り扱いが細胞内シグナル伝達の重要な要素であることがますます明らかになっています。ニューロンを本来の無傷の回路で研究できるin vivoでの細胞内Ca2+ダイナミクスの視覚化は、複雑な神経系では技術的に困難であることが証明されています。線虫Caenorhabditis elegansの透明性と比較的単純な神経系は、蛍光タグとインジケーターの細胞特異的発現とin vivo視覚化を可能にします。これらの中には、細胞質ならびにミトコンドリアなどの様々な細胞内区画で使用するために改変された蛍光指示薬がある。このプロトコルは、個々の樹状突起スパインおよびミトコンドリアのレベルまでのCa2+動態の分析を可能にする細胞内分解能でin vivoでの非レシオメトリックCa2+イメージングを可能にします。ここでは、異なるCa2+親和性を有する2つの利用可能な遺伝的にコードされた指標を使用して、単一の興奮性介在ニューロン(AVA)の細胞質またはミトコンドリアマトリックス内の相対的なCa2+レベルを測定するためのこのプロトコルの使用を実証する。C. elegansで可能な遺伝子操作と縦断的観察とともに、このイメージングプロトコルは、Ca 2+の取り扱いがニューロン機能と可塑性をどのように調節するかに関する質問に答えるのに役立つ可能性があります。

Introduction

カルシウムイオン(Ca2+)は、多くの細胞型において非常に汎用性の高い情報担体です。ニューロンにおいて、Ca2+は、神経伝達物質の活動依存的放出、細胞骨格運動性の調節、代謝過程の微調整、ならびに適切なニューロンの維持および機能に必要な他の多くのメカニズムに関与している1,2。効果的な細胞内シグナル伝達を確実にするために、ニューロンは細胞質3において低い基底Ca2+レベルを維持しなければならない。これは、小胞体(ER)やミトコンドリアなどの細胞小器官へのCa2+の取り込みを含む、協調的なCa2+処理メカニズムによって達成されます。これらのプロセスは、原形質膜におけるCa2+透過性イオンチャネルの配置に加えて、ニューロン全体にわたって不均一なレベルの細胞質Ca2+をもたらす。

安静時およびニューロン活性化中のCa2+不均一性は、Ca2+依存性メカニズムの多様で場所特異的な調節を可能にします1Ca2+の濃度特異的効果の一例は、イノシトール1,4,5-三リン酸(InsP3)受容体を介したERからのCa2+の放出である。InsP3と組み合わせた低Ca2+レベルは、受容体のカルシウム透過性細孔の開口に必要とされる。あるいは、高いCa2+レベルは、受容体4を直接的および間接的に阻害する。適切な神経機能のためのCa2+恒常性の重要性は、細胞内Ca2+の取り扱いおよびシグナル伝達の破壊が神経変性障害および自然老化の病因の初期段階であることを示唆する証拠によって裏付けられている5,6。具体的には、ERおよびミトコンドリアによる異常なCa2+の取り込みおよび放出は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病における神経機能障害の発症に関連している6,7

自然老化または神経変性中のCa2+異相変の研究には、天然の細胞構造(すなわち、シナプスの配置およびイオンチャネルの分布)が維持されている生きている無傷の生物における細胞内分解能でのCa2+レベルの縦断的観察が必要である。この目的のために、このプロトコルは、高い空間的および時間的分解能でin vivoでCa2+ダイナミクスを記録するために、容易に入手可能遺伝的にコード化された2つのCa2+センサーの使用に関するガイダンスを提供します。C. elegansに記載の方法を用いて得られた代表的な結果は、単一ニューロンの細胞質またはミトコンドリアマトリックスにおけるCa2+指示薬の発現が、単一のスパイン様構造および個々のミトコンドリア内のCa2+レベルを識別する追加能力を有するCa2+動態を示す蛍光画像(最大50Hz)の迅速な取得をどのように可能にするかを示している。

Protocol

1. トランスジェニック株の作製 選択したクローニング法8,9を用いて、Pflp-18またはPrig-3プロモーター(腹側神経索におけるAVA特異的シグナル用)を含む発現ベクターをクローニングし、続いて選択したCa2+指標、次いで3′ UTR(詳細についてはディスカッションを参照)10を含む。プラスミドとその…

Representative Results

これら2つのプロトコルにより、in vivoで個々の神経突起の細胞内領域および細胞小器官内の異なるCa2+レベルを高い空間分解能で迅速に取得できます。最初のプロトコルは、高い時間的および空間的分解能で細胞質Ca2+の測定を可能にします。これは、神経突起が腹側神経索の全長を走るグルタミン酸作動性AVAコマンド介在ニューロン15におけるGCaMP6fの?…

Discussion

記載された方法を実施する際の最初の考慮事項は、所与の研究課題に対して理想的な特性を有するCa2+指標の選択を含む。細胞質Ca2+指示薬は典型的にはCa2+に対して高い親和性を有し、Ca2+に対するこれらの指示薬の感受性は動態(オン/オフ率)に反比例する16,17。これは、Ca2+感度または動力学のいずれかを関心…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01-NS115947がF. Hoerndliに授与)によってサポートされました。また、pAS1プラスミドを提供してくれたAttila Stetak博士にも感謝します。

Materials

100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer’s disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner’s guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  20. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  21. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  22. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  23. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  24. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  25. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  26. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  27. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  28. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  29. O’Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  30. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  31. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  32. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  33. Cho, J. -. H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  34. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  35. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  36. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  37. Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  38. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  39. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Play Video

Cite This Article
Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

View Video