Summary

Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Современные методы описывают нератиометрический подход к субкомпартментной визуализации кальция с высоким разрешением in vivo у Caenorhabditis elegans с использованием легкодоступных генетически кодируемых индикаторов кальция.

Abstract

Визуализация кальция (Ca2+) в основном используется для изучения активности нейронов, но становится все более очевидным, что субклеточная обработка Ca2+ является важнейшим компонентом внутриклеточной передачи сигналов. Визуализация субклеточной динамики Ca2+ in vivo, где нейроны могут быть изучены в их нативной, интактной схеме, оказалась технически сложной в сложных нервных системах. Прозрачность и относительно простая нервная система нематоды Caenorhabditis elegans обеспечивают клеточно-специфическую экспрессию и визуализацию in vivo флуоресцентных меток и индикаторов. Среди них флуоресцентные индикаторы, которые были модифицированы для использования в цитоплазме, а также в различных субклеточных компартментах, таких как митохондрии. Этот протокол позволяет проводить нератиометрическую визуализациюCa2 + in vivo с субклеточным разрешением, что позволяет анализировать динамику Ca2+ вплоть до уровня отдельных дендритных шипов и митохондрий. Здесь используются два доступных генетически кодируемых индикатора с разным сродством кCa2 +, чтобы продемонстрировать использование этого протокола для измерения относительных уровней Ca2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе в одной паре возбуждающих интернейронов (AVA). Вместе с генетическими манипуляциями и продольными наблюдениями, возможными у C. elegans, этот протокол визуализации может быть полезен для ответа на вопросы о том, как обработка Ca2+ регулирует функцию и пластичность нейронов.

Introduction

Ионы кальция (Ca2+) являются универсальными носителями информации во многих типах клеток. В нейронах Ca2+ отвечает за зависящее от активности высвобождение нейротрансмиттеров, регуляцию подвижности цитоскелета, тонкую настройку метаболических процессов, а также за многие другие механизмы, необходимые для правильного поддержания и функционирования нейронов 1,2. Чтобы обеспечить эффективную внутриклеточную передачу сигналов, нейроны должны поддерживать низкий базальный уровень Ca2+ в своей цитоплазме3. Это достигается совместными механизмами обработки Ca2+, включая поглощение Ca2+ органеллами, такими как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии. Эти процессы, в дополнение к расположению Ca 2+-проницаемых ионных каналов в плазматической мембране, приводят к гетерогенным уровням цитоплазматического Ca2+ по всему нейрону.

ГетерогенностьCa2+ во время покоя и активации нейронов обеспечивает разнообразную, специфическую для местоположения регуляцию Ca2+-зависимых механизмов1. Одним из примеров специфических для концентрации эффектов Ca 2+ является высвобождение Ca 2+ из ER через рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP 3). Низкие уровни Ca2+ в сочетании с InsP3 необходимы для открытия кальций-проницаемой поры рецептора. В качестве альтернативы, высокие уровни Ca2+ как прямо, так и косвенно ингибируют рецептор4. Важность гомеостаза Ca 2+ для правильной функции нейронов подтверждается данными, свидетельствующими о том, что нарушение внутриклеточной обработки и передачи сигналов Ca2+ является ранним шагом в патогенезе нейродегенеративных расстройств и естественного старения 5,6. В частности, аномальное поглощение и высвобождение Ca2+ скорой помощью и митохондриями связано с началом дисфункции нейронов при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона 6,7.

Изучение дисгомеостаза Са 2+ при естественном старении или нейродегенерации требует продольного наблюдения уровней Са2+ с субклеточным разрешением в живом, интактном организме, в котором поддерживается нативная клеточная архитектура (т. е. расположение синапсов и распределение ионных каналов). С этой целью этот протокол содержит рекомендации по использованию двух легкодоступных, генетически закодированных датчиков Ca 2+ для записи динамики Ca2+ in vivo с высоким пространственным и временным разрешением. Репрезентативные результаты, полученные с помощью описанного метода у C. elegans, демонстрируют, как экспрессия показателей Ca 2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе отдельных нейронов может позволить быстро получать флуоресцентные изображения (до 50 Гц), которые иллюстрируют динамику Ca 2+ с дополнительной способностью различать уровни Ca 2+ в отдельных позвоночных структурах и отдельных митохондриях.

Protocol

1. Создание трансгенных штаммов Используя метод клонированияпо выбору 8,9, клонируйте векторы экспрессии, чтобы они содержали промотор Pflp-18 или Prig-3 (для AVA-специфического сигнала в вентральном нервном мозге), затем индикатор выбора Ca2+</…

Representative Results

Эти два протокола позволяют быстро получать дифференциальные уровни Ca2+ в субклеточных областях и органеллах отдельных нейритов in vivo с высоким пространственным разрешением. Первый протокол позволяет измерять цитоплазматический Ca2+ с высоким временным и пространствен…

Discussion

Первое соображение при реализации описанного метода связано с выбором показателя Ca2+ с идеальными характеристиками для данного вопроса исследования. Цитоплазматические показатели Ca2+ обычно имеют высокое сродство к Ca2+, а чувствительность этих показателей кCa2+ обратн?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) (R01-NS115947 присуждена Ф. Хорндли). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Аттилу Стетака за плазмиду pAS1.

Materials

100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer’s disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner’s guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  20. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  21. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  22. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  23. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  24. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  25. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  26. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  27. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  28. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  29. O’Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  30. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  31. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  32. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  33. Cho, J. -. H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  34. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  35. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  36. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  37. Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  38. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  39. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Play Video

Cite This Article
Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

View Video