De nåværende metodene beskriver en ikke-ratiometrisk tilnærming for høyoppløselig, subkompartmental kalsiumavbildning in vivo i Caenorhabditis elegans ved bruk av lett tilgjengelige genetisk kodede kalsiumindikatorer.
Avbildning av kalsium (Ca 2+) har i stor grad blitt brukt til å undersøke nevronaktivitet, men det blir stadig tydeligere at subcellulær Ca2+-håndtering er en avgjørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen av subcellulær Ca2+ dynamikk in vivo, hvor nevroner kan studeres i deres innfødte, intakte kretser, har vist seg teknisk utfordrende i komplekse nervesystemer. Gjennomsiktigheten og det relativt enkle nervesystemet til nematoden Caenorhabditis elegans muliggjør cellespesifikt uttrykk og in vivo visualisering av fluorescerende koder og indikatorer. Blant disse er fluorescerende indikatorer som er modifisert for bruk i cytoplasma, samt forskjellige subcellulære rom, som mitokondriene. Denne protokollen muliggjør ikke-ratiometrisk Ca 2+-avbildning in vivo med en subcellulær oppløsning som tillater analyse av Ca2+-dynamikk ned til nivået av individuelle dendrittiske pigger og mitokondrier. Her brukes to tilgjengelige genetisk kodede indikatorer med forskjellige Ca 2+ affiniteter for å demonstrere bruken av denne protokollen for å måle relative Ca2+ nivåer i cytoplasma eller mitokondriematrisen i et enkelt par eksitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulasjonene og longitudinelle observasjonene som er mulige i C. elegans, kan denne bildeprotokollen være nyttig for å svare på spørsmål om hvordan Ca2+ -håndtering regulerer nevronfunksjon og plastisitet.
Kalsiumioner (Ca2+) er svært allsidige bærere av informasjon i mange celletyper. I nevroner er Ca2+ ansvarlig for aktivitetsavhengig frigjøring av nevrotransmittere, regulering av cytoskeletal motilitet, finjustering av metabolske prosesser, samt mange andre mekanismer som kreves for riktig nevronvedlikehold og funksjon 1,2. For å sikre effektiv intracellulær signalering må nevroner opprettholde lave basale Ca2+ nivåer i deres cytoplasma3. Dette oppnås ved kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, inkludert opptak av Ca2+ i organeller som endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse prosessene, i tillegg til arrangementet av Ca 2+-permeable ionekanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene nivåer av cytoplasmatisk Ca2+ gjennom nevronet.
Ca 2+ heterogenitet under hvile og nevronaktivering muliggjør mangfoldig, stedsspesifikk regulering av Ca2+-avhengige mekanismer1. Et eksempel på de konsentrasjonsspesifikke effektene av Ca 2 + er frigjøring av Ca2 + fra ER gjennom inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) reseptorer. Lave Ca2+ nivåer i kombinasjon med InsP3 er nødvendig for åpning av reseptorens kalsiumgjennomtrengelige pore. Alternativt hemmer høye Ca2+ nivåer både direkte og indirekte reseptoren4. Betydningen av Ca 2+ homeostase for riktig nevronfunksjon støttes av bevis som tyder på at forstyrret intracellulær Ca2+ håndtering og signalering er et tidlig skritt i patogenesen av nevrodegenerative lidelser og naturlig aldring 5,6. Spesielt er unormalt Ca2+ opptak og frigjøring av ER og mitokondrier knyttet til utbruddet av nevronal dysfunksjon i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntingtons sykdom 6,7.
Studien av Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller nevrodegenerasjon krever langsgående observasjon av Ca2+ nivåer med subcellulær oppløsning i en levende, intakt organisme der den opprinnelige cellulære arkitekturen (dvs. arrangementet av synapser og distribusjon av ionkanaler) opprettholdes. For dette formål gir denne protokollen veiledning om bruk av to lett tilgjengelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer for registrering av Ca2+ dynamikk in vivo med høy romlig og tidsmessig oppløsning. De representative resultatene som er oppnådd ved hjelp av den beskrevne metoden i C. elegans, demonstrerer hvordan ekspresjonen av Ca2+ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriell matrise av enkeltneuroner kan tillate rask oppkjøp av fluorescerende bilder (opptil 50 Hz) som illustrerer Ca 2 + dynamikken med den ekstra evnen til å skille Ca2 + nivåer innenfor enkelte ryggradslignende strukturer og individuelle mitokondrier.
Den første vurderingen ved implementering av metoden som er beskrevet, innebærer valg av en Ca2+ indikator med ideelle egenskaper for det gitte forskningsspørsmålet. Cytoplasmatiske Ca 2+-indikatorer har vanligvis høy affinitet for Ca 2+, og sensitiviteten til disse indikatorene til Ca 2+ er omvendt relatert til kinetikken (på/av-hastighet)16,17. Dette betyr at enten Ca2+ følsomhet eller kinetikk må p…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tildelt F. Hoerndli). Vi vil også takke Dr. Attila Stetak for pAS1-plasmidet.
100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
pBSKS | Stratagene | ||
pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |